Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Gewebetransplantationstechnik, die entwickelt wurde, um die Signal- und Musterbildungseigenschaften des basalen Vorderhirns während der kraniofazialen Entwicklung zu testen.
Abstract
Der Vogelembryo wird seit mehr als einem Jahrhundert als Modellsystem verwendet und hat zu einem grundlegenden Verständnis der Entwicklung von Wirbeltieren geführt. Eine der Stärken dieses Modellsystems besteht darin, dass die Wirkung und Interaktion zwischen Geweben direkt in chimären Embryonen beurteilt werden kann. Wir haben bereits gezeigt, dass Signale aus dem Vorderhirn zur Morphogenese des Gesichts beitragen, indem sie die Form der Expressionsdomäne von Sonic hedgehog (SHH) in der frontonasalen ektodermalen Zone (FEZ) regulieren. In diesem Artikel wird die Methode zur Erzeugung der Vorderhirnchimären beschrieben und die Ergebnisse dieser Experimente veranschaulicht.
Introduction
Ein Großteil der aktuellen Forschung in der Entwicklungsbiologie konzentriert sich auf die Rolle der Gene bei der Formung von Embryonen. Es gibt gute Werkzeuge, um Entwicklungsmechanismen aus genetischer Sicht zu untersuchen. Embryonen werden jedoch als Reaktion auf Gewebeinteraktionen zusammengesetzt und durchlaufen eine Morphogenese. Das Vogelsystem ist ein klassisches Instrument, um die Vielfalt der Gewebeinteraktionen zu beurteilen, die die Entwicklung regulieren, und zwar aus folgenden Gründen: Die Embryologie ist gut verstanden, die Embryonen sind leicht zugänglich, die Werkzeuge zur Analyse der Vogelsysteme sind gut entwickelt und die Embryonen sind kostengünstig.
Das Transplantationssystem von Vögeln wird seit fast einem Jahrhundert häufig zur Rückverfolgung von Abstammungslinien und zur Beurteilung von Gewebeinteraktionen während der Entwicklung eingesetzt 1,2,3,4. Dieses System wurde verwendet, um ein Signalzentrum, die frontonasale ektodermale Zone (FEZ), zu untersuchen, die die Morphogenese des Oberkiefers reguliert5, und es wurde ein Video veröffentlicht, das diese Technik zuvor beschriebenhat 6. Neben Wachtel-Küken wurden auch andere Arten verwendet, um Chimären für die Analyse von Gewebeinteraktionen zu erzeugen. Zum Beispiel wurde die Maus-FEZ vonWildtyp-7- und mutierten Mäusen8 transplantiert, und andere haben ein Enten-, Wachtel- und Kükensystem verwendet, um die Rolle der Neuralleiste bei der Strukturierung des Gesichtsskelettszu untersuchen 9,10,11,12.
In dieser Arbeit wurde die Rolle des Vorderhirns bei der Regulation des Genexpressionsmusters in der FEZ durch die reziproke Transplantation des ventralen Vorderhirns zwischen Wachtel-, Enten- und Kükenembryonen untersucht, da ein Signal aus dem Vorderhirn benötigt wird, um die Expression von Sonic hedgehog in der FEZ zu induzieren. Vorderhirntransplantationen sind kein Einzelfall auf diesem Gebiet. Diese Transplantate wurden verwendet, um die Entwicklung der Motilität in Wachtel- und Entenembryonenzu beurteilen 13, obwohl in diesen Experimenten auch Gewebe transplantiert wurden, die zu nicht-neuronalen Derivaten beitrugen. In anderen Arbeiten wurden Hörkreise bei Vögeln durch Vorderhirntransplantation untersucht14, aber diese Transplantate enthielten mutmaßliche Neuralleistenzellen, die zur Gesichtsformbeitragen 9,10 und an der Regulierung der SHH-Expression im FEZbeteiligt sind 15. Daher wurde ein System entwickelt, bei dem nur das ventrale Vorderhirn von einer Vogelart auf eine andere transplantiert wird, bevor das Neuralrohr verschlossen wird, um die Rolle des Gehirns bei der Gesichtsformzu beurteilen 16 (Abbildung 1A,B). Bei dieser Methode kam es zu keiner Neuralleistenkontamination des Transplantats. In diesem Artikel wird die Methode veranschaulicht, die erwarteten Ergebnisse beschrieben und die Herausforderungen diskutiert.
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Protocol
Die Weiße Pekin-Ente (Anas platyrhynchos), das Weiße Leghornhuhn (Gallus gallus) und die Japanische Wachtel (Cortunix coturnix japonica) werden bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer inkubiert, bis sie bei HH7/817 aufeinander abgestimmt sind.
1. Aufbereitung des Spendergewebes
HINWEIS: Die Vorbereitung von Reagenzien und Werkzeugen und das Öffnen von Eiern für experimentelle Manipulationen wurde beschrieben6.
- Bereiten Sie DMEM-Medien mit neutralem Rot, einer Glastransferpipette und geschärften Wolframnadeln vor.
- Legen Sie die Embryonen frei (wie in6 gezeigt).
- Entnahme von Gewebetransplantaten aus der linken Seite des basalen Vorderhirns von Embryonen im Stadium 7/8. Verwenden Sie gebogene, geschärfte Wolframnadeln6 , um vorsichtig ein Stück des Vorderhirns mit einer Länge von ~0,3 mm und einer Breite von 0,2 mm einzuschneiden, und achten Sie darauf, dass Sie das darunter liegende Endoderm nicht einschließen, indem Sie die Nadel unter das Vorderhirn schieben, so dass die Nadel parallel zur Achse des Neuralrohrs ist.
- Entnahme des Transplantats mit der Glastransferpipette aus dem Spenderembryo.
- Übertragen Sie das Transplantat für 2 Minuten in DMEM, das neutrales Rot (0,01 % in PBS, 23 °C) enthält, um es zu färben, und legen Sie dann das gefärbte Transplantat in DMEM, das kein neutrales Rot enthält, bis es für die Transplantation bereit ist.
2. Den Host vorbereiten
- Befruchtete Eier des weißen Leghornhuhns (Gallus gallus) bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer bis HH7/8 17 bebrüten.
- Legen Sie die Embryonen frei (wie in6 gezeigt).
- Bereiten Sie die Transplantatstelle mit geschärften Wolframnadeln vor, indem Sie sie vorsichtig abschneiden und dann ein 0,3 mm x 0,2 mm großes Stück basales Vorderhirn von der linken Seite entfernen, um das Transplantat aufzunehmen, wie es bei der Isolierung des Spendergewebes der Fall war.
- Achten Sie darauf, eine übermäßige Zerstörung des darunter liegenden Endoderms zu vermeiden, die offensichtlich wird, wenn Dotterkörner durch jeden entstandenen Riss austreten. Dies erfordert Übung und nicht alle Versuche werden erfolgreich sein.
- Nach dem Transfer auf den Wirt6 ist das Transplantat so zu positionieren, dass es das exstirpierte basale Vorderhirn des Wirts ersetzt.
- Legen Sie das Klebeband fest über das Loch und bringen Sie den Embryo für die entsprechende Zeit zur Analyse in den 37 °C heißen Inkubator zurück.
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Representative Results
Beurteilung von Chimärismus und Transplantatkontamination
Um die Chimären beurteilen zu können, sollte das Ausmaß des Chimärismus und die Kontamination des Transplantats mit anderen Zelltypen untersucht werden. Die Erzeugung von Chimären durch die Transplantation von Wachtelgewebe in Kükenembryonen ermöglicht diese Art der Analyse. Mit Hilfe des QCPN-Antikörpers können Wachtelzellen sichtbar gemacht und vom Wirtsgewebe unterschieden werden (Abbildung 1 C,D). In diesem Fall wurden nur Gewebe aus dem ventralen Vorderhirn mit dem Antikörper gefärbt, was darauf hindeutet, dass das Transplantat nicht mit anderen Zelltypen, einschließlich Neuralleiste, kontaminiert war. Das Ausmaß des Chimärismus konnte anhand dieser Schnitte mit Hilfe der Stereologie entweder zur Zählung von Wirts- und Spenderzellen oder durch die Beurteilung der vom Spender und dem Wirtsgewebe eingenommenen Fläche abgeschätzt werden.
Beurteilung morphologischer und molekularer Ergebnisse
Ziel war es, den Einfluss des ventralen Vorderhirns auf die Gesichtsmorphologie und die SHH-Expression in der FWZ zu untersuchen. Zunächst wurde Wachtelgewebe in Entenembryonen transplantiert, um QCPN zur Beurteilung von Chimärismus wie oben beschrieben zu verwenden. Das sich schneller entwickelnde Wachtelgehirn führte jedoch zu stark deformierten Chimären (Abbildung 2), was diesen Ansatz in den Experimenten ausschloss. Aufgrund dieser Einschränkung wurde die Transplantation von Entengewebe in Hühnerembryonen für experimentelle Analysen verwendet. Dies ermöglichte zwar keine Beurteilung des Chimärismus, aber das Wachtelkükensystem wurde dafür verwendet und bestätigte, dass alle Transplantate nur aus neuronalem Gewebe bestanden16. Die resultierenden Enten-Küken-Chimären wiesen morphologische Veränderungen auf, die darauf hindeuten, dass das Gehirn an der Regulierung der Morphologie beteiligt ist (Abbildung 3). Die Entenseite des Transplantats schien sich langsamer zu entwickeln und schien entenähnlicher zu sein. Eine quantitative Analyse wurde verwendet, um festzustellen, dass diese Chimären in Richtung Entenmorphologie verschoben wurden16. Als Kontrollstadien wurden Enten- und Kükenembryonen sowie Küken-Küken-Chimären verwendet.
Die In-situ-Hybridisierung des gesamten Mount wurde verwendet, um die SHH-Expression zu untersuchen. Ähnlich wie bei der Morphologie erschien die SHH-Expression auf der Entenseite der Chimäre eher entenartig (Abbildung 3). Eine quantitative Analyse18 wurde ebenfalls verwendet, um zu zeigen, dass diese Expressionsdomäne mit der Kopfform16 korrelierte.
Abbildung 1. Transplantation und Beurteilung von Chimärismus in experimentellen Embryonen
(A) Dorsale Ansicht eines Hühnerembryos im Stadium 8, der mit neutralem Rot gefärbt ist und die Lage des Transplantats und der Transplantationsstelle zeigt. Die gestrichelte Linie ist ein ungefähres Niveau, das in B dargestellt ist. (B) Querschnitt durch einen Hühnerembryo im Stadium 8 nach In-situ-Hybridisierung, um die SHH-Expression zu zeigen. Die ungefähre Position des Transplantats ist in einem rot gepunkteten Kasten dargestellt. (C) Die Immunfärbung zum Nachweis von QCPN in Wachtel-Küken-Chimären zeigt, dass das Transplantat weit verbreitet ist und nur zum ventro-lateralen Neuralrohr (Pfeil) und zur ventralen Sehmuschel (Pfeilspitze) beiträgt. (D) Höhere Vergrößerung in C. Maßstabsbalken: A: 500 μm, B: 100 μm, C: 1 mm, D: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Beurteilung der Morphologie von Wachtel-Enten-Chimären.
(A, B) Zwei Beispiele für Wachtel-Enten-Chimären im Stadium 22. Diese Embryonen weisen schwerwiegende Missbildungen auf, die eine weitere Analyse ausschließen. Maßstabsleiste: 2 mm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Beurteilung von Enten-Küken-Chimären.
(A) Normale Küken- und (B) Entenembryonen im Stadium 22 nach In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung der SHH-Expression. (C) Eine Küken-Küken-Kontrolle zeigt ein Muster von SHH und eine Morphologie, die einem normalen Kükenembryo ähnelt. (D) Eine Enten-Küken-Chimäre zeigt ein verändertes Muster der SHH-Expression. Auf der transplantierten Seite ist die SHH-Expression (gelbe gestrichelte Linie) runder und ähnelt dem Entenmuster. Die Nasengrube ist auch auf der transplantierten Seite runder (gelber Pfeil) im Vergleich zu dem eher "geschlitzten" Aussehen auf der Wirtsseite (roter Pfeil). Der rote Balken zeigt die Mittellinie an und das Transplantat befindet sich auf der rechten Seite des Bildes. Maßstabsleiste: 1 mm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die beschriebene Methode erlaubt es, die Gewebeinteraktionen zwischen dem basalen Vorderhirn und dem angrenzenden Ektoderm zu untersuchen. Dieser Ansatz unterscheidet sich von bisherigen Vorderhirntransplantationsmethoden dadurch, dass das Spendergewebe auf das ventrale Vorderhirn beschränkt war. Dadurch wird die Transplantation der Neuralleistenzellen eliminiert, von denen gezeigt wurde, dass sie an der Musterung der Gesichtsmorphologie beteiligt sind 9,10. Daher war die Beschränkung des Transplantats auf das basale Vorderhirn unerlässlich, um die geplanten experimentellen Ergebnisse zu evaluieren.
In der vorangegangenen Forschung, in der Vorderhirntransplantationen eingesetzt wurden13,14, störte das Vorhandensein von extraneuralem Gewebe die Interpretation der geplanten Ergebnismaße nicht, da die Ergebnisse entweder verhaltensbedingt waren oder speziell die Wirts- und Spenderumgebung auf die allgemeine Gehirnentwicklung testeten. Dies ist ein wichtiger Aspekt bei der Planung von Experimenten mit diesen embryologischen Ansätzen, und die Machbarkeit muss mit Strenge in Einklang gebracht werden. So stellte beispielsweise die Anforderung, die mutmaßlichen Neuralleistenzellen auszuschließen, erhebliche Hürden dar, die es zu überwinden galt. Die Transplantationen mussten an Embryonen im frühen Neuralstadium durchgeführt werden. In diesen Stadien befindet sich das Endoderm unmittelbar neben der Transplantationsstelle, und es musste äußerste Vorsicht walten lassen, um eine Schädigung des Endoderms zu vermeiden, da dies das Überleben verringert. Obwohl nicht klar ist, ob eine Kontamination des Transplantats durch das Endoderm unsere Ergebnismessungen beeinflussen würde, bestand das Ziel darin, ausschließlich den Einfluss des ventralen Vorderhirns auf die Gesichtsentwicklung zu isolieren. Zu diesem Zweck war also die zusätzliche Strenge gerechtfertigt.
Dabei muss die Entwicklungsgeschwindigkeit der Wirts- und Spenderart berücksichtigt werden. Während Unterschiede in den Raten dieser Tiere vorteilhaft genutzt wurden, um die Rolle von Neuralleistenzellen bei der Strukturierung des sich entwickelnden Gesichtsskelettszu beurteilen 19,20, erzeugte in diesem Fall das sich schneller entwickelnde Wachtel-Nervengewebe extrem missgebildete Embryonen, wenn es in die sich langsamer entwickelnde Ente transplantiert wurde. Dies bedeutete, dass Chimärismus und Kontamination in einer anderen Reihe von Chimären bewertet werden mussten, die durch die Transplantation von Wachtelgewebe in Kükenwirte erzeugt wurden, und obwohl dies nicht ideal war, gab dies Vertrauen in die Transplantationstechnik.
Insgesamt kann die Schaffung von Chimären zur Beurteilung von Gewebeinteraktionen während der Entwicklung ein leistungsfähiger Ansatz sein, um Entwicklungsmechanismen zu verstehen. Während der Planungsphasen muss darauf geachtet werden, dass die Ergebnisse so aussagekräftig wie möglich sind, und es müssen geeignete Kontrollen festgelegt werden, die normale Embryonen und andere Chimären einschließen, um die Variation aufgrund der Operation zu berücksichtigen. In diesem Fall war es sehr wichtig, quantitative Analysen durchzuführen, da die beobachteten Veränderungen subtil waren.
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Disclosures
Alle Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsarbeiten wurden vom National Institute of Dental and Craniofacial Research der National Institutes of Health unter den Fördernummern R01DE019648, R01DE018234 und R01DE019638 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
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