Summary
Bu, uterus lenfoid hücrelerini hem hamile hem de hamile olmayan farelerden izole etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, FACS fenotipleme, hücre sıralama, işlevsel tahliller, RNA-seq ve proteomik gibi birden çok aşağı akış uygulaması için kullanılabilir. Buradaki protokol, akış sitometrisi ile kandine doğuştan gelen lenfoid hücrelerin fenotip grup 1 rahiminin nasıl olduğunu göstermektedir.
Abstract
Burada açıklanan, fare grubu 1 rahim doğuştan gelen lenfoid hücreleri (g1 uLC' ler) akış sitometrisi ile bireysel gebe uterustan izole etmek ve fenotip etmek için basit bir yöntemdir. Protokol, birden fazla senkron baraj elde etmek için zaman çiftleşmesinin nasıl kurulacağını, hamile uterusun mekanik ve enzimatik sindirimini, tek hücreli süspansiyonların lekelenmesini ve g1 UILC'leri fenotip ve ayrımcılık yapmak için bir FACS stratejisini açıklar. Bu yöntem kaçınılmaz olarak doku içindeki hücresel dağılımın mekansal bilgilerini kaybetse de, uILC heterojenliğini, gebeliği etkileyen anne ve foetal faktörlere yanıtlarını, gen ekspresyon profillerini ve işlevlerini belirlemek için protokol başarıyla uygulanmıştır.
Introduction
Burada açıklanan, bireysel gebe uterustan yüksek miktarda uterus doğuştan gelen lenfosit verimi elde etmek için basit bir yöntemdir. Bu yöntem, uterus doğuştan gelen lenfositlerin protein yüzey ekspresyonunu ve işlevselliğini korur ve FACS fenotipleme, RNAseq, proteomik veya fonksiyonel tahliller gibi sonraki uygulamalar için uygundur. Burada, grup 1 uILC'lerin akış sitometrisi ile fenotiplemasına odaklanılma vardır.
Rahim üç katmandan oluşur: endometriyum, miyometriyum ve perimetriyum (Şekil 1). Endometrium, uterusun lümenini kaplayan mukozadır. Corpus luteum tarafından üretilen progesteron, endometriumu yaprak dökenlere dönüştürür. Miyometrium, rahim duvarını oluşturan iki düz kas tabakasından oluşur. Perimetrium, uterusun sarılıp mesometrium adı verilen geniş bağ yoluyla peritona bağlayan serosadır. Uterusun bir kesitinde, lümenin karşısındaki kısma mesometrial taraf, lümene yakın olan kısma ise anti-mesometrial taraf denir. Çeşitli maternal lökositler, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin hücrelerin büyük çoğunluğunu temsil ettiği çeşitli hücre türleri de dahil olmak üzere endometrium ve yaprak dökenleri doldurur. Doğuştan gelen lenfoid hücreler (IC'ler), makrofajlar, dendritik hücreler (DC), CD4+ ve CD8+ T lenfositleri, düzenleyici T hücreleri (Tregs) ve nadir B hücreleri, gebelik boyunca rahim ortamının düzenlenmesinde önemli roller oynayabilir1,2. Rahimdeki IC'ler sadece mukozada değil, farelerdeki miyometriyumda da bulunur. Üç IC grubu da dahil olmak üzere, rahim gerçekten de grup 1 IC'lerin en yoğun yaşadığı organdır. Gebelik boyunca rahim dokularının yapısal dönüşümü ile rahim lökositlerinin sayısı ve oranı da değişmektedir (bkz. Şekil 2A grup 1 uILC alt kümelerinin yüzdeslerindeki farklılıklara bir örnek için)3,4.
Bu makalede farelere atıfta bulunulduğunda, cins laboratuvar farelerinin C57BL/6 suşu kastedilmektedir. Dışlanmış fareler (örneğin, NMRI fareleri) yüksek üreme oranları nedeniyle üreme araştırmalarında sıklıkla kullanılır. Bununla birlikte, tutarlı sonuçlar üretmek için inbred suşlarının kullanılması gereklidir ve immünoloğun en sevdiği genetik arka plan B6 olarak da bilinen C57BL/6'dır.
Orta gebelikteki B6 barajlarındaki rahim lökositlerinin yaklaşık %30'u g1 uILC'lerdir, akış sitometrisi ile uygulanabilir CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+ hücreleri (Şekil 2B): pro-anjiyojenik doku bazlı NK (trNK), geleneksel NK (cNK) üreten IFN-g ve uILC14,5 olarak tanımlanır. UNK hücrelerinin yüzdesi insanlarda daha da yüksektir ve ilk trimester6'da yaklaşık% 70'e ulaşır. İnsan ve fare uNK ve uILC7,8 arasındaki farklılıklardan daha fazla benzerlik vardır. Farklılıkları akılda tutmak önemli olsa da, iki tür üzerinde mevcut bilgileri entegre etmek yararlıdır. İnsanlarda ve laboratuvar kemirgenlerinde uILC'nin araştırılmasından elde edilen bilgileri bir araya getiren NK hücrelerinin, arteriyel integrity9 ve spiral arter tadilatının bakımı da dahil olmak üzere uterusun biyolojisi için gerekli olan homeostatik değişikliklere yardımcı olduğu açıktır11,12 trophoblast istilası. Ayrıca patojenlere karşı savunmada belirli roller oynarlar13,14. Farelerde ve sıçanlarda, implantasyon bölgesinin etrafındaki yaprak döküntünü doldurmanın yanı sıra, NK hücreleri, geçmişte işlevi henüz keşfedilmemiş olan metrial bez olarak da bilinen gebeliğin Mesometrial Lenfoid Agregası (MLAp)15 (Şekil 1B) olarak bilinen geçici bir yapıda barajların miyometriyumunun iki kas tabakası arasında birikir.
Burada açıklanan, mekanik disaggregasyon ve enzimatik sindirim kombinasyonu kullanarak gebe farelerin uterusundan lenfositleri izole etmek için laboratuvarda kullanılan yöntemin ayrıntılı bir protokolüdür. Yöntemde tüm rahim kullanıldığından, gebelik sırasında rahimden izole edilen lenfositler, desidual ve miyometriyal hücrelerin bir karışımıdır. Yaprak döken yaprak döken şeyin rahim duvarından ve MLAp'ından daha fazla diseksiyonu mümkündür ve daha önce tanımlanmıştır16. Burada açıklanan yöntem, protein yüzey ekspresyonini, hücresel işlevselliği ve canlılığı korurken uterus lenfositleri elde etmek için geliştirilmiştir. Sonuç, minimal artık hücresel döküntüye sahip tek bir hücre süspansiyonu ve hamile bir rahim için gebelik ortasında (10,5 gün) tipik olarak 1-5 milyon hücre arasında değişen bir verimdir. Bu yöntemin uygulamaları akış sitometrisi ile fenotiplemi, sonraki transkriptomik veya proteomik çalışmalar için hücre sıralama, hücre içi sitokin üretimi, degranülasyon, ELISPOT veya sitotoksik tahliller gibi fonksiyonel çalışmaları kapsar. Burada sunulan protokol grup 1 IC'leri tanımlamaya odaklanır, ancak FACS analizi için kullanılan antikor panelinde küçük değişikliklerle diğer IRC'ler, T hücreleri, B hücreleri, DC veya makrofajlar gibi diğer hücre tipleri için uyarlanabilir. Protokol ayrıca hücreleri diğer dokulardan izole etmek ve havuza alınan hamile olmayan uteriler için de kullanılabilir.
Protocol
Bu makalede açıklanan tüm hayvan deneyleri, İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından yayınlanan PP2363781 uyarınca 1986 tarihli Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası'na göre gerçekleştirilmiştir. Aşağıdaki protokol, fare hayvanlığından başlayarak facs analizi için boyama ile biten birkaç bölümden oluşmaktadır. Şekil 3 , protokolün ana adımlarını yansıtır. Protokolde kullanılan malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Genel fareler hayvancılık, çiftleşme ve diseksiyon
- 7-14 haftalık dişi fareleri belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında ve grup halinde (kafes büyüklüğüne ve hayvan ağırlığına göre tipik olarak 4-6 dişi) 10-14 gün boyunca saklayın, bu da östrus senkronizasyonu ile sonuçlanır17.
- Damızlık erkekleri SPF koşullarında, tek kişilik ve her çiftleşme arasında en az 48 saat dinlendirin (sperm yenilenme zamanı). Kanıtlanmış 3-4 aylık damızlık erkeklerin kullanılması tercih edilir, çünkü tipik olarak gençlerden daha performanslıdırlar.
- Dişilerin hamile kalma olasılığını artırmak için, çiftleşmeden 3 gün önce dişi kafeste bir erkeğin kafesinden kirli yatak takımı tanıtın. Bu, erkek idrar feromonlarına maruz kalarak Whitten etkisini18 tetikler ve senkronize östrusun yanı sıra çiftleşme için gelişmiş duyarlılıkla sonuçlanır.
- 0. Günde (D0), fareleri iki dişi başına bir damızlık erkek kullanarak çiftleşme için ayarlayın; yaklaşık % 20-25'lik bir fiş oranı düşünün.
NOT: Fareler gece hayvanları olduğu için çiftleşme muhtemelen geceleri gerçekleşecektir. - Çiftleşmeyi takip eden sabahları (D0.5), çiftleşmenin bir göstergesi olan vajinal tıkacın varlığını kontrol edin (Şekil 4). Vajinal tıkaç, erkek boşalmasının bir toplamıdır ve genellikle çiftleşmeden sonra 8-24 saate kadar devam eder. Sabahın erken saatlerinde fişleri kontrol et.
- Takılı dişileri yeni bir kafeste birleştirin ve onları ayırın. Erkekleri dinlenmek için kafeslerine geri koyun.
- D9.5 veya 10.5-after çiftleşmede, doku toplanması için 1 mL steril HBSS 1x (Mg2+ ve Ca2+ ile) ile 5 mL tüpler hazırlayın ve buza yerleştirin.
- Servikal çıkık ile hayvan ötanazisine devam edin, ardından ölümü doğrulamak için exsanguination.
- Aşağı akış uygulaması gerektiriyorsa steril bir ortamda çalışın. Ötanaziden hemen sonra, fare gövdesini% 70 etanol ile silin ve steril aletlerle laminer akı dolabının altında diseksiyona devam edin.
- Hamile uterusun mesometrial yağ içermeden diseksiyonunun yapılması (Şekil 5) ve tüm uterusun tamamını hazırlanmış ve uygun şekilde etiketlenmiş 5 mL tüpe yerleştirin. Tüpleri buzda tut.
2. Uterusun mekanik ve enzymatic sindirimi
- Enzimyasal sindirim çözeltisini hazırlamak için, steril HBSS 1x'in uterus başına 3 mL'yi 30 μg/mL DNAse ve 0,1 Wünsch ünitesi (WU)/mL Liberase DH veya 0,52 WU/mL Liberase TM ile karıştırın. Çözeltiyi 37 °C'de bir su banyosuna koyun.
NOT: Hem Liberase TM hem de Liberase DH kullanılabilir. Birinin diğerine tercih edilmesi, sonraki akış sitometri analizi için kullanılan antikorlar tarafından tanınan epitoplar üzerindeki potansiyel etkileri ile yönlendirilmelidir.
DİkKAT: Liyofilize enzimler kullanıyorsanız, kaputun altında çalışın. - PBS'de 5 mM EDTA'nın 20 mL'liğini hazırlayın (Ca2+/Mg2+ yok). Çözeltinin yarısını 37 °C'de bir su banyosuna, diğer yarısını da buza yerleştirin.
- Laminar bir akı dolabı altında, hamile uterusu çevreleyen yağı steril bir Petri kabındaki steril aletlerle hafifçe çıkarın. Dokunun kurumasına izin vermeyin.
- Fetüsleri çıkarmak için her implantasyon bölgesini steril aletlerle parçalara çıkarın (denizatı şeklindeki yarı saydam yapı, yaklaşık 1 mm uzunluğunda) (Şekil 6A). Fetüsleri atın.
- Uterusun orijinal koleksiyonuna geri dönün 5 mL tüp ve dokuyu doğrudan 5 mL tüp ve toplama ortamında makas kullanarak kıyma. Prosedürler arasında tüpleri sürekli buzda tutun.
- Kıyılmış dokuyu içeren 5 mL tüpleri 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirin.
- Her numuneye 3 mL sıcak enzimmatik sindirim karışımı ekleyin, böylece tüpteki toplam sıvı hacmi 4 mL (kıyılmış uteruslu 1 mL toplama ortamı ve 3 mL enzymatic sindirim çözeltisi). Enzymatic sindirim aktivitesini geliştirmek için 5 mL tüpleri 37 °C'de 30 dakika boyunca ajitasyonla kuluçkaya yatırın.
- 5 mL tüpleri girdaplayın ve enzimlerin etkisini engellemek için buza yerleştirin. Daha sonra, içeriği düzgün etiketlenmiş 15 mL santrifüj tüplere aktarın.
- 5 mL'lik tüplerdeki her şeyi 10 mL buz gibi 5 mM EDTA PBS çözeltisi kullanarak 15 mL santrifüj tüplerine yıkayın.
- Sindirilmiş dokuları içeren 15 mL santrifüj tüplerini 400 x g'da 10 dakika santrifüj edin.
- Süpernatantı atın, peleti hafifçe hafifçe hafifçe vurun ve ardından 10 mL sıcak (37 °C) 5 mM EDTA PBS çözeltisinde yeniden kullanın.
- Numuneleri 37 °C'de 15 mL santrifüj tüplerinde 15 dakika boyunca ajitasyonla kuluçkaya yatırarak sol sindirim ortamını çıkarın ve hücre topaklanmasını azaltın.
- Doku ayrışmasını daha da kolaylaştırmak için örnekleri 10 s boyunca yüksekte vorteks edin.
3. Uterusun tek bir hücre süspansiyonuna işlenmesi
- Steril 1 mL şırıngın pistonunu kullanarak, hücre kümelerini ve bozulmamış dokuyu çıkarmak için sindirilen dokuyu 70 μm'lik bir süzgeçten düzgün etiketlenmiş ve steril 50 mL santrifüj tüpüne zorlayın.
- Tüm hücreleri toplamak için süzgeci toplam 10 mL soğuk PBS ile birkaç kez yıkayın.
- 50 mL santrifüj tüpünü 400 x g'da 10 dakika döndürün.
NOT: A Seçeneği veya B Seçeneği'ni kullanarak diğer adımları uygulayın. Bununla birlikte, B Seçeneği, daha az hücre kaybı ve numuneler arasında hücre veriminin daha az değişkenliği nedeniyle daha yüksek bir bağışıklık hücresi verimi sağlar. B seçeneğinin teknik olarak gerçekleştirilmesi de daha kolaydır. Bu nedenle, tercihe bağlı olarak, A Seçeneği veya B Seçeneği ile devam edin.- A Seçeneği için adımlar aşağıdaki gibidir.
- PBS ile seyreltilmiş % 80 (v/v) izotonik Perkol'un 5 mL'sini içeren numune başına bir steril 15 mL santrifüj tüpü etiketle.
- Dönüşten sonra, süpernatantı 50 mL santrifüj tüpünden atın. PBS'de her peleti % 40 (v/v) izotonik Perkol'un 8 mL'sinde yeniden kullanmak için bir pipet çocuğu kullanın.
- %40 Percoll çözeltisinde yeniden kullanılan peleti %80 Percoll çözeltisine dikkatlice kaplamak için yavaş hızda bir pipet çocuğu kullanın. Pipet yavaş ve sürekli; 15 mL'lik tüpü 45° açıyla tutun (Şekil 6B).
- Kaplamayı bozmadan, 15 mL santrifüj tüplerini oda sıcaklığında (orta hızlanma ve minimum mola) 850 x g'da 20 dakika santrifüj edin.
- Percoll katmanlarını bozmadan tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın (Şekil 6C).
- İki Percoll çözeltisinin arayüzünde lökosit halkasını bozmadan, üst Percoll tabakasının yaklaşık 0,5-1 mL'si hariç hepsini atmak için steril bir Pasteur Pipet kullanın.
- Minimum miktarda Percoll çözeltisini emmeye çalışırken (toplam 4-5 mL'ye kadar), lökosit halkasını dikkatlice toplayın ve hücreleri yeni etiketli 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- Her numuneyi, ısı inaktive FBS'nin % 10'u ile desteklenmiş 10 mL steril RMPI-1640 ortamı ile toplar.
- 4 °C'de 500 x g'da 5 dakika santrifüj.
- Üstnatant atın ve RBC lizizine devam edin.
- B Seçeneği için adımlar aşağıdaki gibidir.
- Numune başına bir steril 15 mL santrifüj tüpü etiketle.
- Dönüşten sonra, süpernatantı 50 mL santrifüj tüpünden atın. RPMI-1640 ortamında %35 (v/v) izotonik Perkol'un 8 mL'si ile her peleti yeniden kullanmak için bir pipet çocuk kullanın.
- Numuneleri 15 mL santrifüj tüplerine aktarın.
- Numuneleri orta hızlanma ve minimum mola ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 940 x g'da santrifüj edin.
- Bir aspiratör veya pipet çocuğu kullanarak (tüpü ters çevirerek değil) süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- Peleti % 10 ısı inaktive FBS ile desteklenmiş 14 mL RPMI-1640 ortamında yeniden sakla ve ardından numuneyi 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjle.
- Aspirasyon tarafından üstnatant atın ve RBC liziz devam edin.
- A Seçeneği için adımlar aşağıdaki gibidir.
4.RBC lizisi
- RBC'leri sulandırmak için, numuneleri 3 mL 1x RBC liz çözeltisinde yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
- Reaksiyonun durdurulması için numunelere 10 mL PBS ekleyin.
- Tüpleri 400 x g'da 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın.
- 10 mL PBS ekleyin ve 4.3 adımını yineleyin.
- Her peleti, ısıya neden olan FBS'nin% 10'u ile desteklenmiş 1 mL RPMI-1640 ortamında yeniden sunun.
- Numuneleri steril 70 μm hücre süzgeçlerinden geçirin.
- Üreticinin talimatlarına göre trypan mavisi ve neubauer odası kullanarak hücre sayısını gerçekleştirin.
- Hücre süspansiyonunun konsantrasyonu 100 μL PBS veya ortamda 1-2 milyon hücreye ayarlayın.
5. Panel tasarım stratejisi ve kontrolleri
NOT: Bu makalede açıklanan panel uILC1, trNK ve cNK hücrelerinin ayrımcılığına uygundur ve 5 lazerli BD LSRFortessa'da kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Farklı hücre popülasyonlarını incelemek ve alternatif florokromlar kullanmak için küçük değişiklikler yapılabilir. Cihazın konfigürasyonunun kontrol etmesi, optimal ayırma için titred antikorlar kullanılması, üreticinin parlaklık indeksine danışılması ve NKp46 gibi düşük eksprese edici antijenler için en parlak boyaların kullanılması ve genel yönergelere uyun19 önerilir. NKp46 için Floresan Eksi Bir (FMO) denetiminin dahil edilmesi önerilir.
6. FACS fenotipleme için doğuştan gelen lenfoid hücre lekelenmesi
- Kuyu başına 1-2 milyon hücreyi yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakasına aktarın.
- Plakayı 4 °C'de 3 dakika boyunca 400 x g'da döndürün ve bir lavaboya vurarak süpernatantı atın.
- Hücre peletlerini çok kanallı bir pipet kullanarak 100 μL PBS 'ye (protein ve azit içermeyen) yeniden harcayın.
NOT: PBS'nin sonraki adım için sodyum azid, Tris veya protein içermediğine emin olun. - 6.2. adımı yineleyin.
- PBS (protein ve azit içermeyen) (1:1.000) ile seyreltilmiş 50 μL sabitlenebilir canlılık boyasında hücreleri yeniden biriktirin. Hücreleri karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
NOT: PBS'nin sodyum azit, Tris veya FBS veya BSA gibi protein içermemesini sağlayın, çünkü bu, ölü hücrelerin lekelenme yoğunluğunun azalmasına ve/veya canlı hücreler için arka plan boyamasının artmasına neden olabilir.
DİkKAT: Canlılık boyası toz haline getirilmişse, kaputun altında kullanın. - 150 μL PBS ekleyin, hücreleri çok kanallı bir pipetle yeniden biriktirin ve ardından 6.2 adımını tekrarlayın.
- Hücreleri, Fc reseptör blokaj reaktifi içeren 25 μL FACS Tamponunda (%1 BSA veya %2 FBS ile desteklenmiş PBS) yeniden kullanın. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- 25 μL yüzey antikor kokteyli ekleyin.
NOT: Deneyden önce her zaman antikorları titratın ve antikor panelini optimize edin. - Numuneleri karanlıkta 20 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
- Her kuyuya 150 μL FACS Tampon ekleyin, iyice karıştırın ve ardından 6.2 adımını tekrarlayın.
- 6.10.
NOT: A Seçeneği veya B Seçeneği'ni kullanarak daha fazla adım uygulayın. Hücre içi belirteçleri akış sitometrisine göre incelemek için B seçeneğini kullanın.- A Seçeneği için adımlar aşağıdaki gibidir.
- Numuneleri kuyu başına %4 paraformaldehit (PFA) 100 μL'de yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
DİkKAT: Kaputun altında PFA kullanın. PFA ile temas eden PFA atıklarını/nesnelerini (örneğin pipetler) güvenli bir şekilde atmak için lütfen güvenlik sayfasına bakın. - 6.2 adımlarını iki kez yineleyin.
DİkKAT: PFA içerdiğinden buradaki lavaboya dokunarak atmayın. Bir pipetle aspire edin ve atıkları güvenlik levhasına göre atın. - Numuneleri 200 μL PBS'de yeniden diri çekin.
- Numuneleri etiketli FACS tüplerine aktarın ve 100 μL PBS ile topunun. FACS analizi ile işlenene kadar tüpleri buzda veya buzdolabında saklayın. Numuneleri 24 saat içinde bir akış sitometresi üzerinde alın.
- Numuneleri kuyu başına %4 paraformaldehit (PFA) 100 μL'de yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
- B Seçeneği için adımlar aşağıdaki gibidir.
- Numuneleri kuyu başına 100 μL fiksasyon / permeabilizasyon çözeltisinde (paraformaldehit içeren) yeniden kullanın ve 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
DİkKAT: Kaputun altında PFA kullanın. PFA ile temas eden PFA atıklarını/nesnelerini (örneğin pipetler) güvenli bir şekilde atmak için lütfen güvenlik sayfasına bakın. - 6.2. adımı yineleyin.
DİkKAT: PFA içerdiğinden buradaki lavaboya dokunarak atmayın. Bir pipetle aspire edin ve atıkları güvenlik levhasına göre atın. - 200 μL 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve ardından 6.2 adımını tekrarlayın.
- 6.11.2.3 adımlarını yineleyin.
- Sabit ve permeabilize hücreleri hücre içi boyama için antikor karışımı içeren 50 μL 1x permeabilizasyon/yıkama tamponunda yeniden biriktirin.
- Örnekleri karanlıkta 30 dakika boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- 200 μL 1x permeabilizasyon / yıkama çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve ardından 6.2 adımını tekrarlayın.
- 6.11.2.7 adımlarını yineleyin.
- Numuneleri 200 μL PBS'de yeniden diri çekin.
- Numuneleri etiketli FACS tüplerine aktarın ve 100 μL PBS ile topunun. FACS analizi ile işlenene kadar tüpleri buzda veya buzdolabında saklayın. Numuneleri 24 saat içinde bir akış sitometresi üzerinde alın.
NOT: Bu protokolü gerçekleştirdikten sonra, desidual hücre süspansiyonu FACS analizi için hazırdır. Örnek başına mümkün olduğunca çok olay kaydedilmeniz önerilir; güvenilir sonuçlar elde etmek için ebeveyn nüfusunun en az 1.000-3.000 olayı elde edilmelidir.
- Numuneleri kuyu başına 100 μL fiksasyon / permeabilizasyon çözeltisinde (paraformaldehit içeren) yeniden kullanın ve 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
- A Seçeneği için adımlar aşağıdaki gibidir.
Representative Results
Rahim lökositlerinin tek hücreli süspansiyonu elde etmek için açıklanan yöntemin ana adımları Şekil 3'te özetlenmiştir. Şekil 2B'de gösterilen, B6 farelerde g1 IC'lerin üç alt kümesinin tanımlanmasında kullanılan temel FACS gating stratejisidir: uILC1 (CD49a+Eomes-), trNK (CD49a+Eomes+) ve cNK (CD49a-Eomes+) hücreleri. Bu popülasyonların daha fazla analizi, g1 IC'lerin çeşitli yüzey ve hücre içi belirteçlerini incelemek için yapılabilir. Örnek olarak, IFN-ɣ ve self-MHC reseptörlerinin birlikte ekspresyolü, anti-NK1.1 antikoru ile uyarılma sonrası uILC1, trNK ve cNK hücrelerinde değerlendirilebilir (Şekil 7).
Araştırma sorusuna bağlı olarak hem protokol (Şekil 3) hem de antikor paneli uyarlanabilir. Daha da önemlisi, g1 ILC gating için bir FACS panelinde hem anti-NK1.1 hem de anti-NKp46 antikorlarının kullanılması önerilir (Şekil 2B ve Tablo 1). Kan, dalak veya karaciğerden elde edilen g1 IC'lerin yüzeylerinde uterus muadilinden daha yüksek bir NKp46 ifadesine sahip olduğu belirtilmelidir (Şekil 8). NK1.1 için yüzey boyama daha iyi bir ayırma sağlar ve uterus g1 ICC'lerin kolayca kapılı olmasını sağlar (Şekil 8). NKp46 tüm fare suşları tarafından ifade edilirken, anti-NK1.1 antikorU PK136 tarafından tanınan NKR-P1C antijeni sadece bazı fare suşları ile ifade edilir, C57BL/6 (örneğin, B6), FVB/N ve NZB dahil, ancak AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, DBA/1, DBA/2, NOD, SJL veya 129'da değil. Ek olarak, araştırmacı MHC reseptörleri Ly49 gibi önemli NK hücre reseptörlerini incelemeyi planlıyorsa, insan öldürücü hücreli immünoglobulin benzeri reseptörlerin (KIR) yüksek değişkenliğini yeniden sağlayan laboratuvar fare suşlarındaki allelik varyasyonların farkında olmak önemlidir. Ayrıca, hücreler fonksiyonel bir test için NK1.1 ile uyarılacaksa, Kim, S. ve ark.20'de açıklandığı gibi, NKR-P1C antijeni çapraz bağlama anti-NK1.1 tarafından işgal edilebileceğinden veya bir reseptör downregülasyonu stimülasyonu takip edebileceğinden, hücrelerin anti-NK1.1 yerine anti-NKp46 ile lekelenmesi istenebilir. Reseptör doluluğu veya downregülasyon, uyarmak için kullanılan antikorla lekelenmeyi önleyebilir.
Enzymatic doku ayrışması ile ilgili yaygın bir sorun, hücreler üzerindeki yüzey epitoplarının bir sindirim ortamı için kullanılan enzimler tarafından değiştirilmesidir. Örneğin, Liberase TM kullanılırsa MHC CD94:NKG2A reseptörü için boyama zayıftır. Bununla birlikte, Liberase DH ile sindirim NKG2A tanımayı 16A11 antikor klonu ile korur (Şekil 9). Enzimlerin FACS panelinde tüm epitoplar üzerindeki etkisinin kontrol etmesi önerilir. Bu amaçla, mekanik ayrışma ile elde edilen fare splenositlerinin süspansiyonunu kullanın (dalak tamamını 70 μm süzgeçten geçirerek). Örnek daha sonra iki veya daha fazla parçaya ayrılır ve ardından enzimli veya enzimsiz bir ortamla inkübasyon yapılır.
Daha önce de belirtildiği gibi, doku ayrışmış örneklerde kan türevi hücreler mevcuttur. Gerekirse, masopust laboratuvarında geliştirilen intravasküler boyama yöntemi kullanılarak kan kirleticiler hariç tutulabilir21. Şekil 10 , gebelik günü 8.5'te rahim dokusu örneklerinde bulunan g1 IC'lerin yaklaşık % 6.5'inin kan kökenli olduğunu göstermektedir. İntravasküler boyama için kullanılan anti-CD45 antikorları, bir döküm kanalı için kullanılan bir florokrom ile konjuge edilebilir; bu, ekstra bir floresan kanalı kullanmadan kan kirleticileri hariç tutacaktır. En sık karşılaşılan sorunlar ve çözümleri Tablo 2'de sunulmuştur.
Şekil 1: Fare uterusunun kesitleri. (A) Uterusu dolduran çeşitli maternal lökositleri gösteren fare uterus kesiti (gebe olmayan). (B) Fare uterus kesiti (gebelik günü 8.5). (C) Fare uterus kesitleri (gebelik günü 13.5). (D) Blastosist aşamasından itibaren fare ile insan plastanta oluşumunun karşılaştırılması. BioRender.com ile oluşturulan görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Rahim g1 ILC1'in subpopulasyonları. (A) Erken yaşam ve gebelik döneminde farelerde rahim cNK, ILC1 ve trNK yüzdeleri. W - haftalar, gd - gebelik günü. Filipovic, I. vd.4'ten değiştirilmiş grafik. (B) Rahim grubu 1 ILC alt kümelerini akış sitometrisine göre analiz etmek için gating stratejisi. Lenfositler gebelik günü 10.5'te rahim dokularından izole edildi. Doku sindirimi Liberase TM içeren bir sindirim ortamı kullanılarak gerçekleştirildi. Hücreler ışığı dağıtma yeteneklerine göre kapılıydı. Doublet'ler FSC-A ve FSC-H çizimi kullanılarak dışlandı ve yalnızca CD45+CD3-CD19 uygulanabilir hücreler daha fazla analiz edildi. CD45+CD3-CD19-uygulanabilir hücrelerde grup 1 ILC kapısı NK1.1+ NKp46+ hücreleri olarak tanımlandı. Grup 1 ICC'ler içinde üç alt küme tanımlanabilir: CD49a-Eomes+ geleneksel NK hücreleri (cNK), CD49a+Eomes+ doku yerleşik NK hücreleri (trNK) ve CD49a+Eomes- uILC1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Protokolün ana adımları için görsel bir kılavuz. (1) Hamile uterusun mesometrial yağ içermeden diseksiyonunun. (2) Fetüsleri çıkarın; uterusun 5 mL tüpüne geri dönmesi ve dokuyu kıyması. Enzim sindirim adımına devam edin: her numuneye 3 mL sıcak enzimmatik sindirim karışımı ekleyin. 5 mL tüpleri ajitasyon ile 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. (3) (i) Sindirimden sonra, 5 mL tüplerdeki her şeyi 10 mL buz gibi 5 mM EDTA PBS çözeltisi kullanarak 15 mL tüplere yıkayın. (ii) 400 x g'da 10 dakika boyunca sindirilmiş dokular içeren santrifüj 15 mL tüpler. (iii) Üstnatant atın; peleti hafifçe hareket ettirin ve 10 mL sıcak (37 °C) 5 mM EDTA PBS çözeltisinde yeniden kullanın. (iv) 37 °C'deki 15 mL'lik tüplerdeki örnekleri ajitasyonla 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. (4) Steril 1 mL şırıngın pistonunu kullanarak, sindirilen dokuyu 70 μm'lik bir süzgeçten geçirerek düzgün etiketlenmiş ve steril 50 mL tüpe zorlayın ve 400 x g'da 10 dakika döndürün. (5) Döndürme işleminden sonra, A seçeneği (burada diyagramlarda temsil edilir) veya B. Seçenek A ile devam edin: 50 mL'lik tüpten süpernatantı atın ve pipetli bir çocuk kullanarak, her peleti PBS'de% 40'ın 8 mL'sinde (v/v) izotonik Percoll'da yeniden atın. (6) (i) Seçenek A devam etti: Pipetli bir çocuğu yavaş hızda kullanarak, peleti% 40 Percoll çözeltisinde% 80 Percoll çözeltisinin 5 mL'sine dikkatlice kaplayın. Pipet yavaş ve sürekli; 15 mL'lik tüpü 45° açıyla tutun. (ii) Kaplamayı bozmadan, 15 mL'lik tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 850 x g'da orta hızlanma ve yavaş kırılma ile santrifüj edin. (7) Dönüşlerden sonra, minimum miktarda Percoll çözeltisini emmeye çalışırken (toplam 4-5 mL'ye kadar), lökosit halkasını dikkatlice toplayın. (8) Kırmızı kan hücresi lizis adımlarını uygulayın. (9) Trypan mavisi ve Neubauer Odası kullanarak hücreyi sayın. (10) Kuyu başına 1-2 milyon hücreyi yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakasına aktarın. (11) Canlılık boyası ve antikor boyama ile devam edin. (12) Son olarak, örnekleri etiketli FACS tüplerine aktarın. 24 saat içinde FACS analizi ile işleyene kadar tüpleri buzda veya buzdolabında tutun. BioRender.com ile oluşturulan görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Vajinal tıkaç (A) ve yokluğu (B) C57BL/6 kadınlarda 0,5 günlük çiftleşme sonrası. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Uterusu hamile bir fareden çıkarmak için diseksiyon. (A) Baraj, vücudu% 70 etanol ile silmek için yumuşak bir tahtaya iğnelerle sabitlenir. Mavi noktalı çizgilerle belirtildiği gibi iki dikey kesi yapılır. (B) Deri iç organları açığa çıkarmak için kaldırılır. Bağırsak halkaları uterusun görselleştirilmesi için hafifçe yukarı taşınır. (C) Rahim üç noktada kesilerek örneklendirilir: yumurtalıkların yanında ve servikste, sırasıyla iki mavi noktalı çizgi ve mavi okta belirtildiği gibi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması. (A) Embriyoların implantasyon bölgesinden mekanik olarak çıkarılması. (B) Percoll gradyan kaplama; üst katman, Percoll'un % 40'ında tek hücreli süspansiyonu ve Percoll'un% 80'inde alt katmanı içerir. (C) Percoll gradyanın santrifüjlenmesinden sonra lenfosit halka oluşumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Grup 1 IC'ler ile fonksiyonel tahlillerin temsili FACS analizi. NK1.1'i plakaya bağlı antikorlarla çapraz bağladıktan sonra, kendi kendine MHC (Ly49C, Ly49I ve NKG2A) için NK reseptörlerini ifade eden grup 1 ICC'lerde hücre içi IFN-ɣ ve yüzey CD107a tespiti. Hücreler gebelik günü 9.5'te rahim dokularından izole edildi. Doku sindirimi Liberase DH içeren bir sindirim ortamı kullanılarak gerçekleştirildi. Gösterilenler, dört çeyreğin (köşe) ham değerlerinin yanı sıra, kendi kendine reseptörleri (kalın sayılar) olmayan benlik ve yanıtlayıcılar için reseptörleri ifade eden hücreler arasındaki yanıtlayıcıların göreli yüzdesidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Anti-NKp46 ve anti-NK1.1 antikorları ile dalak ve rahim lenfositlerinin lekelenmesi. (A) Gebelik günü 10.5'te fare dalağını ve (B) uterustan elde edilen hücre süspansiyonları ikiye ayrıldı; bir parça NKp46-APC (kırmızı), diğeri NK1.1-APC (mavi) ile boyandı. Rahim lenfositlerinin NKp46 lekelenmesi, NKp46+ ve NKp46 hücrelerini dalak lenfositleri kadar düzgün bir şekilde ayırmaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Sindirim ortamı ile inkübasyon ile NKG2A MFI'nin (antikor klonu: 16A11) azalması. C56BL/6 fare splenositlerinin hücre süspansiyonu üç bölüme ayrıldı. Bir kısmı Liberase DH sindirim ortamında (0.13 WU/mL Liberase DH ve 30 μg/mL DNAse içeren HBSS) inkübe edildi ve bir diğeri kısmı Liberase TM sindirim ortamı (0.52 WU/mL Liberase TM ve 30 μg/mL DNAse içeren HBSS) ile inkübe edildi. Üçüncü bölüm 37 °C'de 30 dakika boyunca düzgün HBSS ile tedavi edildi. G1 ICC'ler üzerindeki NKG2A işaretleyicisinin ekspresyometrisi akış sitometrisi ile değerlendirildi. Shreeve N'den alınan grafik. Gebelikte rahim NK hücre inhibisyonunun rolü (Tez); Süpervizör: Colucci F, 2020. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Kan türevi g1 IC'lerin dışlanması için anti-CD45 antikorları ile intravital boyama. Gebelik günü 8.5'te bir C57BL/6 baraj faresi, 3 μg CD45-AF647 ile intravenöz enjeksiyondan 3 dakika sonra itlaf edildi. Rahim, tam kan ve timus, FACS analizi için hasat edildi ve işlendi. X ekseni CD45-AF647 ile intravenöz boyamadan gelen sinyali gösterir ve Y ekseni in vitro lekeli CD45-BUV395'ten gelen sinyali gösterir. Alt nüfus yüzdeleri çeyrek olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Antikor / Boya | Klon | Florokrom | Lazer | |
| 1 (Boşaltma kanalı) | Zombi Menekşe Sabitlenebilir Canlılık boyası | Menekşe | ||
| CD19 | 1D3 | BV421 | ||
| CD3 | 145-2C11 | BV421 | ||
| 2 | CD45 | 30-F11 | FITC | Mavi |
| 3 | NK1.1 | PK136 | BV605 | Menekşe |
| 4 | NKp46 | 29A1.4 | APC | Kırmızı |
| 5 | CD49a | Ha31/8 | BUV395 | Morötesi |
| 6 | EOMES | Dan11mag | PE | Yeşil |
Tablo 1: Geleneksel 5 lazerli sitometre için FACS paneli örneği.
| Sorun | Olası neden | Öneri |
| Hücre halkası iki percoll çözümünün arayüzünde görünmez | Numune işleme sırasında harmanlama çözeltisinin kötü katmanlaması veya iki katmanın karıştırılması | Kaplama sırasında % 80'lik katlama yastığını kırmamaya ekstra özenin. Numune kullanımı sırasında dikkat edin: perkol arayüzünü bozmayın |
| Düşük sayıda lökosit (örneğin, hamile olmayan bir rahim kullanırken) | Arayüzdeki hücre numarası çok düşük olsa bile arayüz görülebilir. Halka görünmese bile, daha fazla işlem için yeterli hücre olabileceğinden, sıvıyı% 40 ila% 80 arasında toplama çözeltilerinde toplayın | |
| Tamamlanmamış RBC lizisi | Hücreler, lising arabelleğine düzgün bir şekilde yeniden kullanılmadı | Pipet hücreleri yukarı ve aşağı kümeleri kırmak ve lysing tamponunda hücreleri tamamen yeniden dirdirmek için |
| Lysing çözeltisi soğuktur | Kullanımdan önce lising çözeltisini oda sıcaklığına dengelayın | |
| 15 dakikaya kadar lising çözeltisi ile kuluçka süresini uzatın | ||
| RBC liziz adımı tekrarlanabilir | ||
| Düşük hücre verimi | Zayıf enzymatic sindirim | Enzimlerin güncel olup olmadığını ve kılavuzlarına göre depolanıp saklanmadığını kontrol edin |
| Yıkama adımları sırasında hücre kaybı | Her yıkama adımından sonra hücre peletini inceleyin: döndükten sonra kuyunun altındaki opak pelet. U-bottom plakalar yerine V-bottom, salıncak rotor santrifüj, daha uzun santrifüj süresi hücre kaybını azaltabilir | |
| Doku örneği düşük sayıda lenfosit içerir (örneğin, hamile olmayan bir rahim kullanırken) | Analiz için yeterli olay elde etmek için birkaç uterusun havuzunu yapın. Hücre yalıtımı için iletişim kuralının B seçeneğini kullanmayı düşünün | |
| Aynı gruptaki farelerden elde edilen mutlak lökosit sayılarının yüksek değişkenliği | %40 ve %80'lik perkole çözümlerinin arayüzünde tutarsız hücre koleksiyonu | Toplam arabiriminde tüm hücre kesirini topladığından emin olun. Hücre yalıtımı için iletişim kuralının B seçeneğini kullanmayı düşünün |
| Bazı hücre yüzey belirteçleri için beklenen lenfosit alt dolguları/ belirteçleri veya olağandışı düşük MFI tespit edememek | Enzymatic sindirim, bazı epitopların yüzey ekspresyonunu veya bozulmalarını etkiler | Enzim (örneğin farklı liberaz veya kollajenaz tipine) ve/veya kuluçka ve/veya enzim konsantrasyonu uzunluğu gibi enzimatik sindirimi optimize edin |
| Akış sitometresinde yüksek arka plan gürültüsü | Hücre kalıntılarının veya RBC kontaminasyonunun yüksek oranı | FSC eşik parametresini ayarlayın. Hücre yalıtımı için iletişim kuralının A seçeneğini kullanmayı düşünün |
Tablo 2: Sorun giderme kılavuzu.
Discussion
Yöntem, bundan sonra açıklanan birkaç kritik adım içerir. İlk kritik adım, lökosit popülasyonlarının göreceli sıklığı hamilelik yoluyla değiştiği için birden fazla senkron gebelik elde etmektir. Aynı gebelik gününde birden fazla baraja sahip olmak, aynı deneylerde biyolojik tekrarlara veya aşağı akış uygulamaları için gerekli daha büyük sayılar elde etmek için bireysel barajlardan lenfositlerin birikmesine izin verir. Süreli çiftleşme, araştırmacının gebe kalma süresini 24 saat içinde tam olarak belirlemesini sağlar. Fareler yaklaşık 2,5 yıl yaşamasına rağmen, 4-7 haftadan 6-8 aylık olana kadar üreme çağında olacaktır. Genç fareler genellikle daha küçük yavrular ürettiğinden, dişi fareler genellikle 6-8 hafta arasında olana kadar çiftleşmez ve erkek fareler 8-10 hafta arasında olana kadar çiftleşmez. Östrusun farelerde yaklaşık 15 saat sürdüğü ve her 4-5 günde bir meydana geldiği göz önüne alındığında, tipik çiftleşme oranı (vajinal bir tıkaçla ortaya çıkar, bkz. Şekil 4) yaklaşık% 25'tir. Bu nedenle, östrusta fare kullanmak ve belirli bir deney için gerekli sayıda baraj elde etmek için yeterli sayıda planlamak önemlidir. Östrus döngüsü evresi vajinal smear sitolojisi ile belirlenebilir22. Fiş oranı, çiftleşmeden önce 48 saat dinlenen erkekler ve Whitten etkisinden yararlanılarak geliştirilebilir18. Alternatif olarak, endojen folikül uyarıcı hormonun etkisini taklit eden, oosit olgunlaşmasını indükleyen ve 42-50 saat sonra, endojen luteinize edici hormonun etkisini taklit eden insan koryonik gonadotropin yumurtlamayı indükleyen hamile kısrak serumu uygulanabilir. Bu hormonal tedavi östrus gereksinimini atlar ve hemen hemen tüm tedavi edilen kadınları alıcı hale getirir.
İkinci bir kritik adım, FACS boyama kalitesini sağlamaktır. Akış sitometrisinde kullanılan antikorlar her zaman titratlandırılmalı ve en uygun konsantrasyonda kullanılmalıdır ve enzimatik sindirimin önemli antijenik epitopları ayırmadığını kontrol etmek gerekir. Bir enzimin bir epitopu ayırıp ayırmayacağını değerlendirmek için, biri aynı numunenin iki fraksiyonunu paralel olarak lekeleyebilir, biri enzymatic ve diğeri mekanik sindirime tabi tutulabilir. Benzer şekilde, güvenilir veri elde etmek için uygun kontrollerin ve tek lekelerin kullanılması çok önemlidir. Nadir olaylar için, boncuklar tek leke örnekleri oluşturmak için kullanılabilir. Voltajları kurmak için boncukların değil, lenfositler ve splenositler gibi diğer lökositleri içeren bir hücre popülasyonu kullanılması önerilir. Boncuklar kullanılırsa, boncuk boyama için antikorları titratlamak gerekir, bu nedenle lekeli boncukların floresan yoğunluğu hücrelerin floresan yoğunluğu ile karşılaştırılabilir olacaktır. Belirli bir işaretleyici için pozitifi negatif hücrelerden ayırmakta zorluk çekerse, belirli bir işaretleyici için gating'i kolaylaştırmak için bir FDO kontrolü de kullanılabilir. Hücre içi belirteçler durumunda, hücre içi lekelenme artık ilişkisiz antikorlara neden olabileceğinden, izotip kontrolü kullanılmalıdır, bu da yıkama adımlarından sonra hücrelerde hala bulunabilir ve bu nedenle arka plan sinyalini artırabilir. Mikropluoresans zamanla önemli ölçüde arttığı ve bazı antikorların floresan yoğunluğu zamanla azalabileceğinden, FACS analizi ile fenotiplemede en iyi sonuçları elde etmek için hücrelerin sabitlenerek 24 saat içinde örneklerin çalıştırması önerilir.
Dikkate alınması gereken bir diğer önemli faktör, protokolle elde edilen tek hücreli süspansiyonun aşağı akış uygulamasıdır. Fonksiyonel tahliller için steril koşullarda çalışmak esastır. Benzer şekilde, sonraki omik çalışmaları için steril ve RNaz, DNaz ve proteaz içermeyen çalışmalarda çalışmak önemlidir.
Burada sunulan protokol fenotipleme grubu 1 IC'lere odaklanır, ancak antikor panelini değiştirerek diğer hücre tiplerini fenotipleme için uyarlanabilir. Enzymatik tedavi ile yüzey epitoplarının kaybını/değişimini tespit etmek için tüm antikorların sindirilmiş ve sindirilmemiş hücre süspansiyonlarına karşı test edilmesi önerilir. Benzer şekilde, dokuyu sindirmek ve hücre verimini artırmak için farklı enzimler kullanılabilir, ancak önemli antijenik epitoplar üzerindeki etkisi dikkatlice incelenmelidir. NKp46 dalak NK hücreleri için iyi bir belirteçtir ve laboratuvar farelerinin tüm suşlarında çalışır, C57BL / 6 farelerdeki uNK hücrelerinde NKp46 ifadesi dalak NK hücrelerinden önemli ölçüde daha düşüktür. Aynı anda hem NK1.1 hem de NKp46 için leke yapmak en iyisidir. Birden fazla organ doğrudan karşılaştırılacaksa, dalak veya kemik iliği gibi dokular için enzimematik sindirim gerekli olmasa bile tüm örneklerin eşit şekilde tedavi edilmesi önerilir. Burada sunulan yöntem gebe olmayan rahim için geçerli olsa da, iki fazlı Percoll gradyanı ile lenfosit halka izolasyonu zor olacaktır ve izole edilmiş hücrelerin verimi güvenilir FACS analizi için çok düşük olabilir ve bu nedenle bireysel, hamile olmayan farelerin uterusundan izole edilmiş hücrelerin bir araya toplanmış olmasını gerektirecektir23.
Verilerin yorumlanması için dikkate alınması gereken protokol sınırlamaları vardır. Tüm dokularda olduğu gibi, kandan gelen dolaşımdaki lenfositler doku yerleşik hücrelerin yanında izole edilecektir. Dolaşımdaki lenfositlerin dışlanması veri yorumlama için gerekliyse, dolaşımdaki hücreleri etiketlemek için intravital boyama yapılabilir. Ayrıca, protokole ikinci bir sınırlama, tüm hücreler dokudan çıkarılamayacağı için bazı hücrelerin kaybedileceğidir. En sık karşılaşılan sorunlar ve sorun gidermeleri Tablo 2'de sunulmuştur.
Tarihsel olarak, dokulardaki hücrelerin incelenmesi doku bölümlerinin histolojik incelemesine dayanmıştır. Sandra Peel'in mükemmel incelemesi24 , 80'lerin sonuna kadar 100 yıldan fazla bir süre boyunca yapılan çalışmaları özetliyor. Daha sonra uNK hücreleri olarak bilinen hücrelerin tanımları, lenfositler keşfedilmeden yarım yüzyıldan daha önce yayınlanan el yazmalarında ortaya çıkar. Yani, 1975'te NK hücrelerinin keşfinden önce ve uNK hücreleri maternal glikojen hücreleri veya granül metrial bez hücreleri olarak belirtilmiştir. Anne Croy sahada büyük katkılarda bulundu25 ve nazikça takıma optimize ettiği diseksiyonu öğretti3 ve bu şu anda kullanılıyor. UNK hücrelerinin morfoloji ve doku konumunun tarifinde etkili olmakla birlikte, klasik histolojik inceleme, ilgi çekici hücreler üzerinde sadece birkaç belirteç tespiti ile sınırlıdır. 2008 yılında, rahim lenfositleri üzerinde aynı anda birden fazla belirteci tespit etmek için akış sitometri tabanlı bir yöntem tanımlanmıştır26. Bu esasen bu makalede açıklanan yöntemdir. Mekansal transkriptomi ve kütle sitometrisi ile görüntüleme gibi daha yeni teknolojiler histoloji ve akış-sitometrinin gücünü birleştirerek hem sırasıyla birden fazla gen veya proteinin aynı anda tespit edilmesine hem de normal doku mimarisinin korunmasına olanak sağlar.
Burada açıklanan yöntemin uygulamaları birden fazladır ve FACS fenotipleme, fonksiyonel tahlil (ELISPOT, degranülasyon veya sitotoksik tahliller gibi), hücre sıralama ve sonraki transkriptomik veya proteomikleri içerir. Bu yönteme dayalı olarak geliştirilebilen diğer uygulamalar, hücre sıralama veya negatif tükenme ile zenginleştirmeden sonra desiduel NK hücrelerinin kültürünü ve genişlemesini içerir. Şu anda, IL-2 veya IL-12 ve IL-15 kombinasyonu eklenerek 7-14 gün boyunca geliştirilebilen ve genişletilebilen insan NK hücrelerine benzer şekilde, fare uNK hücrelerini kültürlü ve genişletmek ve canlılıklarını ve işlevlerini uzun bir süre korumak için bir protokol yoktur. Fare uNK hücreleri için böyle bir yöntemin optimizasyonu, fonksiyonel tahliller gerçekleştirirken daha fazla esneklik sağlayacak ve daha yüksek bir hücre numarasıyla birden fazla koşulun test edilmesine izin verecektir. Öte yandan, kültür koşullarının lenfositlerin benzersiz fenotipini ve potansiyel olarak işlevlerini değiştirdiği bilinmektedir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi ve çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipoviç ve Anita Qualls da dahil olmak üzere bu yöntemin geliştirilmesine yardımcı olan önceki ve mevcut ekip üyelerine teşekkür ederiz. Bu araştırma Wellcome trust [Grant number 200841/Z/16/Z] ve Medical Research Council (MR/P001092/1) tarafından finanse edildi. Açık erişim amacıyla, yazar bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Kabul Edilen Makale sürümüne CC BY kamu telif hakkı lisansı uygulamıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | |
| BSA | Sigma | A9647-100G | |
| CD19 antibody | BD | 562701 | |
| CD3 antibody | BD | 562600 | |
| CD45 antibody | BioLegend | 103108 | |
| CD49a antibody | BD | 740262 | |
| DNase I | Roche (Sigma) | 10104159001 | |
| EOMES antibody | eBioscience | 12-4875-82 | |
| Fc block Trustain fcx | BioLegend | 101320 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10217-106 | |
| Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) | BD | 554714 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Gibco | 14025092 | |
| Liberase DH | Roche (Sigma) | 5401089001 | |
| Lysis buffer Pharmlyse | BD | 555899 | |
| NK1.1 antibody | BioLegend | 108739 | |
| NKp46 antibody | BioLegend | 137608 | |
| Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) | Agar Scientific | AGR1026 | |
| PBS 10x | Gibco | 14030-048 | |
| PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) | Thermo Scientific | 14190144 | |
| Percoll | VWR international | 17-0891-01 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi | 130-095-823 | |
| RMPI-1640 medium + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Scientific | 15575020 | |
| Zombie Violet Fixable Viability dye | BioLegend | 423113 |
References
- Colucci, F.
- Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. The unique immunological and microbial aspects of pregnancy. Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).
- Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , Elsevier, Academic Press. (2014).
- Filipovic, I., et al. Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus. Nature Communications. 9 (1), 4492 (2018).
- Chen, Z., et al. DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression. Biology of Reproduction. 87 (4), 81 (2012).
- Moffett, A., Colucci, F. Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).
- Gaynor, L. M., Colucci, F. Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice. Frontiers in Immunology. 8, 467 (2017).
- Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M.
- Wilkens, J., et al. Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil. The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon γ contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).
- Crespo, ÂC., et al. Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts. Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).
- Shmeleva, E. V., Colucci, F. Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity. Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).
- Kather, A., et al. Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus. Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).
- Croy, B. A., et al. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods in Molecular Biology. 612, Clifton, N.J. 465-503 (2010).
- Vander lee, S., Boot, L. M.
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Kim, S., et al. Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules. Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Caligioni, C. S.
- Doisne, J. -M., et al. Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells. Journal of Immunology. 195 (8), Baltimore, Md. 3937-3945 (2015).
- Peel, S. Fate of GMG Cells. Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. 115, Springer. Berlin. (1989).
- Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones. Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).
- Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells. Journal of Immunology. 181 (9), Baltimore, Md. 6140-6147 (2008).
