Summary
يتم تقديم بروتوكول مفصل هنا لوصف نموذج عضوي في المختبر من الخلايا الظهارية الأنفية البشرية. ويتضمن البروتوكول خيارات للقياسات التي تتطلب معدات مختبرية قياسية، مع إمكانيات إضافية للمعدات والبرامجيات المتخصصة.
Abstract
يمكن تحقيق العلاج الفردي لمرضى التليف الكيسي (CF) من خلال نموذج مرض في المختبر لفهم نشاط منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR) الأساسي واستعادته من مركبات الجزيئات الصغيرة. ركزت مجموعتنا مؤخرا على إنشاء نموذج عضوي متمايز بشكل جيد مشتق مباشرة من الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية (HNE). تعد أنسجة المواد العضوية المجزأة ، وتلطيخ الفلورسنت المناعي الكامل ، والتصوير (باستخدام المجهر البؤري ، والمجهر المناعي الفلوري ، والمجال الساطع) ضرورية لتوصيف المواد العضوية وتأكيد التمايز الظهاري استعدادا للفحوصات الوظيفية. علاوة على ذلك ، تنتج المواد العضوية HNE لومن بأحجام مختلفة ترتبط بنشاط CFTR ، وتميز بين المواد العضوية CF وغير CF. في هذه المخطوطة، يتم وصف منهجية زراعة المواد العضوية ذات الكثافة العالية جدا بالتفصيل، مع التركيز على تقييم التمايز باستخدام طرائق التصوير، بما في ذلك قياس منطقة التجويف الأساسية (وهي طريقة لقياس نشاط CFTR في المواد العضوية التي يمكن لأي مختبر لديه مجهر استخدامها) بالإضافة إلى النهج الآلي المطور للفحص الوظيفي (الذي يتطلب معدات أكثر تخصصا).
Introduction
مقدمة في هذه التقنية
تعد الفحوصات القائمة على الثقافة خارج الجسم الحي أداة تستخدم بشكل متزايد للطب الدقيق ودراسة الفيزيولوجيا المرضية للأمراض. تم استخدام زراعة الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية (HNE) في العديد من الدراسات حول التليف الكيسي 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ، وهو مرض صبغي جسدي متنحي يؤثر على وظيفة الخلايا الظهارية في أعضاء متعددة. توفر زراعة HNE مصدرا متجددا لظهارة مجرى الهواء التي يمكن الحصول عليها بشكل مستقبلي وتلخص الصفات الكهروفسيولوجية والكيميائية الحيوية لاختبار نشاط منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR). يمكن أخذ عينات من خلايا HNE مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية14 ، على غرار مسحات الجهاز التنفسي الفيروسية الشائعة. تم نشر عمل بحثي يصف نموذجا لدراسة التليف الكيسي المستمد من خزعات فرشاة HNE مؤخرا11,13. على الرغم من أنها مشابهة للنماذج الأخرى التي تستخدم HNE 2,3 الأولي والأنسجة المعوية 15,16,17,18,19 ، إلا أن التوصيف التفصيلي للتمايز والتصوير لهذا النموذج موصوف هنا للاستخدام في أبحاث التليف الكيسي وللمساعدة في دراسات أمراض الشعب الهوائية الأخرى 13 . النموذج العضوي ليس غير محدود مثل خطوط الخلايا المخلدة ولكن يمكن توسيعه عن طريق إعادة البرمجة الشرطية (باستخدام الخلايا الليفية المغذية المشععة والمعطلة ومثبطات Rho-kinase) إلى حالة أكثر شبها بالخلايا الجذعية20،21،22،23. إن معالجة خزعات فرشاة HNE باستخدام هذه الطريقة تنتج أعدادا كبيرة من الخلايا الظهارية لاستخدامها في تطبيقات متعددة بإنتاجية أعلى مع الاحتفاظ بالقدرة على التمييز بشكل كامل. في حين تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام الخلايا المغذية ، يمكن استخدام منهجيات أخرى من قبل الباحثين الذين يرغبون في تجنب تكنولوجيا الخلايا المغذية14,24.
أهمية هذه التقنية للبيولوجيا الرئوية
تم تكريس دراسة مهمة لفهم كيف أن غياب CFTR المنتظم والفعال في غشاء الخلية للخلايا الظهارية يؤدي إلى خلل وظيفي في الرئتين أو البنكرياس أو الكبد أو الأمعاء أو الأنسجة الأخرى. يؤدي النقل الأيوني الظهاري المختل وظيفيا ، وخاصة الكلوريد والبيكربونات ، إلى انخفاض حجم سوائل البطانة الظهارية وتغيرات في الإفرازات المخاطية ، مما يؤدي إلى الركود المخاطي والانسداد. في أمراض مجرى الهواء الأخرى ، مثل خلل الحركة الهدبي الأولي ، تضعف الحركة الهدبية المتغيرة إزالة الغشاء المخاطي الهدبي وتؤدي إلى الركود المخاطي والانسداد25. لذلك ، تم تطوير نموذج HNE العضوي الحالي لتطبيقات مختلفة ، اعتمادا على التصميم التجريبي للباحث وموارده. وهذا يشمل تصوير الخلايا الحية باستخدام بقع الخلايا الحية. التثبيت والتقسيم لتوصيف المورفولوجيا ؛ تلطيخ التألق المناعي بالأجسام المضادة والتصوير البؤري الكامل لتجنب تعطيل الهياكل داخل اللمعان ؛ والتصوير المقطعي بالحقل الساطع والتصوير المقطعي بالتماسك البصري الدقيق للقياسات الكمية لتردد الضربات الهدبية والنقل المخاطي الهدبي13. ولتسهيل التوسع ليشمل محققين آخرين، استخدمت الكواشف واللوازم المتاحة تجاريا للزراعة. تم تطوير فحص وظيفي يستخدم تقنيات المجهر الشائعة والمعدات الأكثر تخصصا. بشكل عام ، في حين تم تصميم النموذج الحالي لتقييم نشاط CFTR عند خط الأساس أو استجابة للعلاجات ، يمكن تطبيق التقنيات الموصوفة في هذا البروتوكول على الأمراض الأخرى التي تنطوي على وظيفة الخلية الظهارية ، وخاصة نقل سوائل الخلايا الظهارية.
مقارنة مع المنهجيات الأخرى
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير فائدة هذا النموذج العضوي من خلال الربط في المختبر بين استجابات معدل CFTR للعضويات للمرضى مع استجابتهم السريرية11. ومن الجدير بالذكر أنه ثبت أيضا أن النموذج الحالي يوازي استجابات تيار الدائرة القصيرة ، وهو المعيار الذهبي الحالي لتقييم وظيفة CFTR ، في نفس المرضى. يختلف تيار الدائرة القصيرة عن فحص التورم لأن الأول يقيس وظيفة CFTR عبر النقل الأيوني26. في المقابل ، يقيس هذا الفحص تأثيرا أكثر في اتجاه المصب مع نقل السوائل ، مما يوفر معلومات إضافية حول الوظيفة الإجمالية ل CFTR27،28،29،30،31،32. ظلت قياسات تيار الدائرة القصيرة طريقة شائعة وموثوقة لتحديد نشاط قناة كلوريد CFTR 1,33. تتطلب هذه الفيزيولوجيا الكهربية معدات متخصصة ومكلفة ، وتتطلب خلايا أكثر بعدة مرات لكل نسخة تجريبية من الفحص العضوي ، ولا يمكن أتمتتها بسهولة ، وليست قابلة للتوسع لتطبيقات الإنتاجية الأعلى. نموذج عضوي آخر مشتق من ظهارة الأمعاء له مزايا إضافية 15،16،17،18 ، مثل قدرة تكرارية أكثر ممتازة ، ولكنه غير مشتق من أنسجة مجرى الهواء ولا هو متاح عالميا. يتم الحصول على فرش HNE باستخدام فرش خلوية غير مكلفة دون الحاجة إلى التخدير وبأقل قدر من المخاطر. لا يتطلب الحصول على التنظيف بالفرشاة طبيبا سريريا ويمكن القيام به من قبل منسقي الأبحاث المدربين وغيرهم من موظفي الأبحاث14. يمكن استزراع نموذج HNE العضوي من قبل أي مختبر لديه قدرات زراعة الخلايا الأولية ، ويمكن إجراء بعض التطبيقات باستخدام تقنيات الفحص المجهري القياسية. وإجمالا، توفر هذه المزايا وصولا إضافيا إلى التكنولوجيا اللازمة لتقييم الوظيفة الظهارية لمجرى الهواء التي قد لا تكون متاحة لبعض المختبرات. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام عضويات HNE لدراسة الحالات المرضية الأخرى التي تؤثر على مجرى الهواء ، مثل خلل الحركة الهدبي الأولي25 أو العدوى الفيروسية ، والتي لا تستطيع المواد العضوية المعوية القيام بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع عينات HNE في مستشفى الأطفال في ألاباما. تمت الموافقة على جميع الإجراءات والأساليب الموضحة هنا من قبل جامعة IRB في ألاباما في برمنغهام (UAB IRB # 151030001). لتسهيل التوسع وتحسين وظيفة الخلايا الظهارية الأنفية البشرية (HNEs) ، يتم تكييف طرق الزراعة الحالية من طريقة زراعة واجهة الهواء السائل المعروفة (ALI)28,34. تم جمع HNEs في البداية عن طريق خزعة الفرشاة كما هو موضح سابقا 12,14 ، مع الفرق الوحيد هو استخدام فرشاة علم الخلايا. ونفذت جميع خطوات تجهيز العينات وزراعة الخلايا في خزانة السلامة الأحيائية.
1. زراعة الخلايا وتوسيع الخلايا الظهارية الأنفية
- بعد تنظيف الأسنان بالفرشاة، قم بتخزين عينة خزعة الأنف في 8 مل من وسائط RPMI في أنبوب مخروطي سعة 15 مل على الجليد ونقلها إلى المختبر في غضون 4 ساعات (لا تزيد عن 24 ساعة).
- افصل خزعة فرشاة الأنف إلى 8 مل من وسائط RPMI في أنبوب مخروطي 15 مل عن طريق تمرير فرشاة علم الخلايا من خلال طرف ماصة كبيرة التجويف 1 مل (قطع الطرف) عدة مرات حتى تصبح الفرشاة خالية من الأنسجة.
- قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة supernatant ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 3 مل من محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 دقيقة للهضم.
- استخدم 5 مل من وسائط التمدد (الجدول 1) لغسل الخلايا مرتين. ثم ، أضف خلايا إلى قارورة T75 مسبقة البذور مع الخلايا الليفية 3T3 المشععة والمعطلة22 (التقاء 50٪ -60٪) للمشاركة في زراعة الخلايا والتوسع في وسائط التمدد لمدة 7-14 يوما (انظر الشكل 1 للمستعمرة المناسبة). قبل الاستخدام ، اختبر الخلايا الليفية 3T3 المشععة للتأكد من أنها لا يمكن أن تتكاثر ، مما سيؤثر سلبا على توسع الخلايا الظهارية.
ملاحظة: تخلص من الخلايا إذا لم يصل التقاء الخلايا الظهارية الأنفية إلى 70٪ في غضون 14 يوما. - بالنسبة للخلايا المشتقة من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي ، أدخل أربعة مضادات حيوية (100 ميكروغرام / مل من توبراميسين ، 2.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B ، 100 ميكروغرام / مل من سيفتازيديم ، 100 ميكروغرام / مل من الفانكومايسين ، انظر جدول المواد) في وسائط التمدد لتطهير الخلايا لأول 3 أيام من الثقافة ، ثم استبدل الوسائط بوسائط توسع خالية من المضادات الحيوية تغير الوسائط كل يومين.
ملاحظة: يهدف هذا الاستخدام المحدود للمضادات الحيوية إلى تقليل فقدان الثقافة بسبب الاستعمار البكتيري مع تشجيع الانتشار بعد إزالة المضادات الحيوية الإضافية. يمكن تصميم هذه المضادات الحيوية وفقا لنتائج علم الأحياء الدقيقة المحددة للمريض ، مع الحساسيات ، إذا لزم الأمر. - حصاد HNEs من الزراعة المشتركة باستخدام طريقة التربسين المزدوج22 بمجرد وصول الخلايا إلى التقاء 80٪ تقريبا. تضمن هذه الطريقة إزالة الخلايا الليفية 3T3 المشععة والمعطلة من القارورة ، ولا تلوث البذر العضوي اللاحق.
- اغسل الخلايا ب 1x DPBS ، ثم أضف 1.5 مل من 0.05٪ من التربسين-EDTA إلى قارورة T75 لمدة 4 دقائق عند 37 درجة مئوية لإزالة الخلايا الليفية 3T3 المشععة والمعطلة من الثقافة.
- شطف قارورة T75 مع 1x DPBS مرتين لغسل أي الخلايا الليفية المتبقية 3T3 تماما. أضف 1.5 مل من 0.05٪ من التربسين-EDTA إلى قارورة T75 لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل HNEs.
- تحييد التربسين باستخدام مثبط التربسين فول الصويا (انظر جدول المواد) بنسبة 1: 1. الطرد المركزي للخلايا في 500 × غرام لمدة 5 دقائق، ومن ثم إزالة supernatant. بعد غسل الخلايا ب 5 مل من وسائط التمدد مرة واحدة ، تكون الخلايا جاهزة للبذر لزراعة المواد العضوية.
ملاحظة: يوصى باستخدام HNEs ذات المقطع رقم ثلاثة في مزيد من التجارب.
2. نمو وتمايز المواد العضوية في الشرائح وإدراج الثقافة
- قم بإذابة المصفوفة خارج الخلية العضوية (ECM) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. نصائح ماصة باردة إلى 4 درجات مئوية و 15 بئر شرائح تولد الأوعية الدموية (انظر جدول المواد) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يجب وضع ECM عند 4 درجات مئوية في الليلة التي تسبق حصاد الخلايا. - قم بتغطية الشرائح ب 5 ميكرولتر من ECM البارد بنسبة 100٪ على الجليد (ماصة 5 ميكرولتر من ECM البارد 100٪ مع طرف ماصة بارد في كل بئر من شريحة 15 بئرا) ، ثم ضعها في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل للتوحيد.
- عد HNEs التي تم حصادها من الزراعة المشتركة باستخدام مقياس الدم الخلوي وقم بتخفيف الخلايا إلى 500 خلية / ميكرولتر في العدد الإجمالي مع 20٪ ECM مخفف بواسطة وسائط التمايز (الجدول 2) على الجليد. ثم ، البذور 5 ميكرولتر من خليط الخلية الباردة / ECM في كل بئر من الشرائح المغلفة ب ECM.
- انقل الشرائح على الفور إلى حاضنة استزراع عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لدمج خليط الخلية / ECM.
- تغذية الخلايا في كل بئر من شرائح تولد الأوعية الدموية 15 بئرا مع 50 ميكرولتر من وسائط التمايز. قم بتغيير الوسائط كل يومين حتى تصبح المواد العضوية جاهزة لمزيد من التجارب.
ملاحظة: يمكن عادة تصور المواد العضوية بعد 1-2 أيام. هناك 20-90 عضويات تتشكل عادة في كل بئر من الشرائح. يمكن للعضويات عادة البقاء على قيد الحياة لمدة 40-60 يوما في ECM مع التغذية كل يوم عند الاحتفاظ بها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية. - زراعة المواد العضوية في المزرعة (انظر جدول المواد) للحصول على كمية أكبر لتطبيقات محددة (مثل التقسيم لعلم الأنسجة أو التألق المناعي) وفقا للخطوات المذكورة أدناه.
- لزراعة المواد العضوية في إدراج الثقافة ، قم بإعداد ECM للثقافة العضوية ، ونصائح الماصة ، والإدراج كما هو مذكور في الخطوات 2.1-2.2. قم بتغطية الإدخالات ب 100 ميكرولتر من ECM البارد بنسبة 100٪.
- بذور 60 ميكرولتر من خليط الخلايا / ECM (500 خلية / ميكرولتر مع 20٪ ECM في وسائط التمايز) فوق طلاء ECM في الإدراج.
ملاحظة: كافة الخطوات الأخرى لصنع المواد العضوية في الإدخالات هي نفسها التي أجريت في الشرائح، الخطوات 2.4-2.5. - أضف 600 ميكرولتر من وسائط التمايز إلى الجزء السفلي من الإدراج. قم بتغيير الوسائط كل يوم بديل حتى يتم استخدام المواد العضوية للتجارب ، عادة 2-3 أسابيع.
3. إعداد وعزل المواد العضوية للتألق المناعي الكامل
- عزل وتثبيت المواد العضوية
- قم بالمعالجة المسبقة لشرائح الغرفة ذات القاع الزجاجي المكون من 8 آبار باستخدام مادة لاصقة للخلايا (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة بعد المرجع35. بعد التخلص من المحلول ، جفف الآبار في الهواء لمدة 30 دقيقة.
- لحصاد المواد العضوية ، قم بإزالة الوسائط من أعلى ECM ، ثم أضف 50 ميكرولتر من PBS البارد 1x في كل بئر من الشرائح المكونة من 15 بئرا على الجليد (1: 1 مع حجم ECM).
- ماصة لأعلى ولأسفل 3-5 مرات باستخدام 200 ميكرولتر من طرف ماصة التجويف الكبير ، ثم قم بتوزيع المحلول على وسط بئر من شرائح الغرفة المكونة من 8 آبار.
- قم بإزالة السائل الزائد على الفور من الآبار بواسطة ماصة ذات طرف رفيع. ثم ، ضع شريحة الغرفة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لتعزيز التصاق العضوي بالقاع الزجاجي.
- بعد الغسيل بلطف باستخدام 1x PBS مرتين ، قم بإصلاح المواد العضوية ب 300 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde في كل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- يغسل مرتين مع 1x PBS ويخزن المواد العضوية في 1x PBS في 4 درجات مئوية للتلطيخ المناعي لمدة تصل إلى أسبوعين.
- تلطيخ التألق المناعي
- لتقليل التألق التلقائي ، أضف 250 ميكرولتر من 50 mM NH4Cl في 1x PBS في كل بئر من الشرائح في RT لمدة 30 دقيقة أثناء الاهتزاز بلطف على الاهتزاز عند 20 دورة في الدقيقة.
- بعد الغسيل باستخدام 1x PBS مرتين ، تخلل الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X-100 لمدة 30 دقيقة في RT بينما تهتز بلطف عند 20 دورة في الدقيقة.
- بعد الغسيل باستخدام 1x PBS مرتين ، أضف 300 ميكرولتر من محلول الحجب ، بما في ذلك 5٪ BSA و 0.1٪ Triton X-100 في 1x PBS ، في كل بئر لمدة 1 ساعة في RT.
- بعد الغسيل ، أضف الأجسام المضادة الأولية إلى الآبار المناسبة تليها الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد). تحضير حلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية في 2٪ BSA و 0.3٪ Triton X-100 في 1x PBS. احتضان جميع الأجسام المضادة الأولية في 4 درجة مئوية لمدة 2 أيام وجميع الأجسام المضادة الثانوية في 4 درجة مئوية لمدة 1 يوم.
ملاحظة: تعتمد التركيزات النهائية على البروتين المطلوب للتجربة. يرجى التحقق من تركيز المخزون على ورقة بيانات الشركة المصنعة. ثم احسب التركيزات النهائية بناء على التخفيفات المستخدمة في جدول المواد. - بعد الحضانة ، اغسل الآبار جيدا باستخدام 1x PBS وأضف DAPI في 2٪ BSA و 0.3٪ Triton X-100 في كل بئر للتلطيخ النووي.
- قم بتصوير المواد العضوية باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري ، مع هدف غمر الزيت 20-60x (انظر جدول المواد). استخدم وضع Z-stack لتعيين الحدود العلوية والسفلية للصورة واستخدم حجم الخطوة Z الأمثل الموصى به الذي يحدده البرنامج البؤري.
ملاحظة: تم استخدام الأطوال الموجية الأربعة التالية لإثارة الليزر متحد البؤرة: 408.7 نانومتر، 489.1 نانومتر، 561.7 نانومتر، و637.9 نانومتر.
4. إعداد وعزل المواد العضوية للتقسيم النسيجي
- لحصاد المواد العضوية للدراسات النسيجية ، قم بإزالة الوسائط من الثقافة وإضافة 50 ميكرولتر من 1x PBS البارد في كل بئر من الشرائح على الجليد.
- ماصة لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات باستخدام طرف ماصة كبيرة التجويف 200 ميكرولتر ، اجمع بين جميع الحلول من الشريحة أو البئر 15 بئرا أو إدراج الثقافة في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد. اضبط إجمالي حجم المحلول في الأنبوب إلى 10 مل عن طريق إضافة 1x PBS بارد إضافي.
- جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 4 درجات مئوية ، 300 × جم لمدة 5 دقائق ؛ قم بشفط السوبر ناتانت وأضف 60 ميكرولتر من الهيستوجيل الدافئ (انظر جدول المواد) لمزجه مع الكريات العضوية باستخدام 200 ميكرولتر من طرف الماصة ذات التجويف الكبير.
- نقل التعليق على الفور إلى قالب الأنسجة. بعد توحيد الهيستوجيل في درجة حرارة الغرفة ، ضع كتلة القالب في 4٪ paraformaldehyde للتثبيت بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- بعد التضمين في البارافين ، قم بقطع كتلة الهيستوجيل إلى مقاطع عرضية 5 ميكرومتر (على سبيل المثال ، باستخدام ميكروتومي) ، وقم بإصلاح الأقسام على شرائح زجاجية ، وقم بالصبغ باستخدام الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) أو الأجسام المضادة التي تحمل علامة التألق المناعي. التقط صورا باستخدام مجهر المجال الساطع أو المجهر المقلوب فوق الفلوري (انظر جدول المواد).
5. تصوير المواد العضوية الحية
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام نظام تصوير آلي (انظر جدول المواد). تحتاج أنظمة التصوير المختلفة إلى تكييف هذه الخطوات باتباع تعليمات الشركة المصنعة الخاصة بها. بغض النظر عن المعدات المستخدمة ، يتطلب تصوير المواد العضوية الحية غرفة بيئية يتم التحكم في درجة حرارتها وترطيبها مع وحدة تحكم في غاز CO2 مصاحبة.
- لمراقبة تمايز المواد العضوية قبل إجراء فحص التورم الوظيفي36 ، التقط صور الشريحة بأكملها يدويا باستخدام أي مجهر ساطع المجال أو باستخدام نظام تصوير آلي ، كما هو مفصل أدناه.
- قم بتشغيل الطاقة إلى نظام التصوير الآلي ووحدة التحكم في الغاز CO 2 / O2 واسمح للنظام بإكمال المعايرة الآلية (~ 30 دقيقة).
- بعد الانتهاء ، اضبط درجة حرارة نظام التصوير على 37 درجة مئوية ؛ أضف 15 مل من الماء المعقم إلى خزان الترطيب ، وافتح صمامات CO2 ، وأغلق الأغطية ، واترك نظام التصوير يحضن مسبقا لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل التصوير.
- افتح برنامج التصوير الآلي لإعداد بروتوكول للتصوير واختر الموقع لحفظ البيانات التجريبية الأولية.
ملاحظة: تم توفير مثال على ملف البروتوكول (الملف التكميلي 1)، الخاص بنظام التصوير، كنموذج للتصوير الآلي للعضويات لمراقبة التمايز العضوي. - بمجرد استيفاء الإعدادات البيئية، انقل على الفور ما يصل إلى شريحتين من 15 بئرا مع أغطية إلى الغرفة البيئية في إدراج حامل الشرائح لنظام الصور الآلي (انظر جدول المواد).
- حدد الآبار المراد تصويرها وابدأ التصوير لإكمال تصوير الآبار المطلوبة.
ملاحظة: الإعدادات الأساسية الموصى بها هي: هدف الهواء 4x و 10x ، قناة المجال الساطع ، مونتاج 2 × 2 لهدف 4x لتغطية منطقة البئر بأكملها ، 4 × 4 مونتاج لهدف 10x. إعدادات مكدس Z: ثلاث إلى ست شرائح مكدسة Z، حجم الخطوة Z = 50-100 ميكرومتر، شريحة إلى شريحتين أسفل نقطة التركيز البؤري التلقائي، وثلاث إلى خمس شرائح أعلاه.
- لتصوير المواد العضوية الحية لاستخدامها في فحص التورم الناجم عن الفورسكولين (FIS) ، استخدم المجهر مع مرحلة آلية مجهزة بغرفة تصوير يتم التحكم فيها بيئيا تسمح بالتحكم في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون2 .
- ابدأ بالخطوات 5.1.1-5.1.4، استبدل ملف البروتوكول في الخطوة 5.1.3 بالملف المتوفر في ملف البروتوكول المثال (الملف التكميلي 2) الذي يحتوي على إعدادات محددة لإجراء فحص FIS.
- قبل كل تجربة، اضبط إعدادات التعرض من خلال تقييم ثلاثة آبار على الأقل لكل شريحة (أقصى اليسار والوسط وأقصى اليمين). قم بتطبيق إزاحات الإحداثيات X و Y للتأكد من أن الهدف سيكون في وسط البئر لجميع الآبار.
ملاحظة: الإعدادات الأساسية الموصى بها هي: 4x air objective, Channel 1 = Bright Field, Channel 2 = DAPI, 2 x 2 montage (أربعة مربعات صور). إعدادات مكدس Z: من ثلاث إلى أربع شرائح من Z-stack، وحجم الخطوة Z = 50-100 ميكرومتر، وشريحة واحدة أسفل نقطة التركيز البؤري التلقائي وشريحتين إلى ثلاث شرائح أعلاه. وقت الحصول على الصورة: 8 ساعات مع فترات زمنية مدتها 20 دقيقة (إجمالي القراءات = 25; قراءة 1 هي T = 0). - بمجرد تحديد جميع الإعدادات بشكل مناسب ، اختر الآبار لتصويرها لكلتا الشريحتين ، أو حدد الكل ، وابدأ التشغيل وفقا لتعليمات الجهاز.
- بعد التشغيل ، احفظ التجربة ، وأغلق برنامج التصوير ، وأغلق نظام التصوير37.
6. قياسات التجويف الأساسية
ملاحظة: يتم ذلك باستخدام برنامج تحليل التصوير اليدوي (انظر جدول المواد). يمكن اتباع منهجية مماثلة باستخدام برنامج مفتوح المصدر38 أو أي برنامج يمكنه قياس مساحة المنطقة على صورة.
- في البرنامج، افتح لوحة القياس التلقائي بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق أسفل الشاشة، وحدد القياس، ثم نتائج القياس التلقائي. ستظهر منطقة كل منطقة اهتمام (ROI) تم قياسها هناك.
- افتح الصورة العضوية في البرنامج وحدد 5-10 عضويات مع لومن مرئي.
ملاحظة: سيكون التجويف منطقة دائرية في منتصف العضو تختلف لونها بشكل واضح عن بقية الأعضاء (الشكل 2A). - باستخدام ميزة قياس عائد الاستثمار المضلع ، انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة لفتح القائمة وحدد عائد استثمار مضلع لتحديد إجمالي العضوية للحصول على إجمالي مساحة السطح العضوي (TSA). ثم باستخدام نفس الميزة ، حدد منطقة التجويف (LA) (الشكل 2B).
- كرر ذلك للعضويات المتبقية في البئر وجميع الآبار في الفحص.
- تصدير البيانات إلى Excel. اقسم LA على TSA ومتوسط جميع المواد العضوية من العينة للحصول على نسبة التجويف الأساسية (BLR) 11,13.
ملاحظة: عادة ، سيكون لدى ~ 87٪ من المواد العضوية غير CF BLR أكثر من 0.6 ، و 97٪ سيكون أكثر من 0.5 ، في حين أن 14٪ فقط من المواد العضوية CF سيكون لها BLR أكثر من 0.6 ، و 31٪ ستكون أكثر من 0.5.
7. المعالجة المسبقة والتصوير الآلي للعضويات HNE
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات ما قبل المعالجة في خزانة نظيفة للسلامة الأحيائية. قم بإعداد نظام التصوير الآلي مسبقا وبرنامج تسجيل الفحص قبل الخطوة 7.1. الحضانة باستخدام DAPI اختيارية ولكن يوصى بها باعتبارها آمنة من الفشل إذا تم اختراق جودة صور المجال الساطع. في هذه الحالة ، يمكن تحليل قناة DAPI (377 نانومتر) بدلا من ذلك.
- قبل احتضان المواد العضوية في بئر من 15 بئرا مع 50 ميكرولتر من وسائط التمايز التي تحتوي على DAPI مع أو بدون 100 ميكرومتر من CFTRinh-172 (انظر جدول المواد) في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. أثناء احتضان المواد العضوية، قم بتنفيذ الخطوة 5.2.1 باستخدام بروتوكول مخصص لفحص التورم بعد الملف التكميلي 2.
- قم بإزالة وسط ما قبل الحضانة باستخدام ماصة باستور الزجاجية مع الشفط. أضف 10 ميكرومتر من الفورسكولين و 100 ميكرومتر من IBM (كوكتيلات التحفيز) (انظر جدول المواد) للحصول على حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر من وسائط التمايز في كل بئر.
ملاحظة: تأكد من عدم إدخال أي فقاعات في الآبار. ستؤثر الفقاعات الموجودة على الصور على التحليل الآلي. - دون تأخير، ابدأ بروتوكول التصوير FIS باتباع الخطوة 5.2.2 إلى 5.2.4. احصل على صور كل 20 دقيقة في كل بئر ، مع وقت تشغيل إجمالي يبلغ 8 ساعات.
8. التحليل الآلي لفحص التورم الناجم عن الفورسكولين على المواد العضوية HNE
- افتح برنامج تحليل التصوير الآلي، وابحث عن التجربة المحفوظة مسبقا من الخطوة 7.3، وأظهر صور التجربة.
- اختر نافذة السفينة المراد تقييمها وحدد الخيار الذي يحتوي على الصور المعالجة التي تم خياطتها وعرضها z. يجب أن توفر هذه الخطوة صورة للبئر بأكمله مع جميع المواد العضوية داخل إطار التصوير لإخفاء التقييم والقياسات.
- اختر صورة البئر لتقييمها. حدد تحليل. كرر هذه العملية للصور الأخرى لضمان الإخفاء المناسب لجميع الصور المضمنة في القياسات التلقائية. احفظ معلمات الإعداد.
- بعد الانتهاء من إعدادات التحليل، قم بتطبيق التغييرات. سيقوم البرنامج بتغيير القياسات بناء على الإعدادات.
ملاحظة: بعد اكتمال المعالجة المسبقة الأولية للصورة، يجب تنفيذ تدابير مراقبة الجودة (QC) لضمان الإخفاء المتسق. ويشمل ذلك مراجعة جميع الآبار يدويا للتأكد من أن المواد العضوية داخل إطار التصوير ، أو الفقاعات أو الحطام ليست مقنعة بشكل غير مناسب ، والتحقق من الإخفاء في قنوات المجال الساطع و DAPI. - تصدير البيانات للتحليل الموجز (بما في ذلك الرسوم البيانية والتحليل الإحصائي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعد توسيع HNEs أمرا ضروريا لثقافة عضوية مزدهرة. يجب أن تتوسع HNEs من جمع عينات ناجح إلى أكثر من 70٪ من الالتقاء حوالي 10 أيام. ويرد مثال على العينات الناجحة وغير الناجحة في الشكل 1 ألف والشكل 1 باء، على التوالي. يجب التخلص من الخلايا إذا لم تتمكن من الوصول إلى التقاء 70٪ بحلول 14 يوما بعد الزراعة المشتركة مع خلايا 3T3 المشععة. يجب التخلص من أي خلايا ملوثة على الفور إذا لم تتمكن من الإنقاذ بعوامل إضافية مضادة للميكروبات بسرعة.
تمت مقارنة نمو المواد العضوية في شرائح 15 بئرا وإدراج الثقافة. تعتبر إدراجات الثقافة أكثر سمكا وأبعد عن الهدف من الشرائح المحسنة بصريا ، مما يؤثر على الصورة والدقة. على الرغم من ذلك ، لم يلاحظ أي اختلاف كبير في المورفولوجيا في هاتين الطريقتين الثقافيتين ، كما هو موضح في الشكل 2. يمكن رؤية الاختلافات المورفولوجية بين المواد العضوية غير CF و CF ، كما هو موضح في الشكل 3A. تميل المواد العضوية غير CF إلى أن تحتوي على تجويف أكبر يحتوي على المزيد من السوائل داخلها. في المقابل ، عادة ما يكون للعضويات CF تجويف أصغر مع سوائل أقل وأحيانا تكون مليئة بالمخاط والحطام. تم قياس حجم التجويف يدويا (الشكل 3B)، وتم حساب نسبة التجويف الأساسية وعرضها في الشكل 3C. تم تمييز المواد العضوية المقطعية باستخدام H & E وتلطيخ التألق المناعي. وترد الصور التمثيلية في الشكل 4 ألف، باء. تظهر العلامات الظهارية لمجرى الهواء مثل الأهداب والمخاط والوصلة الضيقة في المواد العضوية عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي الكامل كما هو موضح في الشكل 5A-D. اعتمادا على التطبيق ، يمكن استخدام التألق المناعي المجزأ أو الكامل. تحافظ طريقة التركيب الكامل على الطبيعة ثلاثية الأبعاد للعضوي ، مع الحفاظ على الجزء الداخلي من العضوي سليما ، كما هو موضح في العمل المنشور سابقا13.
تم تقييم وظيفة CFTR عن طريق فحص التورم الناجم عن الفورسكولين (FIS) باستخدام نظام تصوير آلي. يتم استخدام شرائح 15 بئر فقط للفحوصات الوظيفية بسبب دقة الصورة الأفضل. ويظهر الشكل 6A تجربة تمثيلية لجرعة فورسكولين للمتطوعين غير المصابين بالتليف الكيسي (n = 5 أشخاص) لتوضيح الأساس المنطقي لوقت التصوير الأمثل والتحليل. تم تفصيل البيانات التي تقارن بين الاستجابات العضوية غير CF و CF في المنشورات السابقة11,13. تظهر استجابة الجرعة التغيير التدريجي في نشاط CFTR لإظهار أفضل نهج للقياسات. تم تقييم مدة الفحص البالغة 1 ساعة و 8 ساعات (الشكل 6B ، C) بالإضافة إلى التحليل باستخدام متوسط التغير الكسري (AFC) مقابل المساحة تحت المنحنى (AUC) في الشكلين 6C و D. استنادا إلى تجربتنا السابقة ، فإن التورم لمعظم الأشخاص والظروف بعد 8 ساعات ، وفي بعض الحالات ، يؤدي إلى انفجار المواد العضوية خلال ذلك الوقت. لذلك ، اقتصرت الفحوصات على 8 ساعات فقط. عند طول الفحص الممتد هذا ، يصبح التورم غير خطي. كما يأخذ استخدام الجامعة الأمريكية بالقاهرة في الاعتبار التغيرات في الحجم ومعدل التغير. لذلك ، تم استخدام AUC أكثر من 8 ساعات لجميع اختبارات FIS في المنهجية النهائية.
الشكل 1: صور المجال الساطع للشبكات عالية الارتفاع في الثقافة المشتركة. تتوسع HNEs في وسائط التوسع مع الخلايا الليفية 3T3 المشععة والمعطلة لمدة 10 أيام. يستخدم مجهر المجال الساطع المقلوب لتصوير الخلايا. (أ) تنمو HNEs بشكل جيد في مجموعة كبيرة (سهم أسود). في المقابل ، في (B) ، تنمو HNEs بشكل سيئ في مجموعتين صغيرتين (أسهم سوداء) تحيط بخلايا 3T3 المشععة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تكوين عضوي HNE في شريحة 15 بئرا وإدراج الثقافة. تم التقاط صور المجال الساطع للعضويات باستخدام مجهر مقلوب للمجال الساطع على مدار 21 يوما. تحتوي المواد العضوية في الشريحة المكونة من 15 بئرا (A) على صور أكثر دقة ووضوحا من تلك الموجودة في إدراج الثقافة (B). لم يلاحظ أي فرق مورفولوجي بين المواد العضوية المستزرعة في الشريحة والإدخال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: حجم التجويف العضوي (اللوحة A) وقياسات التجويف (اللوحة B و C). (أ) عادة ما يكون للعضويات غير CF تجويف أكبر وأكثر سوائل من المواد العضوية CF (F508del/F508del). (ب) طريقة لقياس مساحة السطح الكلية (TSA) يدويا المشار إليها بالمخطط الأحمر ومنطقة التجويف (LA) المشار إليها بالمخطط الأخضر في جسم عضوي واحد. (ج) مثال لاستخدام مساحة السطح الكلية ومنطقة التجويف لحساب نسبة التجويف الأساسية (LA: TSA) في المواد العضوية من موضوع غير CF مقابل موضوع CF. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: المقطع العرضي للعضويات المضمنة في البارافين. (أ) مثال على تلطيخ H&E في المواد العضوية من موضوع غير CF و CF (F508del/F508del). (ب) تلطيخ الفلورسنت المناعي للأهداب في عضوي. الأخضر هو الأهداب (السهم الأبيض) الملطخة بالأسيتيلاتيد توبولين و FITC المسمى الجسم المضاد الثانوي ، والأزرق هو النوى المصنفة مع DAPI. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور متحدة البؤرة للتألق المناعي الكامل في المواد العضوية. (أ، ج) الحد الأقصى لصور الإسقاط للعضويتين التمثيليتين. (ب، د) صور إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد ل (A) و (C) ، على التوالي. تم تركيب شريحة ذات 8 آبار ذات قاع زجاجي على منصة مجهر بؤري ، وتم استخدام عدسة 40x لإنشاء الصور المجهرية الضوئية. تم تطبيق برنامج تحليل التصوير لتصوير الصور وإعادة بنائها. تشير الأسهم البيضاء إلى المخاط (في B) والأهداب (في C) داخل تجويف المواد العضوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الأساس المنطقي لطول فحص التورم وطرق التحليل. فحص التورم الناجم عن فورسكولين (FSK) (FIS) لاختبار وظيفة CFTR على الخلايا الظهارية الأنفية الأولية. تم إعطاء جرعة مختلفة من الفورسكولين المشار إليها في الأرقام في المواد العضوية التي يبلغ عمرها 21 يوما في وسائط التمايز. تم تسجيل تورم عضوي على الفور باستخدام جهاز التصوير الآلي لمدة 8 ساعات. بعد 8 ساعات ، يظهر التورم في (A) (n = 5 ، الموضوعات غير CF) باستخدام متوسط التغير الكسري (AFC). تتم مقارنة استجابة جرعة FSK مع AFC عند 1 ساعة (B) مقابل 8 h (C) ، مما يشير إلى أن فحص 8 h يمكن أن ينتج فرقا أكبر في التورم بين جرعات FSK المختلفة من تلك الموجودة في 1 h. AFC (C) مقابل المنطقة تحت المنحنى ، تتم مقارنة AUC (D) عند 8 h ، مما يشير إلى أن AUC يمكن أن تعكس فرقا طفيفا في التورم من AFC. يمثل المحور X في الألواح (B-D) ظروف المعالجة المختلفة المقابلة للرموز الموجودة في وسيلة إيضاح الشكل. تشير جميع أشرطة الخطأ في الأرقام إلى الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: جميع المكونات اللازمة لصنع وسائط التوسعة. تم وصف المعلومات التفصيلية حول تركيز مخزون الكاشف ، وتخزين المخزون ، وكمية المخزون لصنع وسائط 500 مل ، والتركيز النهائي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: جميع المكونات لصنع وسائط التمايز. تم وصف المعلومات التفصيلية حول تركيز مخزون الكاشف ، وتخزين المخزون ، وكمية المخزون لصنع وسائط 500 مل ، والتركيز النهائي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الملف التكميلي 1: يتم توفير مثال على ملف بروتوكول خاص بنظام التصوير كقالب للتصوير الآلي للعضويات لمراقبة التمايز العضوي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: مثال على ملف بروتوكول يحتوي على إعدادات محددة لإجراء فحص FIS. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر هذه المخطوطة منهجيات مفصلة للتصوير الحي والثابت الشامل للعضويات الظهارية في مجرى الهواء المستمدة من خزعة فرشاة HNE. وهو يصف المقايسات الوظيفية التي يمكن أن تحدد نشاط CFTR في الفرد. توفر HNEs نسيجا أوليا ضئيل التوغل لمجموعة متنوعة من التطبيقات. يمكن استخدام تقنيات التوسع المقدمة هنا لنمذجة أمراض الشعب الهوائية ، بما في ذلك المواد العضوية. يمكن استخدام المواد العضوية للنهج العلاجية الدقيقة ولمراقبة استقرار العلاجات القائمة على الجينات أو الحمض النووي الريبوزي المرسال مع مرور الوقت ، ولتصميم التجارب الدقيقة ، والمساعدة في حل التشخيصات غير الحاسمة39. البحث الحالي هو على CF ، ولكن هذه النماذج لها تطبيقات لأمراض أخرى تؤثر على الوظيفة الظهارية.
التوسع الأولي لل HNE بعد الخزعة أمر ضروري. وقد لوحظ أن فرش علم الخلايا تنتج أعدادا أولية أكبر من الخلايا ونتائج أفضل من أدوات الخزعة الأخرى14. من التجارب السابقة ، خلصنا إلى أن الجمع بين الفرشاة من كل من nares في عينة واحدة ومعالجة تلك العينة في غضون 4 ساعات يؤدي إلى أفضل النتائج. استخدم باحثون آخرون أطرا زمنية أكثر امتدادا من الخزعة إلى المعالجة بنجاح3. المجموعة الأولية المناسبة من الخزعات أمر حيوي للتوسع والبذر اللاحق كعضويات. هناك حاجة إلى الخلايا الليفية المشععة والمعطلة عالية الجودة للزراعة المشتركة ، والتي يتم زراعتها ومعالجتها داخليا في مختبرنا ولكن يمكن شراؤها أيضا تجاريا. ينصح المحققون بأنه ليس كل الخلايا الليفية 3T3 هي نفس خط الخلية ويجب التحقق من صحتها قبل الاستخدام.
بالنسبة للعينات التي لا يتوقع أن يكون لها ثقافة بكتيرية أو فطرية مسببة للأمراض، يقتصر العلاج بالمضادات الحيوية على العلاج القياسي للبنسلين والستربتومايسين للتجارب الموصوفة في هذه المخطوطة. بالنسبة لأولئك المعروفين باستعمارهم المزمن للمجرى الهوائي العلوي ، يتم استخدام كوكتيل مضاد حيوي موصوف أعلاه لمدة 3 أيام فقط لأن المضادات الحيوية يبدو أنها تبطئ التوسع الظهاري وتعطي نتائج أضعف في التجارب الموصوفة هنا. تم اختيار ثلاثة أيام لتحقيق التوازن بين مخاطر التلوث وتوفير معدل توسع مماثل لكل من عينات CF وغير CF. بالنسبة للأفراد الذين يعانون من مسببات الأمراض غير العادية ، يمكن للعلاج المضاد للميكروبات المصمم خصيصا إنقاذ الثقافات الملوثة إذا تم التعرف عليها مبكرا أو بدأت مسبقا. بالنسبة للخزعات الأولية البطيئة النمو بشكل غير عادي ، ستكون النتائج عادة ضعيفة للدراسات العضوية. يحتاج الباحثون إلى مراقبة كل من معدل النمو والتشكل يوميا. تعد وسائط الثقافة الداخلية والكواشف المستخدمة مفيدة للغاية لفحوصات التورم الوظيفي ، ولكن الوسائط الأخرى المتاحة تجاريا قد تفيد التطبيقات الأخرى12،25،40،41 اعتمادا على التصميم التجريبي. يمكن أن يؤدي نوع ECM المستخدم إلى مورفولوجيا مختلفة ونتائج مختلفة ، والنتائج القابلة للتكرار أمر بالغ الأهمية. يتم اختبار جميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول بشكل روتيني قبل استخدامها للتجارب. على الرغم من هذه التجربة ، ستفشل بعض الثقافات في توسيع أو توليد المواد العضوية لأسباب لا يمكن تفسيرها. يتم تشجيع المحققين على النظر في هذه العوامل أثناء قيامهم بتحسين هذا البروتوكول لتطبيقاتهم.
يتم استخدام نوع معين من الشرائح ذات 15 بئرا في هذا البروتوكول المحسن للتصوير البصري ، باستخدام الحد الأدنى من وحدات التخزين وزيادة النسخ المتماثلة مع تقليل التكاليف. تحتوي هذه الشرائح على غرفة سفلية وعلوية مثبتة على غطاء بوليمر يقلل من الغضروف المفصلي (الذي من شأنه أن يضعف التصوير) وكذلك استبدال الوسائط دون التعرض لخطر إزاحة المصفوفة وتدمير الثقافات العضوية. تجعل هذه الشرائح التصوير الساطع والفحص المجهري الحي للبقع مباشرا ، مع البذر الأولي والنمو والتصوير في نفس الطبق. سيتم فقدان المواد العضوية أثناء عملية الجمع والتثبيت والتلطيخ ، لذلك يجب توخي الحذر الدقيق خلال كل خطوة ، ويجب الحصول على أرقام بدء كافية لضمان النجاح. يمكن أن يساعد نمو المواد العضوية في إدراج الثقافة أثناء تطوير هذه التقنيات.
يتم تضمين تقنيات التصوير التي تستخدم المجاهر المختبرية المشتركة. ومع ذلك ، تستخدم الفحوصات الوظيفية الآلية نظام تصوير معقد ويتطلب مستخدما مدربا تدريبا جيدا. تم تطوير هذا البروتوكول للمستخدمين ذوي المستوى الأساسي من الخبرة باستخدام هذا المجهر وبرامجه. يوصى أولا بتدريب الأفراد على الاستخدام الأساسي للأداة والبرنامج من قبل ممثلي الشركة المصنعة ؛ يتم اتباع هذه الممارسة نفسها في مختبرنا. كانت هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 4 أسابيع من التدريب لاستخدام هذا المجهر بفعالية للتجارب.
كما هو موضح أعلاه ، فإن هذه المنهجية لها بعض القيود. هناك حاجة إلى خبرة في جمع الخزعة ، ووقت المعالجة السريعة ، والمرفق مع الخلايا الليفية المغذية لتوسيع وزراعة المواد العضوية HNE بنجاح. تم تطوير هذه الطريقة باستخدام كواشف ومعدات محددة قد لا تكون متاحة عالميا. وقد أثبتت المنهجية أنها مفيدة للبحث في التليف الكيسي3،11،13 وقد لا تكون قابلة للتطبيق على عمليات المرض الأخرى25. ومع ذلك ، يمكن استخدام طرق ومعدات أخرى لتطوير استراتيجيات مماثلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تم إدراج JSG كمخترع في طلب براءة اختراع 20170242033 من جامعة نورث كارولينا يصف نموذجا مشابها. عندما تنتج التكنولوجيا المرخصة من UNC إتاوات ، يتلقى المخترعون حصة من الإيرادات. خلاف ذلك ، يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، أو في جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها، أو في كتابة المخطوطة، أو في قرار نشر النتائج.
Acknowledgments
نحن نقدر بامتنان مساهمات جميع المشاركين الذين تبرعوا بخزعات فرشاة HNE لتطوير هذا البروتوكول. نشكر لاتونا كيرش وموظفي وحدة أبحاث الأطفال على تنسيق توظيف المتطوعين في الدراسة وجمع العينات. ونشكر ليلي دينغ وجوناثان بيلي وستيفن ماكاي، المتدربين السابقين في مختبرنا، على المساعدة التقنية. نشكر تشونغ ليو وروي جاو على مساعدتهما التقنية. يوفر ستيفن م. رو ، مدير مركز أبحاث CF في UAB ، القيادة والموارد ، والتي بدونها لن يكون هذا العمل ممكنا. كما نود أن نشكر سارة غواديانا في Biotek على المساعدة في التدريب على الأدوات ، وروبرت غرابسكي على المساعدة في الفحص المجهري البؤري في مرفق التصوير عالي الدقة التابع للبنك العربي المتحد ، وديزي وانغ على المساعدة النسيجية في مركز علم الأنسجة في UAB. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH). منحة K23HL143167 (إلى JSG) ، مؤسسة التليف الكيسي (CFF) منحة GUIMBE18A0-Q (إلى JSG) ، مركز غريغوري فليمنغ جيمس للتليف الكيسي [منح المعاهد الوطنية للصحة R35HL135816 و DK072482 و CFF جامعة ألاباما في برمنغهام (UAB) برنامج البحث والتطوير (Rowe19RO)] ، ومركز UAB للعلوم السريرية والانتقالية (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , Discovery Labware, Inc. Bedford, MA. (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
