Summary
Detta är en metod för att isolera livmoder lymfoida celler från både gravida och icke-gravida möss. Denna metod kan användas för flera nedströms applikationer såsom FACS-fenotypning, cellsortering, funktionella analyser, RNA-seq och proteomik. Protokollet här visar hur man fenotyp grupp 1 livmoderns medfödda lymfoida celler efter flöde cytometri.
Abstract
Beskrivs här är en enkel metod för att isolera och fenotyp mus grupp 1 livmoderns medfödda lymfoida celler (g1 uILCs) från enskilda gravida livmodern genom flöde cytometri. Protokollet beskriver hur man ställer in tids parning för att erhålla flera synkron dammar, den mekaniska och enzymatiska matsmältningen av den gravida livmodern, färgning av encelliga suspensioner och en FACS strategi för att fenotyp och diskriminera g1 uILCs. Även om denna metod oundvikligen förlorar rumslig information om cellulära distribution inom vävnaden, har protokollet framgångsrikt tillämpats för att fastställa uILC heterogenitet, deras svar på moderns och fostrets faktorer som påverkar graviditeten, deras genuttryck profil och deras funktioner.
Introduction
Beskrivs här är en enkel metod för att få ett högt utbyte av livmoderns medfödda lymfocyter från enskilda gravida livmodern. Denna metod bevarar proteinytan uttryck och funktionalitet av livmoderns medfödda lymfocyter och det är lämpligt för efterföljande tillämpningar såsom FACS fenomenotypning, RNAseq, proteomik eller funktionella analyser. Här ligger fokus på fenotypning av grupp 1 uILCs efter flödescytometri.
Livmodern består av tre lager: livmoderslemhinnan, myometrium och bukhinnan (figur 1). Endometrium är slemhinnan, som fodrar livmoderns lumen. Progesteron, som produceras av corpus luteum, omvandlar endometrium till decidua. Myometrium består av två lager av glatt muskel som utgör livmoderväggen. Perimetrium är serosa som omsluter livmodern och förbinder den med bukhinnan genom det breda ligamentet som kallas mesometrium. I ett tvärsnitt av livmodern kallas den del som är motsatt till lumen mesometrialsidan, medan delen nära lumen kallas anti-mesometriesidan. En mängd olika moderns leukocyter fyller endometrium och decidua, inklusive flera typer av celler, där de medfödda immuncellerna representerar de allra flesta celler. Medfödda lymfoida celler (INC), makrofager, dendritiska celler (DC), liksom CD4 + och CD8 + T lymfocyter, reglerande T-celler (Tregs) och sällsynta B-celler, kan alla spela viktiga roller i regleringen av livmodermiljön under hela graviditeten1,2. ICS i livmodern finns inte bara i slemhinnan, men också i myometrium hos möss. Inklusive alla tre grupperna av IPC är livmodern verkligen det organ som är mest tätbefolkat av grupp 1 IBC. Med den strukturella omvandlingen av livmodervävnader under hela dräktigheten förändras också antalet och andelen livmoderns leukocyter (se figur 2A för ett exempel på variationer i andelen undergrupper i grupp 1 uILC)3,4.
När möss nämns i detta dokument avses C57BL/6-stammen av inavlade laboratoriemöss. Avlade möss (t.ex. NMRI-möss) används ofta i reproduktiv forskning på grund av deras höga reproduktionshastighet. Användningen av inavlade stammar är dock nödvändig för att generera konsekventa resultat, och immunologens favoritgenetiska bakgrund är C57BL/6, även känd som B6.
Cirka 30% av livmoderns leukocyter i B6-dammar vid mitten av dräktigheten är g1 uILCs, som definieras av flödescytometri som livskraftig CD45 + CD3-CD19-NK1.1 + NKp46 + celler (figur 2B): pro-angiogenic vävnad-resident NK (trNK), IFN-g producerar konventionella NK (cNK) och uILC14,5. Andelen uNK-celler är ännu högre hos människor och nådde cirka 70% under det första kvartalet6. Det finns fler likheter än skillnader mellan människa och mus uNK och uILC7,8. Även om det är viktigt att ha skillnaderna i åtanke, är det användbart att integrera information som finns tillgänglig om de två arterna. När man kombinerar information som erhållits från undersökning av uILC hos människor och laboratoriegnagare, är det uppenbart att NK-celler hjälper till med homeostatiska förändringar som är väsentliga för livmoderns biologi, inklusive underhåll av arteriell integritet9 och spiralartärombyggnad10, samt trophoblast invasion11,12. De spelar också specifika roller i försvaret mot patogener13,14. Hos möss och råttor ackumuleras NK-celler mellan de två muskelskikten i myometrium av dammar i en övergående struktur som kallas Mesometrial Lymphoid Aggregate of pregnancy (MLAp)15 (figur 1B), även känd tidigare som metrialkörteln, vars funktion ännu inte har upptäckts.
Beskrivs här är ett detaljerat protokoll av den metod som används i laboratoriet för att isolera lymfocyter från livmodern hos gravida möss med en kombination av mekanisk uppdelning och enzymatisk matsmältning. Eftersom hela livmodern används i metoden är lymfocyter isolerade från livmodern under graviditeten en blandning avciduella och myometrieceller. Ytterligare dissekering av decidua från livmoderväggen och dess MLAp är möjlig, och det har beskrivits före16. Metoden som beskrivs här utvecklades för att erhålla livmoderns lymfocyter samtidigt bevara protein ytan uttryck, cellulära funktionalitet och livskraft. Resultatet är en enda cell suspension med minimala kvarvarande cellulära skräp och en avkastning som vanligtvis sträcker sig från 1-5 miljoner celler vid mitten av dräktigheten (10,5 dagar) för en gravid livmoder. Tillämpningarna av denna metod omfattar fenotypning genom flödescytometri, cellsortering för efterföljande transkriptomiska eller proteomiska studier, funktionella studier såsom intracellulär cytokinproduktion, degranulering, ELISPOT eller cytotoxiska analyser. Protokollet som presenteras här fokuserar på att identifiera grupp 1 ICS men kan anpassas för andra celltyper som andra IPC, T-celler, B-celler, DC eller makrofager med mindre modifieringar av antikroppspanelen som används för FACS-analys. Protokollet kan också användas för att isolera celler från andra vävnader och för poolade icke-gravida uteri.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs i detta dokument utfördes enligt Animals (Scientific Procedures) Act 1986 enligt PP2363781 utfärdat av Det brittiska inrikesministeriet. Protokollet nedan består av flera sektioner som utgår från mösshållning och slutar med färgning för FACS-analys. Figur 3 återspeglar protokollets huvudsteg. Materialen som används i protokollet listas i materialförteckningen.
1. Allmän mösshållning, parning och dissekering
- Håll 7-14 veckor gamla honmöss under specifika patogenfria (SPF) förhållanden och grupphus (vanligtvis 4-6 honor enligt burstorlek och djurvikt), i 10-14 dagar för att utlösa Lee-Boot-effekten, vilket resulterar i estrussynkronisering17.
- Håll hanarna i SPF-förhållanden, enkelhusiga, och utvilade i minst 48 timmar mellan varje parning (tid för spermiedyregenerering). Det är att föredra att använda erfarna beprövade 3-4 månader gamla stud män eftersom de vanligtvis är mer performant än de unga.
- För att öka sannolikheten för att kvinnor blir gravida, introducera smutsiga sängkläder från en mans bur i den kvinnliga buren 3 dagar före parning. Detta utlöser Whitten-effekten18 genom exponering för manliga urinferomoner, och resulterar i synkroniserad östs samt förbättrad mottaglighet för parning.
- På dag 0 (D0), ställ in mössen för parning med en stud hane per två honor; överväga en plugghastighet på cirka 20-25 %.
OBS: Parning kommer sannolikt att ske på natten eftersom möss är nattliga djur. - På morgonen efter parning (D0.5), kontrollera om det finns en vaginal plugg, vilket är en indikator på kopulering (figur 4). Vaginalpluggen är ett aggregat av hanejakulatet och kvarstår vanligtvis i upp till 8-24 h efter parning. Kolla pluggarna tidigt på morgonen.
- Konsolidera de pluggade kvinnorna i en ny bur och öronmärk dem. Sätt tillbaka männen till sina burar för vila.
- Vid D9.5 eller 10.5-efter parning, förbered 5 ml rör med 1 ml steril HBSS 1x (med Mg2+ och Ca2+) för vävnadsuppsamling och placera dem på is.
- Fortsätt till djur dödshjälp genom livmoderhalscancer förskjutning, följt av exsanguination för att bekräfta döden.
- Arbeta i en steril miljö om nedströmsapplikationen kräver det. Direkt efter dödshjälp, torka av muskroppen med 70% etanol och fortsätt till dissekering under ett laminärt flödesskåp med sterila instrument.
- Dissekera den gravida livmodern fri från mesometriefett (figur 5) och placera hela livmodern i ett förberett och lämpligt märkt 5 ml-rör. Håll rören på is.
2. Mekanisk och enzymatisk matsmältning av livmodern
- För att förbereda den enzymatiska digestionslösningen, blanda 3 ml per livmoder av steril HBSS 1x med 30 μg/ml DNAse och 0,1 Wünsch-enhet (WU)/ml Liberase DH eller 0,52 WU/ml Liberase TM. Lägg lösningen i ett vattenbad vid 37 °C.
OBS: Både Liberase TM och Liberase DH kan användas. Valet av den ena över den andra måste styras av deras potentiella effekt på epitoper som känns igen av antikroppar som används för efterföljande flödescytometrianalys.
VARNING: Om du använder frystorkade enzymer, arbeta under huven. - Förbered 20 ml 5 mM EDTA i PBS (ingen Ca2+/Mg2+). Placera halva lösningen vid 37 °C i ett vattenbad och den andra halvan på is.
- Under ett laminärt flödesskåp, ta försiktigt bort fettet som omger den gravida livmodern med sterila instrument i en steril Petri-maträtt. Låt inte vävnaden torka.
- Dissekera varje implantationsställe med sterila instrument för att avlägsna fostret (sjöhästformad genomskinlig struktur, cirka 1 mm lång) (figur 6A). Kassera fostret.
- Sätt tillbaka livmodern till deras ursprungliga samling 5 mL-rör och färsa vävnaden med sax direkt i 5 ml-röret och insamlingsmediet. Håll rören på is hela tiden mellan ingreppen.
- Placera 5 ml-rören som innehåller den malda vävnaden i ett vattenbad vid 37 °C.
- Tillsätt 3 ml varm enzymatisk matsmältningsblandning till varje prov så att den totala volymen vätska i röret är 4 ml (1 ml insamlingsmedium med den malda livmodern och 3 ml enzymatisk matsmältningslösning). Inkubera 5 ml-rören i 30 min vid 37 °C med agitation för att förbättra enzymatisk matsmältningsaktivitet.
- Virvel 5 ml rör och placera dem på is för att hämma enzymernas verkan. Överför sedan innehållet till korrekt märkta 15 ml centrifugrör.
- Spola ut allt ur 5 ml-rören i 15 ml centrifugrören med 10 ml iskall 5 mM EDTA PBS-lösning.
- Centrifugera de 15 ml centrifugrören som innehåller de smälta vävnaderna i 10 minuter vid 400 x g.
- Kassera supernatanten, snärta försiktigt pelleten och sätt sedan tillbaka den i 10 ml varm (37 °C) 5 mM EDTA PBS-lösning.
- Inkubera proverna i 15 ml centrifugrör vid 37 °C med omrörning i 15 minuter för att avlägsna det överblivna matsmältningsmediet och minska cellklumpningen.
- Virvel proverna på hög i 10 s för att ytterligare underlätta vävnads dissociation.
3. Bearbetning av livmodern till en enda cell suspension
- Använd kolven på en steril 1 ml-spruta och tvinga den smälta vävnaden genom en 70 μm sil på ett korrekt märkt och sterilt 50 ml centrifugrör för att avlägsna cellklumparna och den odissocierade vävnaden.
- Tvätta silen flera gånger med totalt 10 ml kall PBS för att samla alla celler.
- Snurra 50 ml centrifugröret i 10 min vid 400 x g.
OBS: Utför de ytterligare stegen med alternativ A eller alternativ B. Alternativ A möjliggör bättre anrikning av lymfocyterna med mindre skräp och stromal cellkontaminering än alternativ B. Alternativ B ger dock ett högre immuncellutbyte på grund av mindre cellförlust och mindre variation i cellutbytet mellan proverna. Alternativ B är också lättare att utföra tekniskt. Beroende på önskemål fortsätter du därför med alternativ A eller alternativ B.- Stegen för alternativ A är följande.
- Etikett ett sterilt 15 ml centrifugrör per prov som innehåller 5 ml 80% (v/v) isoton Percoll utspädd i PBS.
- Efter spinn, kassera supernatanten från 50 mL centrifugröret. Använd en pipet pojke för att återanvända varje pellet i 8 ml 40% (v/v) isotonic Percoll i PBS.
- Använd en pippojke med långsam hastighet för att försiktigt överlägga pelleten som används i 40% Percoll-lösningen på 80% Percoll-lösningen. Pipett långsamt och kontinuerligt; håll 15 ml-röret i en vinkel på 45° (bild 6B).
- Utan att störa överlägget, centrifugera 15 ml centrifugrören i 20 minuter vid 850 x g, vid rumstemperatur (medelacceleration och minsta brytning).
- Ta försiktigt bort rören från centrifugen utan att störa Percoll-lagren (figur 6C).
- Utan att störa ringen av leukocyter vid gränssnittet för de två Percoll-lösningarna, använd en steril Pasteur Pipette för att kassera alla utom cirka 0,5-1 ml av det övre Percoll-skiktet.
- Medan du försöker suga en minsta mängd Percoll-lösning (upp till 4-5 ml totalt), samla försiktigt in ringen av leukocyter och överför cellerna till ett nytt märkt 15 ml centrifugrör.
- Fyll på varje prov med 10 ml sterilt RMPI-1640 medium kompletterat med 10% värmeinaktiverad FBS.
- Centrifugera i 5 min vid 500 x g vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och fortsätt till RBC lysis.
- Stegen för alternativ B är följande.
- Märk ett sterilt 15 ml centrifugrör per prov.
- Efter spinn, kassera supernatanten från 50 mL centrifugröret. Använd en pipet pojke för att återanvända varje pellet med 8 mL av 35% (v/v) isotonic Percoll i RPMI-1640 medium.
- Överför proverna till 15 ml centrifugrör.
- Centrifugera proverna vid 940 x g i 10 min vid rumstemperatur med medelacceleration och minsta brytning.
- Aspirera supernatanten försiktigt med hjälp av en aspirator eller pipettpojke (inte genom att vända röret).
- Återsuspend pelleten i 14 ml RPMI-1640 medium kompletterat med 10% värmeinaktiverad FBS och centrifugera sedan provet vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Kassera supernatanten genom strävan och fortsätt till RBC lys.
- Stegen för alternativ A är följande.
4.RBC lys
- För att lysera RBC: erna, återanvänd proverna i 3 ml 1x RBC-lysningslösning och inkubera i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 10 ml PBS i proverna för att stoppa reaktionen.
- Centrifugera rören vid 400 x g i 5 min och kassera supernatanten.
- Tillsätt 10 ml PBS och upprepa steg 4.3.
- Återanvänd varje pellet i 1 ml RPMI-1640 medium kompletterat med 10% värmeinaktiverad FBS.
- Skicka proverna genom sterila 70 μm cellsilrar.
- Utför cellantalet med trypan blå och en Neubauer Chamber enligt tillverkarens instruktioner.
- Justera koncentrationen av cellfjädringen till 1-2 miljoner celler i 100 μL PBS eller medium.
5. Paneldesignstrategi och kontroller
OBS: Panelen som beskrivs i detta dokument är lämplig för diskriminering av uILC1, trNK och cNK celler och utformades för att användas på en 5-laser BD LSRFortessa. Mindre modifieringar kan göras för att studera olika cellpopulationer och använda alternativa fluorokromer. Det rekommenderas att kontrollera instrumentets konfiguration, använda titrerade antikroppar för optimal separation, konsultera tillverkarens ljusstyrkeindex och använda de ljusaste färgämnena för låguttryckande antigener som NKp46 och följa allmänna riktlinjer19. Det rekommenderas att inkludera en Fluorescence Minus One (FMO) kontroll för NKp46.
6. Medfödd lymfoid cellfärgning för FACS-fenotypning
- Överför 1-2 miljoner celler per brunn till en rundbottnad 96-brunnsplatta.
- Snurra plattan vid 400 x g i 3 min vid 4 °C och kassera supernatanten genom att snärta den i ett handfat.
- Återanvänd cellpelletsen till 100 μL PBS (protein- och azidfri) med hjälp av en flerkanalig pipett.
OBS: Se till att PBS inte innehåller natriumazid, inga Tris eller proteiner för det efterföljande steget. - Upprepa steg 6.2.
- Återsuspendceller i 50 μL fixerbart bärkraftsfärgat utspädt i PBS (protein- och azidfritt) (1:1 000). Inkubera cellerna vid rumstemperatur i 30 min i mörkret.
OBS: Se till att PBS inte innehåller någon natriumazid, inga Tris eller proteiner som FBS eller BSA eftersom detta kan leda till minskad färgningsintensitet hos döda celler och/eller ökad bakgrundsfärgning för levande celler.
VARNING: Om bärkraftsfärgen pulveriseras, använd under huven. - Tillsätt 150 μL PBS, återanvänd cellerna med en flerkanalig pipett och upprepa sedan steg 6.2.
- Återsuspend cellerna i 25 μL FACS Buffer (PBS kompletterad med 1% BSA eller 2% FBS) som innehåller Fc-receptorblockerande reagens. Inkubera cellerna i 5 min vid 4 °C.
- Tillsätt 25 μL av en antikroppscocktail.
OBS: Titrera alltid antikroppar och optimera antikroppspanelen före experimentet. - Inkubera proverna vid rumstemperatur i 20 minuter i mörker.
- Tillsätt 150 μL FACS-buffert till varje brunn, blanda noggrant och upprepa sedan steg 6.2.
- Upprepa steg 6.10.
OBS: Utför ytterligare steg med alternativ A eller alternativ B. Använd alternativ A för att färga cellerna med ytmarkörer. Använd alternativ B för att studera de intracellulära markörer efter flödescytometri.- Stegen för alternativ A är följande.
- Återanvänd proverna i 100 μL 4% paraformaldehyd (PFA) per brunn och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
VARNING: Använd PFA under huven. Se säkerhetsbladet för kassering av PFA-avfall/föremål som har kommit i kontakt med PFA (t.ex. pipetter) på ett säkert sätt. - Upprepa steg 6.2, två gånger.
VARNING: Kassera inte genom att snärta in i diskbänken här eftersom den innehåller PFA. Aspirera med en pipett och kassera avfallet enligt säkerhetsbladet. - Återanvänd proverna i 200 μL PBS.
- Överför proverna till märkta FACS-rör och fyll på med 100 μL PBS. Förvara rören på is eller i kylskåp tills de bearbetas med FACS-analys. Ta proverna på en flödescytometer inom 24 timmar.
- Återanvänd proverna i 100 μL 4% paraformaldehyd (PFA) per brunn och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Stegen för alternativ B är följande.
- Återanvänd proverna i 100 μL fixerings-/permeabiliseringslösning per brunn (innehållande paraformaldehyd) och inkubera i 20 min vid 4 °C.
VARNING: Använd PFA under huven. Se säkerhetsbladet för kassering av PFA-avfall/föremål som har kommit i kontakt med PFA (t.ex. pipetter) på ett säkert sätt. - Upprepa steg 6.2.
VARNING: Kassera inte genom att snärta in i diskbänken här eftersom den innehåller PFA. Aspirera med en pipett och kassera avfallet enligt säkerhetsbladet. - Tillsätt 200 μL 1x permeabilisering / tvättbuffert, blanda väl och upprepa sedan steg 6.2.
- Upprepa steg 6.11.2.3.
- Återsuspend de fasta och permeabiliserade cellerna i 50 μL 1x permeabilisering/tvättbuffert som innehåller antikroppar blandning för intracellulär färgning.
- Inkubera proverna vid 4 °C i 30 minuter i mörker.
- Tillsätt 200 μL 1x permeabilisering / tvättlösning, blanda väl och upprepa sedan steg 6.2.
- Upprepa steg 6.11.2.7.
- Återanvänd proverna i 200 μL PBS.
- Överför proverna till märkta FACS-rör och fyll på med 100 μL PBS. Förvara rören på is eller i kylskåp tills de bearbetas med FACS-analys. Ta proverna på en flödescytometer inom 24 timmar.
OBS: Efter att ha utfört detta protokoll är denciduella cellavstängningen klar för FACS-analys. Vi rekommenderar att du registrerar så många händelser som möjligt per prov. minst 1 000-3 000 händelser i en föräldrapopulation måste erhållas för att uppnå tillförlitliga resultat.
- Återanvänd proverna i 100 μL fixerings-/permeabiliseringslösning per brunn (innehållande paraformaldehyd) och inkubera i 20 min vid 4 °C.
- Stegen för alternativ A är följande.
Representative Results
De viktigaste stegen i metoden som beskrivs för att erhålla en enda cell suspension av livmoderns leukocyter sammanfattas i figur 3. I figur 2B visas den grundläggande FACS-gitterstrategi som används för identifiering av tre delmängder av g1-IKU:er hos B6-möss: uILC1 (CD49a+Eomes-), trNK (CD49a+Eomes+) och cNK-celler (CD49a-Eomes+). Ytterligare analys av dessa populationer kan utföras för att studera olika yta och intracellulära markörer för g1 IBC. Som ett exempel kan co-expression av IFN-ľ och själv-MHC-receptorer bedömas i uILC1- och trNK- och cNK-celler efter stimulering med anti-NK1.1-antikroppar (figur 7).
Beroende på forskningsfrågan kan både protokollet (figur 3) och antikroppspanelen anpassas. Det är viktigt att använda både anti-NK1.1- och anti-NKp46-antikroppar i en FACS-panel för g1 ILC-gating (figur 2B och tabell 1). Det bör noteras att g1 IBC som erhållits från blod, mjälte eller lever har ett högre uttryck av NKp46 på ytan än livmodermotsvarigheten (figur 8). Ytfärgning för NK1.1 ger en bättre separation och gör det enkelt att porta ut INC för livmoder g1 (figur 8). Medan NKp46 uttrycks av alla musstammar, uttrycks NKR-P1C-antigenet som känns igen av anti-NK1.1-antikroppen PK136 endast av vissa musstammar, inklusive C57BL/6 (dvs. B6), FVB/N och NZB, men inte i AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, DBA/1, DBA/2, NOD. Dessutom, om prövaren avser att studera viktiga NK-cellreceptorer som MHC-receptorerna Ly49, är det viktigt att vara medveten om allelic variationer i laboratoriemusstammar, som rekapitulerar den höga variationen hos humana mördarcellsimmunglobulinliknande receptorer (KIR). Om cellerna ska stimuleras med NK1.1 för en funktionell analys, som beskrivs i Kim, S. et al.20, kan det dessutom vara önskvärt att färga cellerna med anti-NKp46 snarare än anti-NK1.1, eftersom NKR-P1C-antigenet kan upptas av korslänkande anti-NK1.1 eller en receptornedreglering kan följa stimuleringen. Antingen receptorbeläggning eller nedreglering kan hindra färgning med samma antikropp som används för att stimulera.
Ett vanligt problem med enzymatisk vävnadsavsociation är förändringen av yteptoper på celler av enzymer som används för ett matsmältningsmedium. Till exempel är färgning för MHC CD94:NKG2A-receptorn dålig om Liberase TM används. Matsmältningen med Liberase DH bevarar dock NKG2A-erkännandet med 16A11 antikroppsklon (figur 9). Det rekommenderas att kontrollera enzymernas påverkan på alla epitoper i ens FACS-panel. För detta ändamål, använd suspensionen av mussxlenocyter som erhålls genom mekanisk dissociation (passerar hela mjälten genom en 70 μm sil). Provet delas sedan upp i två eller flera delar följt av inkubation med ett medium med eller utan enzym.
Som nämnts tidigare finns blodbaserade celler i vävnadssan samsocierade prover. Vid behov kan blodföroreningar uteslutas med hjälp av en intravaskulär färgningsmetod som utvecklats i Masopust laboratorium21. Figur 10 visar att cirka 6,5% av g1 IBC som finns i livmodervävnadsprover vid dräktighetsdag 8,5 är blodbaserade. Anti-CD45 antikroppar som används för intravaskulära färgning kan konjugeras med en fluorokrom som används för en dump-kanal; Detta utesluter blodföroreningar utan att använda en extra fluorescenskanal. De vanligaste problemen och deras lösningar presenteras i tabell 2.
Bild 1: Tvärsnitt av en mus livmoder. A) Mus livmoderns tvärsnitt (icke-gravid) som anger en mängd olika leukocyter hos mödrar som fyller livmodern. C) Mus livmoderns tvärsnitt (graviditetsdag 13.5). (D) Jämförelse av mus kontra mänsklig moderkaka bildning från blastocyst stadium och framåt. Bilder skapade med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Subpopulationer av livmoderns g1 ILC1. (A) Procentandelar livmoder cNK, ILC1 och trNK hos möss under tidig ålder och graviditet. W - veckor, gd - graviditetsdag. Modifierad graf från Filipovic, I. et al.4. (B) Gating strategi för att analysera livmodergrupp 1 ILC-delmängder efter flödescytometri. Lymfocyter isolerades från livmoderns vävnader vid dräktighet dag 10,5. Vävnad matsmältning utfördes med hjälp av en matsmältning medium som innehåller Liberase TM. Cellerna var gated baserat på deras förmåga att sprida ljus. Doublets uteslöts med hjälp av en FSC-A kontra FSC-H plot, och endast CD45 + CD3-CD19- livskraftiga celler analyserades ytterligare. Inom CD45 +CD3-CD19- livskraftiga celler identifierades grupp 1 ILC gate som NK1.1 + NKp46 + celler. Inom grupp 1 INC kan tre delmängder identifieras: CD49a-Eomes+ konventionella NK-celler (cNK), CD49a+Eomes+ vävnadsinvånade NK-celler (trNK) och CD49a+Eomes- uILC1. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: En visuell guide för protokollets huvudsteg. (1) Dissekera den gravida livmodern fri från mesometriefett. (2) Avlägsna fostret; återför livmodern till 5 ml-röret och färsa vävnaden. Fortsätt med enzymet matsmältningssteg: tillsätt 3 ml varm enzymatisk matsmältningsblandning till varje prov. Inkubera 5 ml-rören i 30 min vid 37 °C med omrörning. (3) i) Spola efter matsmältningen allt ur 5 ml rör i 15 ml rör med 10 ml iskall 5 mM EDTA PBS-lösning. ii) Centrifugera 15 ml rör som innehåller smälta vävnader i 10 minuter vid 400 x g. iii) Kassera supernatanten, snärta försiktigt pelleten och återsuspendera den i 10 ml varm (37 °C) 5 mM EDTA PBS-lösning. iv) Inkubera prover i 15 ml-rören vid 37 °C med omrörning under 15 minuter. (5) Efter spinn, fortsätt med antingen alternativ A (representeras här i diagram) eller B. Alternativ A: kassera supernatanten från 50 ml-röret och, med hjälp av en pippojke, försänk varje pellet i 8 ml 40% (v/v) isoton percoll i PBS. (6) i) Alternativ A fortsatte: Använd en pippojke i långsam hastighet och överlag överlägg pelleten som förbrukas i 40% Percoll-lösning på 5 ml 80% Percoll-lösning. Pipett långsamt och kontinuerligt; håll 15 ml-röret i en vinkel på 45°. ii) Centrifugera 15 ml-rören vid 850 x g i 20 minuter vid rumstemperatur, med medelhög acceleration och långsam brytning utan att störa överlägget. (7) Efter spinn, medan du försöker suga en minsta mängd Percoll-lösning (upp till 4-5 ml totalt), samla försiktigt upp ringen av leukocyter. (8) Utför lyssteg i röda blodkroppar. (9) Räkna cell med trypan blå och en Neubauer Chamber. (10) Överför 1-2 miljoner celler per brunn till en rundbottnad 96-brunnsplatta. (11) Fortsätt med livskraftfärgning och fläckar av antikroppar. (12) Slutligen överföra proverna till märkta FACS-rör. Förvara rören på is eller i kylskåp tills de bearbetas med FACS-analys inom 24 timmar. Bilder skapade med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Vaginal plugg (A) och frånvaro av den (B) hos C57BL/6 honor vid 0,5 dagars efter parning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Dissekering för att extrahera livmodern från en gravid mus. (A) Dammen är fastsatt med nålar på en mjuk bräda för att torka kroppen med 70% etanol. Två vertikala snitt görs, vilket indikeras av de blå prickade linjerna. (B) Huden lyfts för att exponera inre organ. Tarmslingorna flyttas försiktigt upp för att visualisera livmodern. C) Livmodern provtas genom skärning vid tre punkter: bredvid äggstockarna och vid livmoderhalsen, enligt de två blå prickade linjerna respektive den blå pilen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Beredning av encellsfjädring. (A) Mekaniskt avlägsnande av embryon från deras implantationsställe. B) Percoll-överlägg. det översta lagret innehåller encellsfjädringen i 40% av Percoll och det nedre lagret 80% av Percoll. C) Lymfocytringbildning efter centrifugering av percoll-gradienten. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Representativ FACS-analys av funktionell analys med grupp 1-IPC: er. Intracellulär IFN-ľ och yt-CD107a detektion i grupp 1 IBC som uttrycker NK-receptorer för själv-MHC (Ly49C, Ly49I och NKG2A) jämfört med de som inte gör det, efter korslänkning NK1.1 med plattbundna antikroppar. Cellerna isolerades från livmoderns vävnader på dräktighet dag 9,5. Vävnad matsmältning utfördes med hjälp av en matsmältning medium som innehåller Liberase DH. Visas är de råa värdena för alla fyra kvadranterna (hörn) samt den relativa andelen svarande bland celler som uttrycker receptorer för sig själv och responders som inte har självreceptorer (djärva tal). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Färgning av spleniska och livmoderlymfocyter med anti-NKp46 och anti-NK1.1 antikroppar. A) Cellavstängningar som erhållits från mjälte och B) livmoder vid dräktighetsdag 10,5 separerades i två. en del var färgade med NKp46-APC (röd) och den andra med NK1.1-APC (blå). Observera att NKp46 färgning av livmoderns lymfocyter inte separerar NKp46 + och NKp46- celler lika snyggt som splenic lymfocyter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 9: Minskning av NKG2A MFI (antikroppsklon: 16A11) genom inkubation med matsmältningsmedium. Cell suspension av C56BL/6 mus splenocytes delades in i tre delar. En del inkuberades i Liberase DH-matsmältningsmedium (HBSS innehållande 0, 13 WU/mL Liberase DH och 30 μg/ml DNAse), och en annan del inkuberades med Liberase TM-matsmältningsmedium (HBSS innehållande 0, 52 WU/mL Liberase TM och 30 μg/ml DNAse). Den tredje delen behandlades med snygg HBSS i 30 min vid 37 °C. Uttryck av NKG2A markör på g1 INC bedömdes av flöde cytometry. Graf tagen från Shreeve N. Rollen av livmoderns NK-cellhämning under graviditet (Tes); Handledare: Colucci F, 2020. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 10: Intravital färgning med anti-CD45 antikroppar för uteslutning av blod-härledda g1 IBC. En C57BL/6 damm mus vid dräktighet dag 8,5 gallrades 3 min efter intravenös injektion med 3 μg CD45-AF647. Livmodern, helblod och tymus skördades och bearbetades för FACS analys. X-axeln visar signalen från intravenös färgning med CD45-AF647, och Y-axeln visar signal från in vitro färgade CD45-BUV395. Procentandelen delpopulationer visas i kvadranter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Antikropp / Färgämne | Klon | Fluorokrom | Laser | |
| 1 (Dumpa kanal) | Zombie Violet Fixable Viability färgämne | Violett | ||
| CD19 | 1D3 | BV421 | ||
| CD3 | 145-2C11 | BV421 | ||
| 2 | CD45 | 30-F11 | FITC | Blå |
| 3 | NK1.1 | PK136 | BV605 | Violett |
| 4 | NKp46 | 29A1.4 | APC | Röd |
| 5 | CD49a | Ha31/8 | BUV395 | Ultraviolett |
| 6 | EOMES | Dan11mag | PE | Grön |
Tabell 1: Ett exempel på FACS-panel för konventionell 5-lasercytometer.
| Problem | Möjlig orsak | Förslag |
| Cellringen är inte synlig vid gränssnittet för två percoll-lösningar | Dålig skiktning av percolllösning eller blandning av två lager under provhantering | Var extra försiktig så att du inte bryter 80% percoll-kudden under överläggning. Var uppmärksam under provhantering: stör inte percoll-gränssnittet |
| Lågt antal leukocyter (till exempel när du använder en icke-gravid livmoder) | Gränssnittet kan ses även när cellnumret i gränssnittet är mycket lågt. Även om ringen inte är synlig, samla vätska på mellan 40% och 80% percoll-lösningar, eftersom det fortfarande kan finnas tillräckligt med celler för vidare bearbetning | |
| Ofullständig RBC-lys | Cellerna återanvänddes inte korrekt i lysbufferten | Pipetterceller upp och ner för att bryta klumpar och helt återanvända celler i lysningsbuffert |
| Lysningslösningen är kall | Balansera lyslösningen till rumstemperatur före användning | |
| Förläng inkubationstiden med lyslösningen upp till 15min | ||
| RBC-lyssteg kan upprepas | ||
| Lågt cellutbyte | Dålig enzymatisk matsmältning | Kontrollera om enzymer inte är inaktuella och har lagrats enligt deras manualer |
| Cellförlust under tvättsteg | Inspektera cellpelleten efter varje tvättsteg: den ogenomskinliga pelleten längst ner på brunnen efter spinn. Användning av V-botten istället U-bottenplattor, svängrotorcentrifuger, längre centrifugeringstid kan minska cellförlusten | |
| Vävnadsprov innehåller lågt antal lymfocyter (till exempel vid användning av en icke-gravid livmoder) | Pool flera livmodern för att få tillräckligt med händelser för analys. Överväg att använda alternativ B i protokollet för cellisolering | |
| Hög variabilitet av absoluta leukocyttal som erhållits från möss i samma grupp | Inkonsekvent insamling av celler i gränssnittet för 40% och 80% percoll-lösningar | Se till att samla in hela cellfraktionen på percoll-gränssnittet. Överväg att använda alternativ B i protokollet för cellisolering |
| Kan inte detektera förväntade subpopulationer/markörer för lymfocyter eller ovanligt låg MFI för vissa cellytans markörer | Enzymatisk matsmältning påverkar ytuttrycket hos vissa epitoper eller deras nedbrytning | Optimera enzymatisk matsmältning genom att ändra: enzym (t.ex. till olika typer av liberas eller kollagenas) och/eller inkubationslängd och/eller enzymkoncentration |
| Högt bakgrundsljud i flödescytometern | Hög andel cellrester eller RBC-föroreningar | Justera FSC-tröskelvärdesparametern. Överväg att använda alternativ A i protokollet för cellisolering |
Tabell 2: Felsökningsguide.
Discussion
Metoden innehåller flera kritiska steg som diskuteras nedan. Det första kritiska steget är att få flera synkron graviditeter som den relativa frekvensen av leukocyt populationer förändras genom graviditet. Att ha flera dammar vid samma graviditetsdag möjliggör antingen biologiska upprepningar i samma experiment eller poolning av lymfocyter från enskilda dammar för att få större antal som krävs för nedströmsapplikationer. Tidsbeprövad parning gör det möjligt för forskaren att fastställa befruktning inom en 24-timmarsperiod. Även om möss lever i cirka 2,5 år, kommer de att vara i reproduktiv ålder från 4-7 veckor till 6-8 månader gammal. Eftersom yngre möss vanligtvis producerar mindre valpar, paras honmöss i allmänhet inte förrän de är mellan 6-8 veckor och manliga möss tills de är mellan 8-10 veckor. Med tanke på att estrus varar ca 15 h hos möss och förekommer var 4-5 dag, är den typiska parningshastigheten (avslöjad av en vaginal plugg, se figur 4) cirka 25%. Det är därför viktigt att använda möss i estrus och planera tillräckligt antal för att få det önskade antalet dammar för ett visst experiment. Estrus cykelfasen kan bestämmas av vaginalt utstrykscytologi22. Plugghastigheten kan förbättras genom att vila hanar 48 h före parning och genom att dra nytta av Whitten-effekten18. Alternativt kan man administrera gravid sto serum, som efterliknar effekten av det endogena follikelstimulerande hormonet, inducera oocyt mogna och, 42-50 h senare, mänskliga kolioniska gonadotropin, som efterliknar effekten av det endogena luteiniserande hormonet, inducera ägglossning. Denna hormonella behandling kringgår kravet på estrus och gör praktiskt taget alla behandlade kvinnor mottagliga.
Ett andra viktigt steg är att säkerställa kvaliteten på FACS-färgningen. Antikroppar som används i flödescytometri måste alltid titreras och användas vid optimal koncentration, och det är nödvändigt att kontrollera att den enzymatiska matsmältningen inte klyver viktiga antigena epitoper. För att bedöma om ett enzym kommer att klyva en epitop kan man färga två fraktioner av samma prov parallellt, en genomgår enzymatisk och den andra mekanisk matsmältning. På samma sätt är användningen av lämpliga kontroller och enskilda fläckar avgörande för att få tillförlitliga data. För sällsynta händelser kan pärlor användas för att generera enskilda fläckprover. Det rekommenderas att inte använda pärlor för att ställa in spänningar utan snarare en population av celler som innehåller lymfocyter och andra leukocyter, såsom splenocyter. Om pärlor används är det nödvändigt att titrera antikroppar för pärlfärgning, så fluorescensintensiteten hos färgade pärlor kommer att vara jämförbar med cellernas fluorescensintensitet. Vid svårigheter att separera positiva från negativa celler för en viss markör kan en FMO-kontroll också användas för att underlätta gating för en viss markör. När det gäller intracellulära markörer måste en isotypkontroll användas som intracellulär färgning kan leda till kvarvarande obundna antikroppar, som fortfarande kan finnas i cellerna efter tvättstegen och därmed öka bakgrundssignalen. Det rekommenderas att köra proverna inom 24 timmar efter fixering av cellerna för att uppnå bästa resultat vid fenotypning genom FACS-analys, eftersom autofluorescens ökar avsevärt med tiden och fluorescensintensiteten hos vissa antikroppar kan minska med tiden.
En annan viktig faktor att tänka på är nedströms tillämpningen av encellsavstängningen som erhållits med protokollet. För funktionella analyser är det viktigt att arbeta under sterila förhållanden. På samma sätt är det för efterföljande omicsstudier viktigt att arbeta i sterila och RNase, DNase och proteasfria.
Protokollet som presenteras här fokuserar på fenotypning grupp 1 ICS men kan anpassas för fenotypning av andra celltyper genom att modifiera antikroppspanelen. Det rekommenderas att alla antikroppar testas mot smält och icke-smält cell suspension för att upptäcka förlust/förändring av ytepitoper genom enzymatisk behandling. På samma sätt kan olika enzymer användas för att smälta vävnaden och öka cellutbytet, men dess effekt på viktiga antigena epitoper måste noggrant studeras. Medan NKp46 är en bra markör för mjälte NK-celler och fungerar i alla stammar av laboratoriemöss, är uttrycket av NKp46 på uNK-celler i C57BL/6 möss betydligt lägre än på mjälte NK-celler. Det är bäst att fläcka för både NK1.1 och NKp46 samtidigt. Om flera organ ska jämföras direkt rekommenderas att behandla alla prover lika, även om den enzymatiska matsmältningen inte krävs för vävnader som mjälte eller benmärg. Även om metoden som presenteras här är tillämplig på den icke-gravida livmodern, kommer lymfocytringen isolering av en tvåfas Percoll gradient att vara utmanande, och utbytet av isolerade celler kan vara för lågt för tillförlitlig FACS-analys och kommer därför att kräva sammanslagning av celler isolerade från livmodern hos enskilda, icke-gravida möss23.
Det finns begränsningar i protokollet att beakta för tolkningen av uppgifterna. Som det är fallet för alla vävnader kommer cirkulerande lymfocyter som kommer från blodet att isoleras tillsammans med vävnadsboende celler. Om uteslutandet av cirkulerande lymfocyter är avgörande för datatolkning kan intravital färgning utföras för att märka cirkulerande celler. Dessutom är en andra begränsning av protokollet att vissa celler kommer att gå förlorade eftersom inte alla celler kan extraheras från vävnaden. De vanligaste problemen och felsökningen av dem presenteras i tabell 2.
Historiskt sett har studien av celler i vävnader förlitat sig på histologisk undersökning av vävnadssektioner. Sandra Peels utmärkta recension24 sammanfattar det arbete som gjorts under mer än 100 år fram till slutet av 80-talet. Beskrivningar av celler som senare kallas uNK-celler förekommer faktiskt i manuskript publicerade mer än ett halvt sekel innan lymfocyter ens upptäcktes. Så, före upptäckten av NK celler i 1975, och uNK celler har anges som moderns glykogen celler eller granulerade metrial körtel celler. Anne Croy har gjort stora insatser inom området25 och vänligt lärt teamet den dissekering hon hade optimerat3, och det används för närvarande. Även om det är avgörande för att beskriva morfologi och vävnad plats uNK celler, klassisk histologiska undersökning är begränsad till detektion av endast ett fåtal markörer på cellerna av intresse. År 2008 beskrevs en flödescytometribaserad metod för att samtidigt detektera flera markörer på livmoderlymfocyter26. Detta är i huvudsak den metod som har beskrivits i detta dokument. Nyare tekniker som rumslig transkriptomik och avbildning genom massa cytometri kombinerar kraften i histologi och flöde-cytometri, vilket möjliggör både samtidig upptäckt av flera gener eller proteiner, respektive bevarandet av den normala vävnadsarkitekturen.
Tillämpningarna av den metod som beskrivs här är flera och inkluderar FACS-fenotypning, funktionell analys (såsom ELISPOT, degranulering eller cytotoxiska analyser), cellsortering och efterföljande transkriptomik eller proteomik. Ytterligare applikationer som kan utvecklas baserat på denna metod inkluderar odling och expansion av deciduella NK-celler efter cellsortering eller anrikning genom negativ utarmning. För närvarande finns det inget protokoll för att odla och expandera mus uNK-celler och bevara deras livskraft och funktionalitet under en längre period, på liknande sätt som mänskliga NK-celler som kan odlas och utökas i 7-14 dagar genom tillsats av IL-2 eller en kombination IL-12 och IL-15. Optimeringen av en sådan metod för mus uNK-celler skulle ge mer flexibilitet när man utför funktionella analyser och göra det möjligt att testa flera villkor med ett högre cellnummer. Å andra sidan är kulturförhållanden kända för att modifiera den unika fenotypen av lymfocyter och eventuellt deras funktion också.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja och inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar de tidigare och nuvarande teammedlemmarna som har hjälpt till att utveckla denna metod, inklusive Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic och Anita Qualls. Denna forskning finansierades av Wellcome Trust [Grant number 200841/Z/16/Z ] och Medical Research Council (MR/P001092/1). För öppen åtkomst har författaren tillämpat en CC BY offentlig upphovsrättslicens på alla författare accepterade manuskriptversioner som härrör från denna inlämning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | |
| BSA | Sigma | A9647-100G | |
| CD19 antibody | BD | 562701 | |
| CD3 antibody | BD | 562600 | |
| CD45 antibody | BioLegend | 103108 | |
| CD49a antibody | BD | 740262 | |
| DNase I | Roche (Sigma) | 10104159001 | |
| EOMES antibody | eBioscience | 12-4875-82 | |
| Fc block Trustain fcx | BioLegend | 101320 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10217-106 | |
| Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) | BD | 554714 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Gibco | 14025092 | |
| Liberase DH | Roche (Sigma) | 5401089001 | |
| Lysis buffer Pharmlyse | BD | 555899 | |
| NK1.1 antibody | BioLegend | 108739 | |
| NKp46 antibody | BioLegend | 137608 | |
| Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) | Agar Scientific | AGR1026 | |
| PBS 10x | Gibco | 14030-048 | |
| PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) | Thermo Scientific | 14190144 | |
| Percoll | VWR international | 17-0891-01 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi | 130-095-823 | |
| RMPI-1640 medium + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Scientific | 15575020 | |
| Zombie Violet Fixable Viability dye | BioLegend | 423113 |
References
- Colucci, F.
- Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. The unique immunological and microbial aspects of pregnancy. Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).
- Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , Elsevier, Academic Press. (2014).
- Filipovic, I., et al. Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus. Nature Communications. 9 (1), 4492 (2018).
- Chen, Z., et al. DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression. Biology of Reproduction. 87 (4), 81 (2012).
- Moffett, A., Colucci, F. Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).
- Gaynor, L. M., Colucci, F. Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice. Frontiers in Immunology. 8, 467 (2017).
- Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M.
- Wilkens, J., et al. Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil. The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon γ contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).
- Crespo, ÂC., et al. Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts. Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).
- Shmeleva, E. V., Colucci, F. Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity. Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).
- Kather, A., et al. Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus. Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).
- Croy, B. A., et al. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods in Molecular Biology. 612, Clifton, N.J. 465-503 (2010).
- Vander lee, S., Boot, L. M.
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Kim, S., et al. Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules. Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Caligioni, C. S.
- Doisne, J. -M., et al. Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells. Journal of Immunology. 195 (8), Baltimore, Md. 3937-3945 (2015).
- Peel, S. Fate of GMG Cells. Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. 115, Springer. Berlin. (1989).
- Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones. Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).
- Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells. Journal of Immunology. 181 (9), Baltimore, Md. 6140-6147 (2008).
