Summary
מאמר זה מתאר טכניקת השתלת רקמות שנועדה לבחון את תכונות האיתות והדפוס של המוח הקדמי הבסיסי במהלך התפתחות הגולגולת.
Abstract
עובר העופות שימש כמערכת מודל במשך יותר ממאה שנה והוביל להבנה בסיסית של התפתחות בעלי חוליות. אחת מנקודות החוזק של מערכת מודל זו היא שניתן להעריך ישירות את ההשפעה של רקמות ואינטראקציה ביניהן בעוברים כימריים. הראינו בעבר כי אותות מהמוח הקדמי תורמים למורפוגנזה של הפנים על ידי ויסות צורת תחום הביטוי של קיפוד סוניק (SHH) באזור האקטודרמלי הקדמי (FEZ). במאמר זה מתוארת השיטה ליצירת כימרות במוח הקדמי ולספק המחשות לתוצאות ניסויים אלה.
Introduction
רוב המחקר העכשווי בביולוגיה התפתחותית מתמקד בתפקידם של גנים בעיצוב עוברים. יש כלים טובים לבחון מנגנונים התפתחותיים מנקודת מבט גנטית. עם זאת, עוברים מורכבים ועוברים מורפוגנזה בתגובה לאינטראקציות בין רקמות. מערכת העופות היא כלי קלאסי המשמש להערכת מגוון אינטראקציות הרקמות המווסתות את ההתפתחות מהסיבות הבאות: האמבריולוגיה מובנת היטב, העוברים נגישים בקלות, הכלים לניתוח מערכות העופות מפותחים והעוברים זולים.
מערכת השתלות העופות נמצאת בשימוש נרחב למעקב אחר שושלות ולהערכת אינטראקציות רקמות במהלך ההתפתחות במשך כמעט מאה שנה 1,2,3,4. מערכת זו שימשה לחקר מרכז איתות, Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), המווסת מורפוגנזה של הלסת העליונה5, ופורסם סרטון המתאר טכניקה זו בעבר6. בנוסף לגוזל שליו, מינים אחרים שימשו גם לייצור כימרות לניתוח אינטראקציות בין רקמות. לדוגמה, העכבר FEZ הושתל מעכברים פראיים מסוג7 ועכברים מוטנטיים8, ואחרים השתמשו במערכות ברווז, שליו ואפרוחים כדי להעריך את התפקיד של סמל עצבי בעיצוב שלד הפנים 9,10,11,12.
בעבודה זו הוערך תפקידו של המוח הקדמי בוויסות דפוס ביטוי הגנים ב-FEZ על ידי השתלת המוח הקדמי הגחוני באופן הדדי בין עוברי שליו, ברווז ואפרוחים, מאחר שנדרש אות מהמוח הקדמי כדי לגרום לביטוי קיפוד סוניק ב-FEZ. השתלות מוח קדמי אינן ייחודיות בתחום. השתלות אלה שימשו להערכת התפתחות תנועתיות בעוברי שליו וברווז13, אם כי בניסויים אלה הושתלו גם רקמות שתרמו לנגזרות לא עצביות. בעבודות אחרות, מעגלי שמיעה בציפורים הוערכו על ידי השתלת מוח קדמי14, אך השתלות אלה הכילו תאי פסגה עצביים משוערים, התורמים לצורת הפנים 9,10 ומשתתפים בוויסות הבעת SHH ב- FEZ 15. לפיכך, פותחה מערכת להשתלת המוח הקדמי הגחוני בלבד ממין אחד של ציפור למשנהו לפני סגירת הצינור העצבי כדי להעריך את תפקיד המוח בצורת פנים 16 (איור 1A,B). שיטה זו הייתה נטולת זיהום עצבי של השתל. במאמר זה מודגמת השיטה ומתוארות התוצאות הצפויות, ונדונים האתגרים הניצבים בפנינו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ברווז פקין לבן (Anas platyrhynchos), עוף לגהורן לבן (Gallus gallus) ושליו יפני (Cortunix coturnix japonica) מודגרים ב 37 ° C בתא לח עד שלב תואם ב HH7/817.
1. הכנת הרקמה התורמת
הערה: הכנת ריאגנטים וכלים וכיצד לפתוח ביצים למניפולציה ניסיוניתתוארה 6.
- הכן מדיה DMEM עם אדום ניטרלי, פיפטה העברת זכוכית, ומחטי טונגסטן מושחזות.
- חשיפת עוברים (כפי שמוצגב-6).
- קצירת שתלי רקמה מהצד השמאלי של המוח הקדמי הבסיסי של עוברים בשלב 7/8. השתמש במחטי טונגסטן מחודדותמעוקלות 6 כדי לחתוך בעדינות חתיכה מהמוח הקדמי בגודל ~ 0.3 מ"מ אורך על 0.2 מ"מ רוחב, וודא שלא לכלול את האנדודרם הבסיסי על ידי החלקת המחט מתחת למוח הקדמי כך שהמחט מקבילה לציר הצינור העצבי.
- באמצעות פיפטת העברת הזכוכית, הרימו את השתל מהעובר התורם.
- העבר את השתל ל- DMEM המכיל אדום נייטרלי (0.01% ב- PBS, 23 ° C) למשך 2 דקות כדי להכתים אותו, ולאחר מכן הכנס את השתל המוכתם ל- DMEM שאינו מכיל אדום נייטרלי עד שיהיה מוכן לקליטה.
2. הכנת המארח
- לדגור על ביצים מופרות מעוף לגהורן לבן (Gallus gallus) ב 37 ° C בתא לח עד HH7/8 17.
- חשיפת עוברים (כפי שמוצגב-6).
- באמצעות מחטי טונגסטן מושחזות, הכן את אתר השתל על ידי חיתוך עדין, ולאחר מכן הסרת חתיכה של 0.3 מ"מ על 0.2 מ"מ של המוח הקדמי הבסיסי מצד שמאל כדי להתאים את השתל כפי שנעשה כדי לבודד את הרקמה התורמת.
- היזהר למנוע הפרעה מוגזמת של האנדודרם הבסיסי, אשר יהיה ניכר כמו גרגרי חלמון יתחילו לדלוף דרך כל קרע שנוצר. זה דורש תרגול ולא כל הניסיונות יצליחו.
- לאחר המעבר למארח6, מקם את השתל כדי להחליף את המוח הקדמי הבסיסי של המארח.
- מניחים סרט בחוזקה מעל החור ומחזירים את העובר לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן המתאים לניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכת כימריזם וזיהום השתלות
על מנת להעריך את הכימרות, יש להתייחס למידת הכימריזם והזיהום של השתל עם סוגי תאים אחרים. יצירת כימרות על ידי השתלת רקמות שליו בעוברי אפרוחים מאפשרת ניתוח מסוג זה. באמצעות נוגדן QCPN ניתן להמחיש תאי שליו ולהבדיל בינם לבין הרקמות המארחות (איור 1, C,D). במקרה זה, רק רקמות שמקורן במוח הקדמי הגחוני הוכתמו בנוגדן המציין שהשתל לא היה מזוהם בסוגי תאים אחרים כולל סמל עצבי. ניתן להעריך את מידת הכימריזם מסעיפים אלה באמצעות סטראולוגיה כדי לספור תאים מארחים ותורמים, או על ידי הערכת השטח שנכבש על ידי התורם והרקמות המארחות.
הערכת תוצאות מורפולוגיות ומולקולריות
המטרה הייתה להעריך את ההשפעה של המוח הקדמי הגחוני על מורפולוגיית הפנים והבעת SHH ב- FEZ. בתחילה, רקמת שליו הושתלה בעוברי ברווז על מנת להשתמש ב- QCPN להערכת כימריזם כמתואר לעיל. אולם מוח השליו שהתפתח מהר יותר הוביל לכימרות מעוותות באופן חמור (איור 2), מה שמנע את הגישה הזו בניסויים. בשל מגבלה זו, השתלת רקמות ברווז בעוברי תרנגולות שימשה לניתוח ניסיוני. בעוד שזה לא איפשר הערכה של כימריזם, מערכת אפרוח שליו שימשה לעשות זאת ואישרה כי כל השתלים היו מורכבים רק מרקמה עצבית16. הכימרות שנוצרו כתוצאה מכך כללו שינויים מורפולוגיים שהצביעו על כך שהמוח השתתף בוויסות המורפולוגיה (איור 3). צד הברווז של ההשתלה נראה מתפתח לאט יותר ונראה יותר דמוי ברווז. נעשה שימוש בניתוח כמותי כדי לקבוע שהכימרות הללו הוזזו לכיוון מורפולוגיית ברווז16. בשלב הבקרה נעשה שימוש בעוברי ברווז ואפרוחים, כמו גם בכימרות אפרוח-אפרוח.
הכלאה של הר שלם באתרו שימשה להערכת ביטוי SHH . בדומה למורפולוגיה, ביטוי SHH בצד הברווז של הכימרה נראה יותר דמוי ברווז (איור 3). ניתוח כמותי18 שימש גם כדי להראות שתחום ביטוי זה נמצא בקורלציה עם צורת ראש16.
איור 1. השתלה והערכה של כימריזם בעוברים ניסיוניים
(A) מבט גבי על עובר תרנגולת שלב 8 המוכתם באדום ניטרלי המראה את מיקום השתל ואתר החריזה. קו מקווקו הוא רמה משוערת המוצגת ב-B. (B) חתך דרך עובר תרנגולת שלב 8 לאחר הכלאה באתרו כדי להראות ביטוי SHH . המיקום המשוער של השתל מוצג, תיבה אדומה מנוקדת. (C) בדיקה חיסונית לגילוי QCPN בכימרות של גוזלי שליו מראה שהשתל נפוץ ותורם רק לצינור העצבי הוונטרו-לטרלי (חץ) ולגביע האופטי הגחוני (ראש החץ). (D) הגדלה גבוהה יותר ב-C. פסי קנה מידה: A: 500 מיקרומטר, B: 100 מיקרומטר, C: 1 מ"מ, D: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. הערכת מורפולוגיה של כימרות שליו-ברווז.
(א, ב) שתי דוגמאות לכימרות שליו-ברווז בשלב 22. עוברים אלה יש מומים חמורים המונעים ניתוח נוסף. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. הערכת כימרות ברווז-אפרוח.
(A) אפרוח רגיל ו-(B) עוברי ברווז בשלב 22 לאחר הכלאה שלמה באתרו כדי להמחיש ביטוי SHH . (C) בקרת אפרוח-אפרוח מראה תבנית של SHH ומורפולוגיה הדומה לעובר אפרוח רגיל. (D) כימרה של אפרוח ברווז מראה תבנית שונה של ביטוי SHH . בצד המושתל ביטוי SHH (קו מקווקו צהוב) מעוגל יותר ודומה לתבנית הברווז. בור האף גם מעוגל יותר בצד המושתל (חץ צהוב) בהשוואה למראה דמוי "חריץ" יותר בצד המארח (חץ אדום). הפס האדום מציין את קו האמצע וההשתלה נמצאת בצד ימין של התמונה. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת מאפשרת לבחון את יחסי הגומלין בין המוח הקדמי הבסיסי לבין האקטודרם הסמוך. גישה זו שונה משיטות השתלת מוח קדמי קודמות, מכיוון שרקמת התורם הייתה מוגבלת למוח הקדמי הגחוני. זה מבטל השתלה של תאי הפסגה העצבית, אשר הוכחו להשתתף בדפוס מורפולוגיית הפנים 9,10. לפיכך, הגבלת השתל למוח הקדמי הבסיסי הייתה חיונית להערכת תוצאות הניסוי המתוכננות.
במחקר הקודם שהשתמש בהשתלות מוח קדמי13,14 נוכחותה של רקמה חוץ-עצבית לא הפריעה לפענוח מדדי התוצאה המתוכננים, מכיוון שהתוצאות היו התנהגותיות, או בחנו באופן ספציפי את הסביבה המארחת והתורם על התפתחות המוח הכוללת. זהו שיקול חשוב בתכנון ניסויים באמצעות גישות אמבריולוגיות אלה ויש לאזן את ההיתכנות בקפדנות. לדוגמה, הדרישה להוציא את תאי הפסגה העצבית המשוערת יצרה מכשולים משמעותיים שיש להתגבר עליהם. ההשתלות היו צריכות להתבצע בעוברים מוקדמים בשלב הנוירולה. בשלבים אלה האנדודרם צמוד מיד לאתר ההשתלה, והיה צורך לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע פגיעה באנדודרם, מכיוון שהדבר מפחית את ההישרדות. אמנם לא ברור שזיהום השתל על ידי אנדודרם ישפיע על מדדי התוצאה, אך המטרה הייתה לבודד באופן בלעדי את השפעת המוח הקדמי הגחוני על התפתחות הפנים. לכן, למטרה זו ההקפדה הנוספת הייתה מוצדקת.
יש לתת את הדעת לקצב ההתפתחות של המין הפונדקאי והתורם. בעוד שהבדלים בשיעורים של בעלי חיים אלה שימשו ליתרון בהערכת תפקידם של תאי הפסגה העצבית בעיצוב שלד הפנים המתפתח 19,20, במקרה זה, רקמת השליו העצבית המתפתחת מהר יותר יצרה עוברים בעלי מום קיצוני כאשרהושתלו בברווז המתפתח לאט יותר. משמעות הדבר הייתה שהיה צורך להעריך כימריזם וזיהום בקבוצה אחרת של כימרות שנוצרו על ידי השתלת רקמת שליו בפונדקאים אפרוחים, ואף על פי שזה לא אידיאלי, זה סיפק ביטחון בטכניקת ההשתלה.
באופן כללי, יצירת כימרות להערכת אינטראקציות בין רקמות במהלך ההתפתחות יכולה להיות גישה רבת עוצמה המסייעת בהבנת מנגנוני התפתחות. יש להקפיד במהלך שלבי התכנון כדי להבטיח שהתוצאות יהיו חד משמעיות ככל האפשר, ולקבוע בקרות מתאימות הכוללות עוברים תקינים וכימרות אחרות כדי להסביר את השונות עקב הניתוח. במקרה זה, היה חשוב מאוד להשתמש בניתוחים כמותיים, מכיוון שהשינויים שנצפו היו עדינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לכל המחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למחקר שיניים וקרניופציאליות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי הפרסים R01DE019648, R01DE018234 ו- R01DE019638.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M.
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
