Summary
Ett detaljerat protokoll presenteras här för att beskriva en in vitro-organoidmodell från humana nasala epitelceller. Protokollet har alternativ för mätningar som kräver standard laboratorieutrustning, med ytterligare möjligheter till specialutrustning och programvara.
Abstract
Individualiserad behandling för patienter med cystisk fibros (CF) kan uppnås med en in vitro-sjukdomsmodell för att förstå baseline Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) aktivitet och återställande från småmolekylära föreningar. Vår grupp fokuserade nyligen på att etablera en väl differentierad organoidmodell direkt härledd från primära humana nasala epitelceller (HNE). Histologi av sektionerade organoider, helmonterad immunofluorescerande färgning och avbildning (med användning av konfokalmikroskopi, immunofluorescerande mikroskopi och ljusfält) är väsentliga för att karakterisera organoider och bekräfta epiteldifferentiering som förberedelse för funktionella analyser. Dessutom producerar HNE-organoider lumen av varierande storlek som korrelerar med CFTR-aktivitet, vilket skiljer mellan CF- och icke-CF-organoider. I detta manuskript beskrivs metoden för odling av HNE-organoider i detalj, med fokus på bedömningen av differentiering med hjälp av bildmetoderna, inklusive mätning av baslinjens lumenområde (en metod för CFTR-aktivitetsmätning i organoider som alla laboratorier med mikroskop kan använda) samt det utvecklade automatiserade tillvägagångssättet för en funktionell analys (som kräver mer specialiserad utrustning).
Introduction
Introduktion till tekniken
Ex vivo kulturbaserade analyser är ett alltmer använt verktyg för precisionsmedicin och studier av sjukdomsattofysiologi. Primär human nasal epitelial (HNE) cellodling har använts i många studier av cystisk fibros 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , en autosomal recessiv sjukdom som påverkar epitelcellsfunktionen i flera organ. HNE-kultur ger en förnybar källa till luftvägsepitel som kan erhållas prospektivt och rekapitulerar elektrofysiologiska och biokemiska egenskaper för att testa Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) aktivitet. HNE-celler kan provtas med minimala biverkningar14, liknande vanliga virala andningspinnar. Forskningsarbete som beskriver en modell för cystisk fibrosstudie härledd från HNE-borstbiopsier har nyligen publicerats 11,13. I likhet med andra modeller som använder primär HNE 2,3 och tarmvävnad 15,16,17,18,19 beskrivs här detaljerad karakterisering av differentieringen och avbildningen av denna modell för användning i CF-forskning och för att hjälpa till i studier av andra luftvägssjukdomar 13 . Organoidmodellen är inte obegränsad som odödliga cellinjer utan kan utökas genom villkorlig omprogrammering (med användning av bestrålade och inaktiverade matarfibroblaster och Rho-kinashämmare) till ett mer stamcellsliknande tillstånd 20,21,22,23. Bearbetningen av HNE-borstbiopsier med denna metod ger ett stort antal epitelceller för användning i flera applikationer med högre genomströmning samtidigt som förmågan att differentiera sig helt bibehålls. Medan detta protokoll utvecklades med hjälp av matarceller kan andra metoder användas av utredare som vill undvika matarcellsteknik14,24.
Teknikens betydelse för lungbiologi
En betydande studie har ägnats åt att förstå hur frånvaron av regelbunden, fungerande CFTR i cellmembranet i epitelceller resulterar i dysfunktion i lungorna, bukspottkörteln, levern, tarmen eller andra vävnader. Dysfunktionell epitelial jontransport, särskilt den för klorid och bikarbonat, resulterar i en minskad volym av epitelfodervätskorna och förändringar i slemhinnor, vilket leder till slemhinnor och obstruktion. Vid andra luftvägssjukdomar, såsom primär ciliär dyskinesi, försämrar förändrad ciliär rörelse mukociliär clearance och leder till slemhinnor och obstruktion25. Därför har den nuvarande HNE-organoidmodellen utvecklats för olika tillämpningar, beroende på prövarens experimentella design och resurser. Detta inkluderar live-cell-avbildning med hjälp av levande cellfläckar; fixering och sektionering för att karakterisera morfologin; immunofluorescensfärgning med antikroppar och helmonterad konfokalavbildning för att undvika att störa intraluminala strukturer; och ljusfältsavbildning och mikrooptisk koherenstomografi för kvantitativa mätningar av ciliär slagfrekvens och mukociliär transport13. För att underlätta expansionen till andra utredare användes kommersiellt tillgängliga reagenser och förnödenheter för odling. En funktionell analys utvecklades som använde vanliga mikroskoptekniker och mer specialiserad utrustning. Sammantaget, medan den nuvarande modellen utformades för att bedöma CFTR-aktivitet vid baslinjen eller som svar på terapier, kan de tekniker som beskrivs i detta protokoll tillämpas på andra sjukdomar som involverar epitelcellsfunktion, särskilt epitelcellsvätsketransport.
Jämförelse med andra metoder
Nyligen utvecklades nyttan av denna organoidmodell genom att korrelera CFTR-modulatorsvar in vitro hos patienternas organoider med deras kliniska svar11. I synnerhet visas det också att den nuvarande modellen parallella kortslutningsströmsvar, den nuvarande guldstandarden för bedömning av CFTR-funktionen, hos samma patienter. Kortslutningsström skiljer sig från svullnadsanalysen eftersom den förra mäter CFTR-funktionen via jontransport26. Däremot mäter denna analys en mer nedströms effekt med vätsketransport, vilket ger ytterligare information om den övergripande funktionen av CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortslutningsströmmätningar har fortsatt att vara en vanlig och tillförlitlig metod för att bestämma CFTR-kloridkanalaktivitet 1,33. Dessa elektrofysiologiska analyser kräver specialiserad, dyr utrustning, kräver många gånger fler celler för varje experimentell replikat än organoidanalysen, kan inte enkelt automatiseras och är inte mottagliga för uppskalning för applikationer med högre genomströmning. En annan organoidmodell härledd från tarmepitel har ytterligare fördelar 15,16,17,18, såsom mer utmärkt replikativ förmåga, men härrör varken från en luftvägsvävnad eller är allmänt tillgänglig. HNE-borstningar erhålls med billiga cytologiborstar utan behov av sedering och med minimal risk. Att få borstningen kräver ingen kliniker och kan utföras av utbildade forskningskoordinatorer och annan forskningspersonal14. HNE-organoidmodellen kan odlas av alla laboratorier med primär cellodlingskapacitet, och några av applikationerna kan utföras med standardmikroskopitekniker. Sammantaget ger dessa fördelar ytterligare tillgång till teknik för att bedöma luftvägsepitelfunktionen som annars inte skulle vara tillgänglig för vissa laboratorier. Vidare kan HNE-organoider användas för att studera andra sjukdomstillstånd som påverkar luftvägarna, såsom primär ciliär dyskinesi25 eller virusinfektion, vilket tarmorganoider inte kan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HNE-prover samlades in på Children's of Alabama-sjukhuset. Alla procedurer och metoder som beskrivs här har godkänts av IRB University of Alabama i Birmingham (UAB IRB #151030001). För att underlätta expansionen och förbättra funktionen hos humana nasala epitelceller (HNET) anpassas de nuvarande odlingsmetoderna från den välkända odlingsmetoden för luft-vätskegränssnitt (ALI) 28,34. HRE samlades ursprungligen in genom borstbiopsi som tidigare beskrivits12,14, med den enda skillnaden att använda en cytologiborste. Alla provbehandlingssteg och cellodling utfördes i biosäkerhetsskåpet.
1. Cellodling och expansion av nasala epitelceller
- Efter borstning, förvara näsbiopsiprovet i 8 ml RPMI-media i ett 15 ml koniskt rör på is och överför det till laboratoriet inom 4 timmar (högst 24 timmar).
- Dissociera näsborstbiopsin i 8 ml RPMI-media i ett 15 ml koniskt rör genom att passera cytologiborsten genom en 1 ml stor borrad pipettspets (skär av spetsen) flera gånger tills borsten är fri från vävnad.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 min vid 4 °C, avlägsna supernatanten och suspendera sedan cellpelleten igen i 3 ml cellavskiljningslösning (se materialtabell) och inkubera vid rumstemperatur i 16 minuter för att smälta.
- Använd 5 ml expansionsmedia (tabell 1) för att tvätta cellerna två gånger. Tillsätt sedan celler till en T75-kolv försådd med bestrålade och inaktiverade 3T3-fibroblaster22 (50%-60% sammanflöde) för att samkulturera cellerna och expandera i expansionsmediet i 7-14 dagar (se figur 1 för lämplig koloni). Före användning, testa de bestrålade 3T3-fibroblasterna för att säkerställa att de inte kan föröka sig, vilket kommer att påverka epitelcellsexpansionen negativt.
OBS: Kassera cellerna om nasal epitelcellskonfluensen inte når 70% inom 14 dagar. - För cellerna som härrör från patienter med CF, införa fyra antibiotika (100 μg / ml tobramycin, 2,5 μg / ml amfotericin B, 100 μg / ml ceftazidim, 100 μg / ml vankomycin, se materialtabell) i expansionsmediet för desinfektion av cellerna under de första 3 dagarna av odlingen och ersätt sedan mediet med antibiotikafritt expansionsmedier som ändrar mediet varannan dag.
OBS: Denna begränsade användning av antibiotika är avsedd att minska kulturförlusten på grund av bakteriell kolonisering samtidigt som den uppmuntrar spridning efter att de ytterligare antibiotika har tagits bort. Dessa antibiotika kan skräddarsys efter patientens specifika mikrobiologiska resultat, med känsligheter, om det behövs. - Skörda HRE från samodling med hjälp av dubbel trypsiniseringsmetoden22 när cellerna når cirka 80% sammanflöde. Denna metod säkerställer att de bestrålade och inaktiverade 3T3-fibroblasterna avlägsnas från kolven och att de inte förorenar efterföljande organoidsådd.
- Tvätta cellerna med 1x DPBS och tillsätt sedan 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA i T75-kolven i 4 minuter vid 37 ° C för att avlägsna den bestrålade och inaktiverade 3T3-fibroblasten från odling.
- Skölj T75-kolven med 1x DPBS två gånger för att noggrant tvätta bort eventuella återstående 3T3-fibroblaster; Tillsätt 1,5 ml 0,05 % trypsin-EDTA i T75-kolven i 10 minuter vid 37 °C för att lossa HRE.
- Neutralisera trypsin med sojabönstrypsinhämmare (se Materialtabell) i förhållandet 1:1. Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 minuter och ta sedan bort supernatanten. Efter att ha tvättat cellerna med 5 ml expansionsmedier en gång är cellerna redo för sådd för att odla organoider.
OBS: HRE med ett passagenummer på tre rekommenderas att användas för ytterligare experiment.
2. Tillväxt och differentiering av organoider i bilder och kulturinsatser
- Tina organoidkulturens extracellulära matris (ECM) över natten vid 4 °C. Svala pipettspetsar till 4 °C och 15-brunns angiogenesbilder (se Materialtabell) över natten vid 4 °C.
OBS: ECM bör sättas vid 4 ° C natten innan cellskörden behöver göras. - Belägg rutschkanorna med 5 μL kall 100% ECM på is (pipett 5 μL kall 100% ECM med en kall pipettspets i varje brunn på 15-brunnsrutschkanan) och placera dem sedan i en cellodlingsinkubator vid 37 ° C i minst 30 minuter för konsolidering.
- Räkna de HNE som skördats från samodling med hjälp av en hemocytometer och späd cellerna till 500 celler/μL i totalt antal med 20 % ECM utspätt med differentieringsmedier (tabell 2) på is. Därefter frö 5 μL av den kalla cellen / ECM-blandningen i varje brunn av bilderna belagda med ECM.
- Överför omedelbart bilderna till en odlingsinkubator vid 37 °C i 1 timme för att konsolidera cellen/ECM-blandningen.
- Mata cellerna i varje brunn av 15-brunnsangiogenesbilderna med 50 μL differentieringsmedier. Byt media varannan dag tills organoiderna är redo för ytterligare experiment.
OBS: Organoider kan vanligtvis visualiseras efter 1-2 dagar. Det finns 20-90 organoider som vanligtvis bildas i varje brunn av bilderna. Organoiderna kan vanligtvis överleva i 40-60 dagar i ECM med utfodring varannan dag när de hålls i en fuktad inkubator vid 37 ° C. - Odla organoiderna i odlingsinsatserna (se Materialförteckningen) för större mängd för specifika tillämpningar (såsom sektionering för histologi eller immunofluorescens) enligt stegen som nämns nedan.
- För att odla organoider i odlingsinsatserna, förbered organoidkulturen ECM, pipettspetsar och insatser som nämns i steg 2.1-2.2. Belägg insatserna med 100 μL kall 100% ECM.
- Frö 60 μL cell/ECM-blandning (500 celler/μL med 20 % ECM i differentieringsmedier) ovanpå ECM-beläggningen i insatsen.
OBS: Alla andra steg för att göra organoider i insatserna är desamma som de som utförs i bilderna, steg 2.4-2.5. - Tillsätt 600 μL av differentieringsmediet i den nedre delen av insatsen. Byt media varannan dag tills organoiderna används för experiment, vanligtvis 2-3 veckor.
3. Beredning och isolering av organoider för helmonterad immunofluorescens
- Isolering och fixering av organoider
- Förbehandla 8-brunns glasbottenkammare med celllim (se Materialtabell) i 30 min enligt referens35. Efter kassering av lösningen, lufttorka brunnarna i 30 min.
- För att skörda organoiderna, ta bort mediet från toppen av ECM och tillsätt sedan 50 μL kallt 1x PBS i varje brunn av 15-brunnsglidorna på is (1: 1 med ECM-volym).
- Pipettera upp och ner 3-5 gånger med 200 μL av pipettspetsen med stor borrning och avge sedan lösningen på mitten av en brunn i 8-brunnskammarens glidbanor.
- Ta omedelbart bort överflödig vätska från brunnarna med en finspetspipett. Placera sedan kammarbilden i en 37 ° C inkubator i 40 minuter för att förbättra organoiden som fäster vid glasbotten.
- Efter försiktig tvättning med 1x PBS två gånger, fixera organoiderna med 300 μL 4% paraformaldehyd i varje brunn i 30 min vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta två gånger med 1x PBS och förvara organoiderna i 1x PBS vid 4 °C för immunfärgning i upp till 2 veckor.
- Immunofluorescensfärgning
- För att minska autofluorescensen, tillsätt 250 μL 50 mM NH4Cl i 1x PBS i varje brunn på rutschkanorna vid RT i 30 minuter medan du försiktigt skakar på en shaker vid 20 rpm.
- Efter tvättning med 1x PBS två gånger, permeabilisera cellerna med 0,1% Triton X-100 i 30 min vid RT medan du försiktigt skakar vid 20 rpm.
- Efter tvättning med 1x PBS två gånger, tillsätt 300 μL blockerande lösning, inklusive 5% BSA och 0,1% Triton X-100 i 1x PBS, i varje brunn i 1 timme vid RT.
- Efter tvättning, tillsätt primär antikropp i lämpliga brunnar följt av sekundära antikroppar (se Materialtabell). Förbered primära och sekundära antikroppslösningar i 2% BSA och 0,3% Triton X-100 i 1x PBS. Inkubera alla primära antikroppar vid 4 °C i 2 dagar och alla sekundära antikroppar vid 4 °C i 1 dag.
OBS: De slutliga koncentrationerna är beroende av det protein som önskas för experimentet. Kontrollera lagerkoncentrationen i tillverkarens datablad. Beräkna sedan de slutliga koncentrationerna baserat på de utspädningar som används i materialförteckningen. - Efter inkubation, tvätta brunnarna noggrant med 1x PBS och tillsätt DAPI i 2% BSA och 0,3% Triton X-100 i varje brunn för kärnfärgning.
- Avbilda organoiderna med hjälp av ett konfokal laserskanningsmikroskop, med ett 20-60x oljenedsänkningsmål (se Materialtabell). Använd Z-stack-läget för att ställa in bildens övre och nedre gränser och använd den rekommenderade optimala Z-stegsstorleken som bestäms av konfokalprogramvaran.
FÖLJANDE FYRA KONFOKALA LASER EXCITATIONSVÅGLÄNGDER ANVÄNDES: 408,7 nm, 489,1 nm, 561,7 nm och 637,9 nm.
4. Beredning och isolering av organoider för histologisk sektionering
- För att skörda organoiderna för histologiska studier, ta bort media från kulturen och tillsätt 50 μL kall 1x PBS i varje brunn av glidbanorna på is.
- Pipettera upp och ner tre till fem gånger med en 200 μL pipettspets med stor borrning, kombinera alla lösningar från 15-brunnsrutschbanan eller odlingsinsatserna i ett 15 ml koniskt rör på is. Justera den totala lösningsvolymen i röret till 10 ml genom att tillsätta ytterligare kall 1x PBS.
- Centrifugera röret vid 4 ° C, 300 x g i 5 min; aspirera ut supernatanten och tillsätt 60 μL varm histogel (se Materialtabell) för att blanda med organoidpelleten med en 200 μL av den storborrade pipettspetsen.
- Överför omedelbart suspensionen till en histologiform. Efter konsolidering av histogelen vid rumstemperatur, sätt formblocket i 4% paraformaldehyd för fixering över natten vid 4 ° C.
- Efter inbäddning i paraffin, skär histogelblocket i 5 μm tvärsnitt (till exempel med en mikrotom), fixera sektionerna på glasglas och fläcka med hematoxylin och eosin (H & E) eller immunofluorescensmärkta antikroppar. Ta bilder med ett ljusfältsmikroskop eller inverterat epifluorescensmikroskop (se Materialtabell).
5. Avbildning av levande organoider
OBS: Följande steg utförs med hjälp av ett automatiserat bildsystem (se Materialtabell). Olika bildhanteringssystem måste anpassa dessa steg enligt deras specifika tillverkares instruktioner. Oavsett vilken utrustning som används kräver avbildning av levande organoider en temperaturkontrollerad och fuktad miljökammare med en åtföljande CO2-gasregulator.
- För att övervaka differentieringen av organoider innan du utför en funktionell svullnadsanalys36, ta hela bildbilderna manuellt med valfritt ljusfältsmikroskop eller med ett automatiserat bildsystem, som beskrivs nedan.
- Slå på strömmen till det automatiska bildsystemet och CO2 / O 2-gasregulatorn och låt systemet slutföra den automatiska kalibreringen (~ 30 min).
- När du är klar ställer du in bildsystemets temperatur på 37 °C. tillsätt 15 ml sterilt vatten till befuktningsbehållaren, öppnaCO2-ventilerna , stäng locken och låt bildsystemet förinkubera i minst 30 minuter före avbildning.
- Öppna den automatiska bildprogramvaran för att ställa in ett protokoll för avbildning och välj platsen för att spara råa experimentella data.
OBS: En exempelprotokollfil (kompletterande fil 1), specifik för bildsystemet, har tillhandahållits som en mall för automatiserad avbildning av organoider för att övervaka organoiddifferentiering. - När miljöinställningarna är uppfyllda ska du omedelbart överföra upp till två 15-brunnsrutschbanor med lock till miljökammaren i det automatiska bildsystemets glidhållarinsats (se Materialtabell).
- Välj de brunnar som ska avbildas och börja avbilda för att slutföra avbildningen av de önskade brunnarna.
OBS: De grundläggande rekommenderade inställningarna är: 4x och 10x luftmål, ljusfältskanal, 2 x 2 montage för 4x mål för att täcka hela brunnsområdet, 4 x 4 montage för ett 10x mål. Z-stackinställningar: tre till sex Z-stack-skivor, Z-stegstorlek = 50-100 μm, en till två skivor under autofokuspunkten och tre till fem skivor ovanför.
- För att avbilda levande organoider för användning i en forskolin-inducerad svullnad (FIS) analys, använd ett mikroskop med ett automatiserat stadium utrustat med en miljökontrollerad bildkammare som möjliggör temperatur och CO2 kontroll.
- Börja med steg 5.1.1-5.1.4 och ersätt protokollfilen i steg 5.1.3 med den som finns i exempelprotokollfilen (tilläggsfil 2) som innehåller inställningar som är specifika för att utföra en FIS-analys.
- Före varje experiment justerar du exponeringsinställningarna genom att utvärdera minst tre brunnar för varje bild (längst till vänster, mitten och längst till höger). Applicera X- och Y-koordinatförskjutningarna för att säkerställa att målet kommer att ligga i mitten av brunnen för alla brunnar.
OBS: De grundläggande rekommenderade inställningarna är: 4x luftmål, Kanal 1 = Ljust fält, Kanal 2 = DAPI, 2 x 2 montage (fyra bildplattor). Z-stackinställningar: tre till fyra Z-stack-skivor, Z-stegstorlek = 50-100 μm, en skiva under autofokuspunkten och två till tre skivor ovanför. Bildupptagningstid: 8 timmar med 20 minuters intervall (Totalt antal läsningar = 25; Läs 1 är T = 0). - När alla inställningar är korrekt valda väljer du brunnarna för att avbilda för båda bilderna, eller väljer alla och börjar körningen enligt utrustningens instruktioner.
- När du har kört sparar du experimentet, stänger bildprogramvaran och stänger av bildsystemet37.
6. Baslinje lumenmätningar
OBS: Detta görs med hjälp av manuell bildanalysprogramvara (se Materialtabell). En liknande metod kan följas med hjälp av en programvara med öppen källkod38 eller någon programvara som kan mäta området för en region på en bild.
- I programvaran öppnar du panelen Automatiserad mätning genom att högerklicka längst ned på skärmen, välja Mätning och sedan Automatiserade mätresultat. Området för varje region av intresse (ROI) som mäts kommer att visas där.
- Öppna organoidbilden i programvaran och välj 5-10 organoider med synliga lumen.
OBS: Lumen kommer att vara ett cirkulärt område i mitten av organoiden som är synligt annorlunda i färg än resten av organoiden (figur 2A). - Använd polygon ROI-mätfunktionen, håll högerklicka på bilden för att öppna menyn och välj Polygonal ROI för att beskriva hela organoiden för att få organoidens totala yta (TSA). Använd sedan samma funktion för att beskriva lumenområdet (LA) (Figur 2B).
- Upprepa för de återstående organoiderna i brunnen och alla brunnar i analysen.
- Exportera data till Excel. Dela LA med TSA och genomsnittligt alla organoider från provet för att få Baseline Lumen Ratio (BLR) 11,13.
OBS: Vanligtvis kommer ~ 87% av icke-CF-organoider att ha en BLR över 0,6 och 97% kommer att vara över 0,5, medan endast 14% av CF-organoiderna kommer att ha en BLR över 0,6 och 31% kommer att vara över 0,5.
7. Förbehandling och automatiserad avbildning av HNE-organoider
OBS: Alla förbehandlingssteg utförs i ett rent biosäkerhetsskåp. Förinställ det automatiska bildsystemet och programvaran för registrering av analysen före steg 7.1. Inkubationen med DAPI är valfri men rekommenderas som felsäker om kvaliteten på ljusa fältbilder äventyras. I detta fall kan DAPI-kanalen (377 nm) analyseras istället.
- Förinkubera organoiderna i en brunn med 15-brunnsglidningar med 50 μL differentieringsmedier innehållande DAPI med eller utan 100 μM CFTRinh-172 (se materialtabell) i en 37 °C inkubator i 1 timme. Medan organoiderna inkuberar, utför steg 5.2.1 med hjälp av ett anpassat protokoll för svullnadsanalys efter tilläggsfil 2.
- Ta bort förinkubationsmediet med en Pasteur-pipett av glas med aspiration. Tillsätt 10 μM forskolin och 100 μM IBMX (stimulering cocktails) (se Materialtabell) för en total volym av 50 μL differentiering media i varje brunn.
OBS: Se till att inga bubblor införs i brunnarna. Bubblor på bilderna kommer att påverka den automatiserade analysen. - Utan dröjsmål påbörjar du FIS-avbildningsprotokollet enligt steg 5.2.2 till 5.2.4. Skaffa bilder var 20: e minut i varje brunn, med en total körtid på 8 timmar.
8. Automatiserad analys av forskolin-inducerad svullnad analys på HNE organoider
- Öppna programvaran för automatiserad bildanalys, hitta experimentet som tidigare sparats från steg 7.3 och ta fram bilderna av experimentet.
- Välj det fartygsfönster som ska utvärderas och välj det alternativ som innehåller de bearbetade bilderna som har sytts och z-projicerats. Detta steg bör ge en bild av hela brunnen med alla organoider inom bildramen för maskeringsbedömning och mätningar.
- Välj brunnsbilden för att bedöma. Välj Analysera. Upprepa denna process för andra bilder för att säkerställa lämplig maskering för alla bilder som ingår i de automatiska mätningarna. Spara inställningsparametrarna.
- När du har slutfört analysinställningarna tillämpar du ändringarna. Programvaran kommer att ändra mätningarna baserat på inställningarna.
OBS: När den första bildförbehandlingen är klar bör kvalitetskontrollåtgärder (QC) utföras för att säkerställa konsekvent maskering. Dessa inkluderar manuell granskning av alla brunnar för att säkerställa att organoider ligger inom bildramen, bubblor eller skräp inte är olämpligt maskerade och kontrollerar maskeringen i ljusa fält och DAPI-kanaler. - Exportera data för den sammanfattande analysen (inklusive diagram och statistisk analys).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HNEs expansion är avgörande för en blomstrande organoidkultur. HRE från en framgångsrik provinsamling bör expandera till över 70% sammanflöde runt 10 dagar. Ett exempel på lyckade och misslyckade prover visas i figur 1A respektive figur 1B. Cellerna måste kasseras om de inte kan nå 70% sammanflöde senast 14 dagar efter samodling med bestrålade 3T3-celler. Alla förorenade celler ska omedelbart kasseras om de inte snabbt kan rädda med ytterligare antimikrobiella medel.
Tillväxten av organoiderna jämfördes i 15-brunnsrutschbanor och kulturinsatser. Kulturinsatserna är tjockare och längre från målet än de optiskt optimerade bilderna, vilket påverkar bilden och upplösningen. Trots detta observerades ingen signifikant skillnad i morfologin i dessa två odlingsmetoder, vilket visas i figur 2. Morfologiska skillnader kan ses mellan icke-CF- och CF-organoider, som visas i figur 3A. Icke-CF-organoider tenderar att ha en större lumen som innehåller mer vätska i den. Däremot har CF-organoider vanligtvis en mindre lumen med mindre vätska och är ibland fyllda med slem och skräp. Lumenstorleken mättes manuellt (figur 3B) och baslinjens lumenförhållande beräknades och visades i figur 3C. Tvärsnittsorganoider karakteriserades med användning av H&E och immunofluorescensfärgning. De representativa bilderna visas i figur 4A,B. Luftvägsepitelmarkörer som cilia, slem och tät korsning demonstreras i organoider genom helmonterad immunofluorescerande färgning som visas i figur 5A-D. Beroende på applikation kan sektionerad eller helmonterad immunofluorescens användas. Hela monteringsmetoden upprätthåller organoidens tredimensionella natur och håller organoidens inre intakt, vilket visas i det tidigare publicerade arbetet13.
CFTR-funktionen bedömdes genom forskolin-inducerad svullnad (FIS) analys med hjälp av ett automatiserat bildsystem. Endast 15-brunnsbilder används för funktionella analyser på grund av den bättre bildupplösningen. En representativ forskolin dos-respons experiment av icke-CF frivilliga (n = 5 försökspersoner) visas i figur 6A för att illustrera motiveringen av den optimerade avbildningstiden och analysen. Data som jämför icke-CF- och CF-organoidsvar beskrivs i tidigare publikationer 11,13. Ett dossvar visar den inkrementella förändringen i CFTR-aktiviteten för att visa det bästa sättet att mäta. Analysvaraktighet på 1 h och 8 timmar utvärderades (figur 6B,C) samt analys med användning av genomsnittlig fraktionerad förändring (AFC) kontra arean under kurvan (AUC) ses i figur 6C,D. Baserat på vår tidigare erfarenhet, svullnad för de flesta ämnen och förhållanden platå efter 8 timmar, och i vissa fall resulterar i sprängning av organoiderna under den tiden. Därför var analyserna begränsade till endast 8 timmar. Vid denna förlängda analyslängd blir svullnad icke-linjär. Användningen av AUC tar också hänsyn till både förändringar i storlek och förändringstakt. Därför användes AUC över 8 timmar för alla FIS-analyser i den slutliga metoden.
Figur 1: Ljusfältsbilder av HRE i samkultur. HRE expanderar i expansionsmedier med bestrålade och inaktiverade 3T3-fibroblaster i 10 dagar. Ett inverterat ljusfältmikroskop används för att avbilda cellerna. (A) HRE växer bra i en stor hop (svart pil). Däremot växer HNE: erna i (B) dåligt i två små kluster (svarta pilar) som omger bestrålade 3T3-celler. Skala bar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: HNE-organoidbildning i en 15-brunns glid- och kulturinsats. Ljusfältsbilder av organoider fångades med hjälp av ett inverterat ljusfältmikroskop under 21 dagar. Organoider i 15-brunnsbilden (A) har mer exakta och skarpare bilder än de i kulturinsatsen (B). Ingen morfologisk skillnad observerades mellan organoiderna som odlades i bilden och insatsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Organoid lumenstorlek (panel A) och lumenmått (panel B och C). (A) Icke-CF-organoider har vanligtvis en större lumen och mer vätska än CF (F508del / F508del) organoider. (B) En metod för att manuellt mäta den totala ytan (TSA) som indikeras av den röda konturen och lumenområdet (LA) som indikeras av den gröna konturen i en enda organoid. (C) Ett exempel för att använda den totala ytan och lumenarean för att beräkna baslinjens lumenförhållande (LA: TSA) i organoider från en icke-CF kontra en CF-ämne. Felstaplar representerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Tvärsnitt av organoiderna inbäddade i paraffin. (A) Ett exempel på H&E-färgning i organoider från ett ämne som inte är CF och CF (F508del/F508del). (B) Immunofluorescerande färgning av cilia i en organoid. Grön är cilia (vit pil) färgad med acetylerat tubulin och FITC-märkt sekundär antikropp, och blått är kärnorna märkta med DAPI. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Konfokala bilder av helmonterad immunofluorescens i organoider. (A,C) Maximala projektionsbilder av de två representativa organoiderna. (B,D) Tredimensionella rekonstruktionsbilder av (A) respektive (C). En 8-brunns glasbottenrutschkana monterades på plattformen för ett konfokalmikroskop, och 40x-linsen användes för att skapa fotomikrograferna. Programvara för bildanalys användes för avbildning och rekonstruktion av bilderna. Vita pilar indikerar slem (i B) och cilia (i C) inom organoidernas lumen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Motivering för svullnadsanalysens längd och analysmetoder. Forskolin (FSK)-inducerad svullnad (FIS) analys för att testa CFTR-funktionen på de primära nasala epitelcellerna. Olika doser av forskolin som anges i figurerna administrerades till 21-dagars gamla organoider i differentieringsmediet; organoidsvullnad registrerades omedelbart med den automatiska avbildaren i 8 timmar. Efter 8 timmar visas svullnad i (A) (n = 5, icke-CF-ämnen) med användning av genomsnittlig fraktionerad förändring (AFC). FSK-dosresponsen jämförs med AFC vid 1 h (B) mot vid 8 h (C), vilket tyder på att 8 h-analysen kan ge en mer signifikant svullnadsskillnad mellan olika FSK-doser än de vid 1 h. AFC (C) jämfört med området under kurvan, AUC (D) vid 8 timmar jämförs, vilket indikerar att AUC kan återspegla en mindre svullnadsskillnad än AFC. X-axeln i paneler (B-D) representerar de olika behandlingsförhållanden som motsvarar symbolerna i figurförklaringen. Alla felstaplar i siffrorna indikerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Alla komponenter för att göra expansionsmediet. Detaljerad information om koncentration av reagenslager, lagring av lager, mängden lager för tillverkning av ett 500 ml medium och slutlig koncentration har beskrivits. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Alla komponenter för att göra differentieringsmedier. Detaljerad information om koncentration av reagenslager, lagring av lager, mängden lager för tillverkning av ett 500 ml medium och slutlig koncentration har beskrivits. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande fil 1: En exempelprotokollfil som är specifik för bildsystemet tillhandahålls som en mall för automatiserad avbildning av organoider för att övervaka organoiddifferentiering. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: En exempelprotokollfil som innehåller inställningar som är specifika för att utföra en FIS-analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript ger detaljerade metoder för omfattande levande och fast avbildning av luftvägsepitelorganoiderna härledda från HNE-borstbiopsi. Den beskriver funktionella analyser som kan bestämma CFTR-aktivitet hos en individ. HRE ger en minimalt invasiv, primär vävnad för en mängd olika applikationer. Expansionsteknikerna som erbjuds här kan användas för modellering av luftvägssjukdomar, inklusive organoider. Organoider kan användas för precisionsterapeutiska metoder och för att övervaka stabiliteten hos gen- eller mRNA-baserade terapier över tid, för precisionsprövningsdesign och för att hjälpa till att lösa ofullständiga diagnoser39. Den aktuella forskningen handlar om CF, men dessa modeller har tillämpningar för andra sjukdomar som påverkar epitelfunktionen.
Den initiala expansionen av HNE efter biopsi är avgörande. Det har observerats att cytologiborstar ger större initiala cellnummer och bättre resultat än andra biopsiverktyg14. Från tidigare erfarenheter har vi dragit slutsatsen att kombinera borstningar från båda narerna i ett enda prov och bearbeta det provet inom 4 timmar ger de bästa resultaten. Andra utredare har använt mer utökade tidsramar från biopsi till bearbetning med framgång3. Lämplig initial insamling av biopsier är avgörande för efterföljande expansion och sådd som organoider. Högkvalitativa bestrålade och inaktiverade fibroblaster för samodling krävs, som odlas och behandlas internt i vårt laboratorium men som också kan köpas kommersiellt. Prövare rekommenderas att inte alla 3T3 fibroblaster är samma cellinje och bör valideras före användning.
För prover som inte förväntas ha patogen bakterie- eller svampkultur är antibiotikabehandling begränsad till standard penicillin- och streptomycinbehandling för de experiment som beskrivs i detta manuskript. För dem som är kända för att ha kronisk kolonisering av de övre luftvägarna används en antibiotikacocktail som beskrivs ovan i endast 3 dagar eftersom antibiotika verkar bromsa epitelutvidgningen och ge sämre resultat i de experiment som beskrivs här. Tre dagar valdes ut för att balansera kontamineringsrisken med att ge en liknande expansionstakt för både CF- och icke-CF-prover. För individer med ovanliga patogener kan skräddarsydd antimikrobiell behandling rädda förorenade kulturer om de upptäcks tidigt eller initieras a priori. För initiala biopsier som är ovanligt långsamma att växa, kommer resultaten vanligtvis att vara dåliga för organoidstudier. Utredare måste övervaka både tillväxthastighet och morfologi dagligen. De interna odlingsmedierna och reagenserna som används är mest användbara för funktionella svullnadsanalyser, men andra kommersiellt tillgängliga medier kan gynna andraapplikationer 12,25,40,41 beroende på experimentell design. Den typ av ECM som används kan leda till olika morfologi och olika resultat, och reproducerbara resultat är kritiska. Alla reagenser som används i detta protokoll testas rutinmässigt före användning för experiment. Trots denna erfarenhet kommer vissa kulturer att misslyckas med att expandera eller generera organoider av oförklarliga skäl. Utredare uppmuntras att överväga dessa faktorer när de optimerar detta protokoll för sina applikationer.
En specifik typ av 15-brunns bild används i detta protokoll optimerat för optisk bildbehandling, med minimala volymer och maximering av repliker samtidigt som kostnaderna minskas. Dessa bilder har en nedre och övre kammare fixerad på en polymeröverdragslip som minimerar menisk (vilket annars skulle försämra bildbehandlingen) och även mediersättning utan risk för att lossa matrisen och förstöra organoidkulturerna. Dessa bilder gör ljusfältsavbildning och levande fläckmikroskopi enkel, med initial sådd, tillväxt och avbildning i samma maträtt. Organoider kommer att gå förlorade under insamlings-, fixerings- och färgningsprocessen, så noggrann försiktighet måste vidtas under varje steg och tillräckliga startnummer måste erhållas för att säkerställa framgång. Växande organoider i kulturinsatser kan hjälpa till när dessa tekniker utvecklas.
Avbildningstekniker som använder vanliga laboratoriemikroskop ingår. De automatiserade funktionella analyserna använder dock ett bildsystem som är komplext och kräver en välutbildad användare. Detta protokoll har utvecklats för användare med en grundläggande erfarenhetsnivå med hjälp av detta mikroskop och dess programvara. Det rekommenderas att först utbilda individerna om den primära användningen av instrumentet och programvaran av företrädare för tillverkaren. samma praxis följs i vårt labb. Minst 4 veckors träning behövdes för att använda detta mikroskop effektivt för experiment.
Som beskrivits ovan har denna metod vissa begränsningar. Expertis inom biopsiinsamling, snabb bearbetningstid och anläggning med matarfibroblaster behövs för att framgångsrikt expandera och odla HNE-organoider. Denna metod utvecklades med hjälp av specifika reagenser och utrustning som kanske inte är allmänt tillgängliga. Metodiken har visat sig vara användbar för forskning inom cystisk fibros 3,11,13 och kanske inte är lika tillämplig på andra sjukdomsprocesser25. Andra metoder och utrustning kan dock användas för att utveckla liknande strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JSG är listad som uppfinnare på en patentansökan 20170242033 från University of North Carolina som beskriver en liknande modell. När licensierad teknik från UNC producerar royalties får uppfinnarna en del av intäkterna. Annars förklarar författarna inga intressekonflikter. Finansiärerna hade ingen roll i studiens utformning, i insamlingen, analyserna eller tolkningen av data, i skrivandet av manuskriptet eller i beslutet att publicera resultaten.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt bidragen från alla deltagare som donerade HNE-borstbiopsier för att utveckla detta protokoll. Vi tackar Latona Kersh och children's Research Unit personal för att samordna rekrytering av studievolontärer och provsamlingar. Vi tackar Lily Deng, Johnathan Bailey och Stephen Mackay, tidigare praktikanter i vårt laboratorium, för teknisk hjälp. Vi tackar Zhong Liu och Rui Zhao för deras tekniska hjälp. Steven M. Rowe, chef för CF Research Center vid UAB, tillhandahåller ledarskap och resurser, utan vilka detta arbete inte skulle vara möjligt. Vi vill också tacka Sarah Guadiana på Biotek för hjälp med instrumentutbildning, Robert Grabski för konfokalmikroskopihjälp vid UAB High-Resolution Imaging Facility och Dezhi Wang för histologisk hjälp vid UAB Histology Core. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (till JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (till JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 och DK072482 och CFF University of Alabama i Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)] och UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , Discovery Labware, Inc. Bedford, MA. (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
