Summary
פרוטוקול מפורט מוצג כאן כדי לתאר מודל אורגנואידי במבחנה מתאי אפיתל האף האנושיים. בפרוטוקול יש אפשרויות למדידות הדורשות ציוד מעבדה סטנדרטי, עם אפשרויות נוספות לציוד ותוכנה מיוחדים.
Abstract
ניתן להשיג טיפול מותאם אישית לחולי סיסטיק פיברוזיס (CF) באמצעות מודל מחלה במבחנה כדי להבין את פעילות ווסת ההולכה הבסיסית של סיסטיק פיברוזיס טרנס-ממברנה (CFTR) ושיקום מתרכובות מולקולות קטנות. הקבוצה שלנו התמקדה לאחרונה בהקמת מודל אורגנואידי ממוין היטב שמקורו ישירות בתאי אפיתל האף האנושיים העיקריים (HNE). היסטולוגיה של אורגנואידים מחוטרים, צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה מלאה והדמיה (באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית ושדה בהיר) חיוניים לאפיון אורגנואידים ולאישור התמיינות אפיתל בהכנה לבדיקות תפקודיות. יתר על כן, אורגנואידים של HNE מייצרים לומן בגדלים שונים המתואמים עם פעילות CFTR, ומבחינים בין אורגנואידים של CF לבין אורגנואידים שאינם CF. בכתב יד זה מתוארת בפירוט המתודולוגיה לגידול אורגנואידים מסוג HNE, תוך התמקדות בהערכת ההבחנה באמצעות שיטות ההדמיה, כולל מדידת אזור לומן בסיסי (שיטה למדידת פעילות CFTR באורגנואידים שכל מעבדה עם מיקרוסקופ יכולה להשתמש בה) וכן הגישה האוטומטית שפותחה לבדיקה פונקציונלית (הדורשת ציוד מיוחד יותר).
Introduction
מבוא לטכניקה
מבחנים מבוססי תרבות Ex vivo הם כלי המשמש יותר ויותר לרפואה מדויקת ולחקר פתופיזיולוגיה של מחלות. תרבית תאים ראשונית של אפיתל האף האנושי (HNE) שימשה במחקרים רבים של סיסטיק פיברוזיס 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 מחלה אוטוזומלית רצסיבית המשפיעה על תפקוד תאי האפיתל במספר איברים., תרבית HNE מספקת מקור מתחדש של אפיתליה של דרכי הנשימה שניתן להשיג באופן פרוספקטיבי ומשחזרת תכונות אלקטרופיזיולוגיות וביוכימיות לבדיקת פעילות ויסות ההולכה של סיסטיק פיברוזיס טרנס-ממברנה (CFTR). ניתן לדגום תאי HNE עם תופעות לוואי מינימליות14, בדומה למטושים נשימתיים נגיפיים נפוצים. עבודת מחקר המתארת מודל למחקר סיסטיק פיברוזיס שמקורו בביופסיות מברשת HNE פורסמה לאחרונה11,13. בעוד שבדומה למודלים אחרים המשתמשים ב- HNE 2,3 ראשוני ורקמת מעיים 15,16,17,18,19, אפיון מפורט של ההבחנה וההדמיה של מודל זה מתוארים כאן לשימוש במחקרי CF ולסיוע במחקרים של מחלות אחרות בדרכי הנשימה 13 . המודל האורגנואידי אינו בלתי מוגבל כמו קווי תאים מונצחים, אך ניתן להרחיבו על ידי תכנות מחדש מותנה (באמצעות פיברובלסטים מזינים מוקרנים ומומתקים ומעכבי Rho-kinase) למצב דמוי תאי גזע יותר 20,21,22,23. העיבוד של ביופסיות מברשת HNE בשיטה זו מניב מספר רב של תאי אפיתל לשימוש ביישומים מרובים בתפוקה גבוהה יותר תוך שמירה על היכולת להתמיין באופן מלא. בעוד שפרוטוקול זה פותח באמצעות תאי הזנה, מתודולוגיות אחרות עשויות לשמש חוקרים המבקשים להימנע מטכנולוגיית תאי ההזנה14,24.
חשיבות הטכניקה לביולוגיה ריאתית
מחקר משמעותי הוקדש להבנת האופן שבו היעדר CFTR קבוע ומתפקד בקרום התא של תאי אפיתל גורם לתפקוד לקוי בריאות, לבלב, כבד, מעיים או רקמות אחרות. הובלת יוני אפיתל לא מתפקדת, במיוחד זו של כלוריד וביקרבונט, גורמת לירידה בנפח נוזלי הרירית של האפיתל ולשינויים בהפרשות הריריות, מה שמוביל לקיפאון וחסימה רירית. במחלות אחרות בדרכי הנשימה, כגון דיסקינזיה סילארית ראשונית, שינוי בתנועה סילארית פוגע בפינוי הריריות ומוביל לקיפאון ריריות ולחסימה25. לכן, המודל האורגנואידי הנוכחי של HNE פותח עבור יישומים שונים, בהתאם לתכנון הניסויי של החוקר ולמשאביו. זה כולל הדמיה של תאים חיים באמצעות כתמים של תאים חיים; קיבעון וחתך כדי לאפיין את המורפולוגיה; צביעת אימונופלואורסצנציה עם נוגדנים והדמיה קונפוקלית של הרכבה מלאה כדי למנוע שיבוש מבנים אינטראלומינליים; וטומוגרפיה של הדמיה בשדה בהיר וקוהרנטיות מיקרו-אופטית למדידות כמותיות של תדר פעימה צילארית והובלה רירית13. כדי להקל על ההתרחבות לחוקרים אחרים, ריאגנטים ואספקה זמינים מסחרית שימשו לגידול. פותחה בדיקה פונקציונלית שהשתמשה בטכניקות מיקרוסקופ נפוצות ובציוד מיוחד יותר. באופן כללי, בעוד שהמודל הנוכחי תוכנן להעריך את פעילות ה-CFTR בנקודת ההתחלה או בתגובה לטיפולים, ניתן ליישם את הטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה על מחלות אחרות המערבות את תפקוד תאי האפיתל, במיוחד הובלת נוזל תאי אפיתל.
השוואה למתודולוגיות אחרות
לאחרונה התועלת של מודל אורגנואידי זה פותחה על ידי קורלציה בין תגובות אפנן CFTR במבחנה של אורגנואידים של חולים לבין התגובה הקלינית שלהם11. יש לציין כי כמו כן, הוכח כי המודל הנוכחי מקביל לתגובות זרם קצר חשמלי, תקן הזהב הנוכחי להערכת תפקוד CFTR, באותם חולים. זרם קצר חשמלי שונה מבדיקת הנפיחות מכיוון שהראשון מודד את פונקציית CFTR באמצעות הובלת יונים26. לעומת זאת, בדיקה זו מודדת אפקט במורד הזרם עם הובלת נוזלים, ומספקת מידע נוסף על הפונקציה הכוללת של CFTR 27,28,29,30,31,32. מדידות זרם קצר המשיכו להיות שיטה נפוצה ואמינה לקביעת פעילות תעלת CFTR כלוריד 1,33. בדיקות אלקטרופיזיולוגיות אלה דורשות ציוד מיוחד ויקר, דורשות פי כמה וכמה יותר תאים עבור כל שכפול ניסיוני מאשר הבדיקה האורגנואידית, אינן ניתנות לאוטומטיות בקלות, ואינן ניתנות להתאמה להרחבה עבור יישומי תפוקה גבוהים יותר. למודל אורגנואידי נוסף שמקורו באפיתליה של המעיים יש יתרונות נוספים 15,16,17,18, כגון יכולת שכפול מצוינת יותר, אך הוא אינו נגזר מרקמת דרכי הנשימה ואינו זמין באופן אוניברסלי. מברשות HNE מתקבלות עם מברשות ציטולוגיה זולות ללא צורך בהרגעה ובסיכון מינימלי. קבלת הצחצוח אינה דורשת קלינאית ויכולה להתבצע על ידי רכזי מחקר מיומנים וצוותי מחקר אחרים14. מודל האורגנואידים של HNE יכול להיות תרבית על ידי כל מעבדה עם יכולות תרבית תאים ראשוניות, וחלק מהיישומים יכולים להתבצע עם טכניקות מיקרוסקופיה סטנדרטיות. בסך הכל, יתרונות אלה מספקים גישה נוספת לטכנולוגיה להערכת תפקוד אפיתל דרכי הנשימה שאחרת עשוי להיות לא זמין למעבדות מסוימות. יתר על כן, ניתן להשתמש באורגנואידים של HNE כדי לחקור מצבי מחלה אחרים המשפיעים על דרכי הנשימה, כגון dyskinesia25 סילארי ראשוני או זיהום ויראלי, אשר אורגנואידים במעיים אינם יכולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות HNE נאספו בבית החולים לילדים באלבמה. כל הנהלים והשיטות המתוארים כאן אושרו על ידי אוניברסיטת IRB של אלבמה בברמינגהאם (UAB IRB #151030001). כדי להקל על ההתרחבות ולשפר את תפקודם של תאי אפיתל האף האנושיים (HNEs), שיטות התרבות הנוכחיות מותאמות משיטת התרבית הידועה של ממשק אוויר-נוזל (ALI)28,34. HNEs נאספו בתחילה על ידי ביופסיית מברשת כפי שתואר קודם לכן 12,14, כאשר ההבדל היחיד הוא השימוש במברשת ציטולוגיה. כל שלבי עיבוד הדגימה ותרבית התאים בוצעו בארון הבטיחות הביולוגית.
1. תרבית תאים והרחבת תאי אפיתל האף
- לאחר הצחצוח, אחסנו את דגימת הביופסיה של האף ב-8 מ"ל של מדיית RPMI בצינור חרוטי של 15 מ"ל על קרח והעבירו אותה למעבדה תוך 4 שעות (לא יותר מ-24 שעות).
- נתקו את הביופסיה של מברשת האף ל-8 מ"ל של מדיית RPMI בצינור חרוטי של 15 מ"ל על ידי העברת המברשת הציטולוגית דרך קצה פיפטה גדול של 1 מ"ל (חתכו את הקצה) מספר פעמים עד שהמברשת נקייה מרקמה.
- צנטריפוגה של התאים ב-500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט, ולאחר מכן השעיה מחדש את גלולת התא ב-3 מ"ל של תמיסת ניתוק התאים (ראה טבלת חומרים) ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 16 דקות לעיכול.
- השתמש ב- 5 מ"ל של מדיית הרחבה (טבלה 1) כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן, הוסיפו תאים לבקבוק T75 שנזרע מראש עם פיברובלסטים 3T3 מוקרנים ומומתקים22 (מפגש של 50%-60%), כדי לתרבת את התאים במשותף ולהתרחב במדיית ההתפשטות למשך 7-14 יום (ראו איור 1 למושבה המתאימה). לפני השימוש, בדקו את הפיברובלסטים המוקרנים 3T3 כדי לוודא שהם לא יכולים להתרבות, מה שישפיע לרעה על התפשטות תאי האפיתל.
הערה: השליכו את התאים אם מפגש תאי אפיתל האף אינו מגיע ל-70% תוך 14 יום. - עבור התאים המופקים מחולים עם CF, הכניסו ארבע אנטיביוטיקות (100 מיקרוגרם/מ"ל של טוברמיצין, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל של אמפוטריצין B, 100 מיקרוגרם/מ"ל של צפטזידים, 100 מיקרוגרם/מ"ל של ונקומיצין, ראו טבלת חומרים) לתוך מדיית ההתפשטות לחיטוי התאים במשך 3 הימים הראשונים של התרבית, ולאחר מכן החליפו את המדיה במדיית התפשטות ללא אנטיביוטיקה שמשנה את המדיה כל יומיים.
הערה: שימוש מוגבל זה באנטיביוטיקה נועד להפחית את אובדן התרבית עקב התיישבות חיידקים תוך עידוד התפשטות לאחר הסרת האנטיביוטיקה הנוספת. אנטיביוטיקה זו יכולה להיות מותאמת לתוצאות המיקרוביולוגיות הספציפיות של המטופל, עם רגישויות, במידת הצורך. - קציר HNEs מתרבית משותפת באמצעות שיטת טריפסיניזציה כפולה22 ברגע שהתאים מגיעים לכ-80% מפגש. שיטה זו מבטיחה כי פיברובלסטים 3T3 מוקרנים ומומתים מוסרים מהבקבוקון, והם אינם מזהמים את זריעת האורגנואידים הבאים.
- שטפו את התאים עם 1x DPBS, ולאחר מכן הוסיפו 1.5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לתוך בקבוקון T75 למשך 4 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הפיברובלסט המוקרן והמומת 3T3 מהתרבית.
- שטפו את בקבוקון T75 עם 1x DPBS פעמיים כדי לשטוף ביסודיות את כל הפיברובלסטים הנותרים של 3T3; הוסף 1.5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לתוך בקבוקון T75 למשך 10 דקות ב 37 °C כדי לנתק HNEs.
- נטרלו את הטריפסין באמצעות מעכב טריפסין סויה (ראו טבלת חומרים) ביחס של 1:1. צנטריפוגה של התאים ב 500 x g במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. לאחר שטיפת התאים עם 5 מ"ל של מדיית התפשטות פעם אחת, התאים מוכנים לזריעה כדי לגדל אורגנואידים.
הערה: מומלץ להשתמש ב-HNEs עם מספר קטע של שלושה לניסויים נוספים.
2. גדילה והבחנה של אורגנואידים בשקופיות ובתוספות תרבית
- להפשיר את מטריצת התרבית האורגנואידית החוץ-תאית (ECM) למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. טיפים מגניבים לפיפטה ל-4 מעלות צלזיוס ומגלשות אנגיוגנזה של 15 מעלות (ראו טבלת חומרים) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
הערה: יש לשים ECM ב 4 °C (66 °F) בלילה לפני שיש לבצע את קצירת התאים. - מצפים את המגלשות ב-5 μL של 100% ECM קר על קרח (פיפטה 5 μL של 100% ECM קר עם קצה פיפטה קר לכל באר של המגלשה בת 15 הבאר), ולאחר מכן מכניסים אותן לחממת תרביות תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 מעלות צלזיוס לפחות למשך 30 דקות לאיחוד.
- ספרו את ה-HNEs שנקטפו מתרבית משותפת באמצעות המוציטומטר ולדלל את התאים ל-500 תאים/μL במספר הכולל עם 20% ECM מדולל על ידי מדיית התמיינות (טבלה 2) על קרח. לאחר מכן, זרעו 5 μL של תערובת התא הקר/ECM לכל באר של המגלשות המצופות ב-ECM.
- העבירו מיד את השקופיות לחממת תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאחד את תערובת התאים/ECM.
- הזן את התאים בכל באר של שקופיות אנגיוגנזה בנות 15 בארות עם 50 μL של מדיית התמיינות. שנו את המדיה כל יומיים עד שהאורגנואידים יהיו מוכנים לניסויים נוספים.
הערה: בדרך כלל ניתן לדמיין אורגנואידים לאחר 1-2 ימים. ישנם 20-90 אורגנואידים הנוצרים בדרך כלל בכל באר של השקופיות. האורגנואידים יכולים בדרך כלל לשרוד במשך 40-60 יום ב- ECM עם האכלה כל יומיים כאשר הם מוחזקים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. - תרבית האורגנואידים בתרבית מוסיפה (ראו טבלת חומרים) לכמות גדולה יותר עבור יישומים ספציפיים (כגון חתך להיסטולוגיה או אימונופלואורסצנציה) לפי השלבים המוזכרים להלן.
- כדי לגדל אורגנואידים בתוספות התרבית, הכינו את תרבית האורגנואידים ECM, קצות פיפטה ותוספות כאמור בשלבים 2.1-2.2. מצפים את התוספות ב-100 μL של 100% ECM קר.
- זרע 60 μL של תערובת תאים/ECM (500 תאים/μL עם 20% ECM במדיית התמיינות) על גבי ציפוי ECM בנספח.
הערה: כל השלבים האחרים להכנת אורגנואידים בתוספות זהים לאלה שנערכו בשקופיות, שלבים 2.4-2.5. - הוסף 600 μL של מדיית ההבחנה לחלק התחתון של התוספת. שנו את המדיה בכל יום חלופי עד שהאורגנואידים ישמשו לניסויים, בדרך כלל 2-3 שבועות.
3. הכנה ובידוד של אורגנואידים לאימונופלואורסצנציה שלם
- בידוד וקיבוע של אורגנואידים
- טיפול מקדים בשקופיות של תא זכוכית עם 8 בארות עם דבק תאים (ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות לאחר הפניה35. לאחר השלכת התמיסה, ייבשו את הבארות באוויר במשך 30 דקות.
- כדי לקצור את האורגנואידים, הסר את המדיה מהחלק העליון של ה- ECM, ולאחר מכן הוסף 50 μL של PBS קר 1x PBS לכל באר של 15 הבארות מחליקות על קרח (1:1 עם נפח ECM).
- פיפטה למעלה ולמטה 3-5 פעמים באמצעות 200 μL של קצה הפיפטה בעל הקידוח הגדול, ולאחר מכן מחלקים את התמיסה למרכז באר של שקופיות התא בעלות 8 הבארות.
- יש להסיר מיד את עודפי הנוזלים מהבארות על ידי פיפטה עדינה. לאחר מכן, הניחו את החלקת התא לתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי לשפר את האורגנואיד הנצמד לתחתית הזכוכית.
- לאחר שטיפה עדינה עם 1x PBS פעמיים, תקן את האורגנואידים עם 300 μL של 4% paraformaldehyde בכל באר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- יש לשטוף פעמיים עם 1x PBS ולאחסן את האורגנואידים ב-1x PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לצורך שמירה חיסונית למשך עד שבועיים.
- צביעה אימונופלואורסצנטית
- כדי להפחית את הפלואורסצנציה האוטומטית, הוסיפו 250 μL של 50 mM NH4Cl ב-1x PBS לכל באר של המגלשות ב-RT למשך 30 דקות תוך ניעור עדין על שייקר ב-20 סל"ד.
- לאחר שטיפה עם 1x PBS פעמיים, חלחלו את התאים עם 0.1% Triton X-100 למשך 30 דקות ב-RT תוך רעד עדין ב-20 סל"ד.
- לאחר שטיפה עם 1x PBS פעמיים, הוסיפו 300 μL של תמיסת חסימה, כולל 5% BSA ו-0.1% Triton X-100 ב-1x PBS, לכל באר למשך שעה אחת ב-RT.
- לאחר הכביסה, יש להוסיף נוגדנים ראשוניים לבארות המתאימות ולאחר מכן נוגדנים משניים (ראו טבלת חומרים). הכינו פתרונות נוגדנים ראשוניים ומשניים ב-2% BSA ו-0.3% טריטון X-100 ב-1x PBS. הדגירה של כל הנוגדנים הראשוניים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך יומיים וכל הנוגדנים המשניים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך יום אחד.
הערה: הריכוזים הסופיים תלויים בחלבון הרצוי לניסוי. אנא בדוק את ריכוז המלאי בגליון הנתונים של היצרן. לאחר מכן, חשב את הריכוזים הסופיים בהתבסס על הדילולים המשמשים בטבלת החומרים. - לאחר הדגירה, שטפו את הבארות ביסודיות עם 1x PBS והוסיפו DAPI ב-2% BSA ו-0.3% Triton X-100 לכל באר לצורך צביעה גרעינית.
- דמיינו את האורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, עם מטרת טבילת שמן של פי 20-60 (ראו טבלת חומרים). השתמש במצב Z-stack כדי להגדיר את הגבולות העליונים והתחתונים של התמונה והשתמש בגודל צעד Z האופטימלי המומלץ שנקבע על-ידי התוכנה הקונפוקלית.
הערה: נעשה שימוש בארבעת אורכי הגל הבאים של עירור לייזר קונפוקלי: 408.7 ננומטר, 489.1 ננומטר, 561.7 ננומטר ו- 637.9 ננומטר.
4. הכנה ובידוד של אורגנואידים לחתך היסטולוגי
- כדי לקצור את האורגנואידים למחקרים היסטולוגיים, הסר את המדיה מהתרבית והוסף 50 μL של 50 μL של PBS קר 1x PBS לכל באר של המגלשות על הקרח.
- פיפטה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים באמצעות קצה פיפטה בעל 200 μL בעל נשא גדול, שלבו את כל הפתרונות מהשקופית בת 15 הבארות או מכניסות התרבית לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל על קרח. התאם את נפח הפתרון הכולל בצינור ל- 10 מ"ל על-ידי הוספת PBS קר נוסף של 1x.
- צנטריפוגה את הצינור ב 4 ° C, 300 x g במשך 5 דקות; שאפו החוצה את הסופרנאטנט והוסיפו 60 μL של היסטוגל חם (ראו טבלת חומרים) כדי לערבב עם הכדור האורגנואידי באמצעות 200 μL של קצה הפיפטה בעל הבור הגדול.
- מיד להעביר את ההשעיה לתבנית היסטולוגיה. לאחר איחוד ההיסטוגל בטמפרטורת החדר, לשים את בלוק התבנית לתוך 4% paraformaldehyde לקיבוע לילה ב 4 ° C.
- לאחר הטבעה בפרפין, חתכו את בלוק ההיסטוגל לחתכים של 5 מיקרומטר (לדוגמה, עם מיקרוטום), תיקנו את המקטעים על שקופיות זכוכית, והכתימו באמצעות המטוקסילין ואוזין (H&E) או נוגדנים המסומנים בכינוי אימונופלואורסצנציה. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי הפוך (ראו טבלת חומרים).
5. הדמיה של אורגנואידים חיים
הערה: השלבים הבאים מתבצעים באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית (ראה טבלת חומרים). מערכות הדמיה שונות צריכות להתאים שלבים אלה בהתאם להוראות היצרן הספציפיות שלהן. ללא קשר לציוד שבו נעשה שימוש, הדמיה של אורגנואידים חיים דורשת תא סביבתי מבוקר טמפרטורה ולח עם בקר גז CO2 מלווה.
- כדי לעקוב אחר ההבחנה של אורגנואידים לפני ביצוע בדיקת נפיחות תפקודית36, צלם את כל תמונות השקופיות באופן ידני עם כל מיקרוסקופ שדה בהיר או עם מערכת הדמיה אוטומטית, כמפורט להלן.
- הפעילו את החשמל למערכת ההדמיה האוטומטית ולבקר הגז CO2/O2 ואפשרו למערכת להשלים את הכיול האוטומטי (כ-30 דקות).
- לאחר השלמתו, הגדר את טמפרטורת מערכת ההדמיה ל -37 °C (64 °F); מוסיפים 15 מ"ל של מים סטריליים למאגר הלחות, פותחים את שסתומי ה-CO2 , סוגרים את המכסים ונותנים למערכת ההדמיה לדגירה מוקדמת למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה.
- פתח את תוכנת ההדמיה האוטומטית כדי להגדיר פרוטוקול להדמיה ולבחור את המיקום כדי לשמור את הנתונים הניסיוניים הגולמיים.
הערה: קובץ פרוטוקול לדוגמה (קובץ משלים 1), ספציפי למערכת ההדמיה, סופק כתבנית להדמיה אוטומטית של אורגנואידים לניטור התמיינות אורגנואידים. - לאחר עמידה בהגדרות הסביבתיות, העבירו באופן מיידי עד שתי שקופיות בנות 15 בארות עם מכסים לתוך התא הסביבתי בתוספת מחזיק השקופיות של מערכת התמונות האוטומטית (ראו טבלת חומרים).
- בחר את הבארות להצטלם והתחל בהדמיה כדי להשלים את ההדמיה של הבארות הרצויות.
הערה: ההגדרות המומלצות הבסיסיות הן: 4x ו 10x מטרת אוויר, ערוץ שדה בהיר, 2 x 2 מונטאז 'עבור 4x המטרה כדי לכסות את כל אזור הבאר, 4 x 4 מונטאז 'עבור מטרה 10x. הגדרות מחסנית Z: שלוש עד שש פרוסות Z-stack, גודל צעד Z = 50-100 מיקרומטר, פרוסה אחת עד שתי פרוסות מתחת לנקודת המיקוד האוטומטי, ושלוש עד חמש פרוסות למעלה.
- כדי לדמות אורגנואידים חיים לשימוש בבדיקת נפיחות הנגרמת על ידי פורסקולין (FIS), השתמש במיקרוסקופ עם שלב אוטומטי המצויד בתא הדמיה מבוקר סביבה המאפשר בקרת טמפרטורה ו- CO2 .
- התחל בשלבים 5.1.1-5.1.4, החלף את קובץ הפרוטוקול בשלב 5.1.3 בזה המופיע בקובץ הפרוטוקול לדוגמה (קובץ משלים 2) המכיל הגדרות ספציפיות לביצוע בדיקת FIS.
- לפני כל ניסוי, התאם את הגדרות החשיפה על-ידי הערכה של לפחות שלוש בארות עבור כל שקופית (משמאל, באמצע ובימין הקיצוני). החל את קיזוזי הקואורדינטות X ו- Y כדי להבטיח שהמטרה תהיה במרכז הבאר עבור כל הבארות.
הערה: ההגדרות המומלצות הבסיסיות הן: 4x מטרת אוויר, ערוץ 1 = שדה בהיר, ערוץ 2 = DAPI, 2 x 2 מונטאז '(ארבעה אריחי תמונה). הגדרות מחסנית Z: שלוש עד ארבע פרוסות Z-stack, גודל Z-step = 50-100 מיקרומטר, פרוסה אחת מתחת לנקודת המיקוד האוטומטי ושתיים עד שלוש פרוסות למעלה. זמן רכישת תמונה: 8 שעות עם מרווחים של 20 דקות (סה"כ קריאות = 25; קרא 1 הוא T = 0). - לאחר שכל ההגדרות נבחרות כראוי, בחר את הבארות לתמונה עבור שתי השקופיות, או בחר הכל, והתחל את ההפעלה בהתאם להוראות הציוד.
- לאחר הריצה, שמור את הניסוי, סגור את תוכנת ההדמיה וכבה את מערכת ההדמיה37.
6. מדידות לומן בסיסיות
הערה: הדבר נעשה באמצעות תוכנת ניתוח הדמיה ידנית (ראה טבלת חומרים). ניתן לעקוב אחר מתודולוגיה דומה באמצעות תוכנת קוד פתוח38 או כל תוכנה שיכולה למדוד את שטח האזור בתמונה.
- בתוכנה, פתח את לוח המדידה האוטומטי על-ידי לחיצה ימנית על החלק התחתון של המסך, בחר מדידה ולאחר מכן תוצאות מדידה אוטומטיות. האזור של כל אזור עניין (ROI) שנמדד יופיע שם.
- פתח את התמונה האורגנואידית בתוכנה ובחר 5-10 אורגנואידים עם לומן גלוי.
הערה: לומן יהיה אזור מעגלי במרכז האורגנואיד שצבעו שונה באופן ניכר משאר האורגנואיד (איור 2A). - באמצעות תכונת מדידת החזר ההשקעה של המצולע, לחץ לחיצה ימנית על התמונה כדי לפתוח את התפריט ובחר ROI מצולע כדי לתאר את האורגנואיד המלא כדי לקבל את שטח הפנים הכולל של האורגנואיד (TSA). לאחר מכן, באמצעות אותה תכונה, תווה את אזור לומן (LA) (איור 2B).
- חוזרים על שאר האורגנואידים בבאר ועל כל הבארות שבבדיקה.
- ייצא את הנתונים כדי להצטיין. חלקו את ה-LA ב-TSA ורשמו ממוצע של כל האורגנואידים מהדגימה כדי לקבל את יחס לומן הבסיסי (BLR)11,13.
הערה: בדרך כלל, כ-87% מהאורגנואידים שאינם CF יהיו בעלי BLR מעל 0.6, ו-97% יהיו מעל 0.5, בעוד שרק ל-14% מהאורגנואידים שאינם CF יהיה BLR מעל 0.6, ו-31% יהיו מעל 0.5.
7. טרום טיפול והדמיה אוטומטית של אורגנואידים HNE
הערה: כל שלבי טרום הטיפול מתבצעים בארון בטיחות ביולוגית נקי. הגדר מראש את מערכת ההדמיה האוטומטית ואת התוכנה להקלטת הבדיקה לפני שלב 7.1. הדגירה עם DAPI היא אופציונלית אך מומלצת כבטוחה לכישלון אם איכות תמונות השדה הבהיר נפגעת. במקרה זה, ניתן לנתח את ערוץ DAPI (377 ננומטר) במקום זאת.
- דגירה מוקדמת של האורגנואידים בבאר של שקופיות של 15 בארות עם 50 μL של מדיית התמיינות המכילה DAPI עם או בלי 100 μM של CFTRinh-172 (ראה טבלת חומרים) באינקובטור של 37 °C למשך שעה אחת. בזמן שהאורגנואידים דגירה, בצעו את שלב 5.2.1 באמצעות פרוטוקול מותאם אישית לבדיקת נפיחות בעקבות קובץ משלים 2.
- הסר את מדיום קדם הדגירה באמצעות פיפטת פסטר זכוכית עם שאיפה. הוסף 10 μM של פורסקולין ו- 100 μM של IBMX (קוקטיילים לגירוי) (ראה טבלת חומרים) עבור נפח כולל של 50 μL מדיית התמיינות לכל באר.
הערה: ודא שלא יוכנסו בועות לבארות. בועות על התמונות ישפיעו על הניתוח האוטומטי. - ללא דיחוי, התחל את פרוטוקול הדמיית FIS לאחר שלב 5.2.2 עד 5.2.4. רכשו תמונות כל 20 דקות בכל באר, עם זמן ריצה כולל של 8 שעות.
8. ניתוח אוטומטי של בדיקת נפיחות הנגרמת על ידי פורסקולין על אורגנואידים HNE
- פתחו את תוכנת ניתוח ההדמיה האוטומטית, מצאו את הניסוי שנשמר בעבר משלב 7.3 והעלו את התמונות של הניסוי.
- בחר את חלון כלי השיט להערכה ובחר באפשרות המכילה את התמונות המעובדות שנתפרו והוקרנו z. שלב זה אמור לספק תמונה של הבאר כולה עם כל האורגנואידים בתוך מסגרת ההדמיה לצורך הערכת מיסוך ומדידות.
- בחר את התמונה היטב כדי להעריך. בחר נתח. חזור על תהליך זה עבור תמונות אחרות כדי להבטיח מיסוך מתאים לכל התמונות הכלולות במדידות האוטומטיות. שמור את הפרמטרים של ההגדרה.
- לאחר השלמת הגדרות הניתוח, החל את השינויים. התוכנה תשנה את המדידות בהתבסס על ההגדרות.
הערה: לאחר השלמת העיבוד המקדים הראשוני של התמונה, יש לבצע אמצעי בקרת איכות (QC) כדי להבטיח מיסוך עקבי. אלה כוללים סקירה ידנית של כל הבארות כדי לוודא שהאורגניואידים נמצאים בתוך מסגרת ההדמיה, בועות או פסולת אינן מוסוות באופן בלתי הולם, ובדיקת המיסוך בשדה בהיר ובערוצי DAPI. - ייצא את הנתונים לניתוח הסיכום (כולל גרפים וניתוח סטטיסטי).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הרחבת HNEs חיונית לתרבית אורגנואידית משגשגת. HNEs מאוסף דגימות מוצלח אמור להתרחב ליותר מ-70% מפגש סביב 10 ימים. דוגמה לדגימות מוצלחות ולא מוצלחות מוצגת באיור 1A ובאיור 1B, בהתאמה. יש להשליך את התאים אם הם אינם יכולים להגיע למפגש של 70% עד 14 יום לאחר תרבית משותפת עם תאי 3T3 מוקרנים. כל התאים המזוהמים יושלכו באופן מיידי אם לא ניתן להצילם עם חומרים אנטי-מיקרוביאליים נוספים במהירות.
הצמיחה של האורגנואידים הושוותה ב-15 שקופיות ותוספות תרבית. תוספות התרבית עבות יותר ורחוקות יותר מהמטרה מאשר השקופיות הממוטבות אופטית, ומשפיעות על התמונה והרזולוציה. למרות זאת, לא נצפה הבדל משמעותי במורפולוגיה בשתי שיטות התרבית האלה, כפי שמוצג באיור 2. ניתן לראות הבדלים מורפולוגיים בין אורגנואידים שאינם CF ו-CF, כפי שמוצג באיור 3A. אורגנואידים שאינם CF נוטים להיות בעלי לומן גדול יותר המכיל יותר נוזל בתוכו. לעומת זאת, לאורגנואידים של CF יש בדרך כלל לומן קטן יותר עם פחות נוזלים ולעיתים הם מלאים בליחה ופסולת. גודל לומן נמדד באופן ידני (איור 3B), ויחס לומן הבסיסי חושב והוצג באיור 3C. אורגנואידים בעלי חתך רוחב אופיינו באמצעות H&E וכתמי אימונופלואורסצנציה. התמונות הייצוגיות מוצגות באיור 4A,B. סמני אפיתל של דרכי הנשימה כגון ריסונים, ריר וצומת הדוקה מודגמים באורגנואידים על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה שלמה המוצגת באיור 5A-D. בהתאם ליישום, ניתן להשתמש באימונופלואורסצנציה של חתך או בהרכבה מלאה. שיטת ההרכבה השלמה שומרת על האופי התלת-ממדי של האורגנואיד, ושומרת על פנים האורגנואיד שלם, כפי שניתן לראות בעבודה שפורסמה בעבר13.
תפקוד CFTR הוערך על ידי בדיקת נפיחות הנגרמת על ידי פורסקולין (FIS) באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית. רק שקופיות של 15 באר משמשות לבדיקות פונקציונליות בשל רזולוציית התמונה הטובה יותר. ניסוי מייצג של תגובת מינון פורסקולין של מתנדבים שאינם CF (n = 5 נבדקים) מוצג באיור 6A כדי להמחיש את הרציונל של זמן ההדמיה והניתוח הממוטבים. נתונים המשווים תגובות אורגנואידיות שאינן CF ו- CF מפורטים בפרסומים קודמים11,13. תגובת מינון מראה את השינוי המצטבר בפעילות CFTR כדי להדגים את הגישה הטובה ביותר למדידות. משך הבדיקה של שעה ו-8 שעות הוערך (איור 6B,C) וכן ניתוח באמצעות שינוי שברים ממוצע (AFC) לעומת שטח מתחת לעקומה (AUC) נראה באיורים 6C,D. על סמך הניסיון הקודם שלנו, נפיחות עבור רוב הנבדקים והתנאים מגיעים לאחר 8 שעות, ובמקרים מסוימים, גורמת להתפוצצות האורגנואידים במהלך אותה תקופה. לכן, הבדיקות הוגבלו ל-8 שעות בלבד. באורך הבדיקה המורחב הזה, הנפיחות הופכת ללא ליניארית. השימוש ב- AUC לוקח בחשבון גם את השינויים בגודל והן את קצב השינוי. לכן, AUC מעל 8 שעות שימש עבור כל מבחני FIS במתודולוגיה הסופית.
איור 1: תמונות שדה בהיר של HNEs בתרבות משותפת. HNEs מתרחבים במדיית ההתרחבות עם פיברובלסטים 3T3 מוקרנים ומומתים למשך 10 ימים. מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך משמש להדמיית התאים. (A) HNEs גדלים היטב באשכול גדול (חץ שחור). לעומת זאת, ב-(B), ה-HNEs גדלים בצורה גרועה בשני אשכולות קטנים (חצים שחורים) המקיפים תאים מוקרנים מסוג 3T3. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: היווצרות אורגנואידית HNE בשקופית בת 15 בארות ותוספת תרבית. תמונות שדה בהיר של אורגנואידים צולמו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך במשך 21 יום. לאורגנואידים בשקופית בת 15 הבאר (A) יש תמונות מדויקות וחדות יותר מאלו שבתוספת התרבות (B). לא נצפה הבדל מורפולוגי בין האורגנואידים שעברו תרבית בשקופית לבין ההוספה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: גודל לומן אורגנואידי (לוח A) ומדידות לומן (לוח B ו-C). (A) לאורגנואידים שאינם CF יש בדרך כלל לומן גדול יותר ונוזל יותר מאשר אורגנואידים CF (F508del/F508del). (B) שיטה למדידה ידנית של שטח הפנים הכולל (TSA) המסומן על ידי קווי המתאר האדומים ואזור הלומן (LA) המסומנים על ידי קווי המתאר הירוקים באורגנואיד יחיד. (C) דוגמה לשימוש בשטח הפנים הכולל ובאזור לומן כדי לחשב את יחס לומן הבסיסי (LA: TSA) באורגנואידים מנושא שאינו CF לעומת נושא CF. פסי שגיאה מייצגים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: חתך רוחב של האורגנואידים המוטבעים בפרפין. (A) דוגמה לצביעת H&E באורגנואידים מנושא שאינו CF ו-CF (F508del/F508del). (B) צביעה אימונופלואורסצנטית של ריסונים באורגנואיד. ירוק הוא הריסונים (חץ לבן) המוכתמים באצטילציה-טובולין ובנוגדן משני מסומן FITC, וכחול הוא הגרעינים המסומנים ב-DAPI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תמונות קונפוקליות של אימונופלואורסצנציה בהרכבה שלמה באורגנואידים. (א,ג) תמונות הקרנה מקסימליות של שני האורגנואידים המייצגים. (ב,ד) תמונות שחזור תלת-ממדיות של (A) ו-(C), בהתאמה. שקופית בעלת תחתית זכוכית בעלת 8 בארות הותקנה על הרציף של מיקרוסקופ קונפוקלי, ועדשת 40x שימשה ליצירת הפוטומיקרוגרפים. תוכנת ניתוח הדמיה יושמה להדמיה ושחזור של התמונות. חצים לבנים מציינים ריר (ב-B) וריסונים (ב-C) בתוך הלומן של האורגנואידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: הרציונל של אורך בדיקת הנפיחות ושיטות הניתוח. בדיקת נפיחות הנגרמת על ידי פורסקולין (FSK) (FIS) לבדיקת תפקוד CFTR על תאי אפיתל האף העיקריים. מינון שונה של פורסקולין המצוין בנתונים נוהל לאורגנואידים בני 21 יום בתקשורת ההבחנה; נפיחות אורגנואידית נרשמה מיד עם המצלמה האוטומטית במשך 8 שעות. לאחר 8 שעות, הנפיחות מוצגת ב- (A) (n = 5, נושאים שאינם CF) באמצעות שינוי שברים ממוצע (AFC). תגובת המינון של FSK מושווית ל-AFC ב-1 שעות (B) לעומת 8 שעות (C), מה שמצביע על כך שהבדיקה של 8 שעות יכולה לייצר הפרש נפיחות משמעותי יותר בין מינוני FSK שונים מאשר אלה ב-1 h. AFC (C) לעומת האזור שמתחת לעקומה, AUC (D) ב-8 שעות מושווים, מה שמצביע על כך ש-AUC יכול לשקף הפרש נפיחות קל בהשוואה ל-AFC. ציר ה-X בלוחות (B-D) מייצג את תנאי הטיפול השונים התואמים את הסמלים במקרא האיור. כל פסי השגיאה בנתונים מציינים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: כל הרכיבים להפיכת ההרחבה למדיה. המידע המפורט על ריכוז מלאי ריאגנטים, אחסון מלאי, כמות המלאי לייצור מדיה של 500 מ"ל וריכוז סופי תוארו. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: כל המרכיבים ליצירת מדיית בידול. המידע המפורט על ריכוז מלאי ריאגנטים, אחסון מלאי, כמות המלאי לייצור מדיה של 500 מ"ל וריכוז סופי תוארו. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים 1: קובץ פרוטוקול לדוגמה ספציפי למערכת ההדמיה מסופק כתבנית להדמיה אוטומטית של אורגנואידים לניטור התמיינות אורגנואידית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: קובץ פרוטוקול לדוגמה המכיל הגדרות ספציפיות לביצוע בדיקת FIS. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה מספק מתודולוגיות מפורטות להדמיה חיה וקבועה מקיפה של האורגנואידים של אפיתל דרכי הנשימה הנגזרות מביופסיית מברשת HNE. הוא מתאר מבחנים פונקציונליים שיכולים לקבוע פעילות CFTR אצל אדם. HNEs מספקים רקמה ראשונית זעיר פולשנית למגוון יישומים. טכניקות ההרחבה המוצעות כאן יכולות לשמש למידול מחלות בדרכי הנשימה, כולל אורגנואידים. אורגנואידים יכולים לשמש לגישות טיפוליות מדויקות ולמעקב אחר היציבות של טיפולים מבוססי גנים או mRNA לאורך זמן, לתכנון ניסויים מדויקים ולסיוע בפתרון אבחנות לא חד משמעיות39. המחקר הנוכחי הוא על CF, אך למודלים אלה יש יישומים למחלות אחרות המשפיעות על תפקוד האפיתל.
ההרחבה הראשונית של HNE לאחר ביופסיה היא חיונית. נצפה כי מברשות ציטולוגיה מניבות מספרי תאים ראשוניים גדולים יותר ותוצאות טובות יותר מכלי ביופסיה אחרים14. מניסיון קודם, הסקנו כי שילוב של מברשות משני הנארס בדגימה אחת ועיבוד הדגימה תוך 4 שעות מניב את התוצאות הטובות ביותר. חוקרים אחרים השתמשו במסגרות זמן ארוכות יותר מביופסיה ועד לעיבוד בהצלחה3. האוסף הראשוני המתאים של ביופסיות חיוני להתרחבות ולזריעה שלאחר מכן כאורגנואידים. נדרשים פיברובלסטים מוקרנים ומומתקים באיכות גבוהה לתרבית משותפת, אשר גדלים ומטופלים בתוך החברה במעבדה שלנו, אך עשויים גם להירכש באופן מסחרי. לחוקרים מומלץ כי לא כל הפיברובלסטים 3T3 הם אותו קו תאים ויש לאמת אותם לפני השימוש.
עבור דגימות שלא צפויות להיות בעלות תרבית חיידקית או פטרייתית פתוגנית, הטיפול האנטיביוטי מוגבל לטיפול סטנדרטי בפניצילין וסטרפטומיצין עבור הניסויים המתוארים בכתב יד זה. עבור אלה הידועים כבעלי קולוניזציה כרונית של דרכי הנשימה העליונות, קוקטייל אנטיביוטי שתואר לעיל מנוצל למשך 3 ימים בלבד מכיוון שנראה כי אנטיביוטיקה מאטה את התרחבות האפיתל ומניבה תוצאות גרועות יותר בניסויים המתוארים כאן. שלושה ימים נבחרו כדי לאזן את הסיכון לזיהום עם מתן קצב התרחבות דומה הן עבור דגימות CF והן עבור דגימות שאינן CF. עבור אנשים עם פתוגנים יוצאי דופן, טיפול אנטי מיקרוביאלי מותאם אישית יכול להציל תרביות מזוהמות אם זוהו מוקדם או יזמו מראש. עבור ביופסיות ראשוניות שגדלותן איטיות באופן יוצא דופן, התוצאות בדרך כלל יהיו גרועות עבור מחקרים באורגנואידים. החוקרים צריכים לעקוב אחר קצב הצמיחה והמורפולוגיה מדי יום. המדיה והריאגנטים הפנימיים של התרבות המשמשים מועילים ביותר לבדיקות נפיחות פונקציונליות, אך מדיות אחרות הזמינות מסחרית עשויות להועיל ליישומים אחרים 12,25,40,41 בהתאם לתכנון הניסויי. סוג ה-ECM שבו נעשה שימוש יכול להוביל למורפולוגיה שונה ולתוצאות שונות, והתוצאות הניתנות לשחזור הן קריטיות. כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה נבדקים באופן שגרתי לפני השימוש לניסויים. למרות ניסיון זה, תרבויות מסוימות לא יצליחו להתרחב או ליצור אורגנואידים מסיבות בלתי מוסברות. החוקרים מוזמנים לשקול גורמים אלה כאשר הם מייעלים פרוטוקול זה עבור היישומים שלהם.
סוג מסוים של שקופית 15 בארות משמש בפרוטוקול זה המותאם להדמיה אופטית, תוך שימוש בנפחים מינימליים ומקסום שכפולים תוך הפחתת העלויות. לשקופיות אלה יש תא תחתון ועליון הקבוע על מכסה פולימרי הממזער את המניסקי (שאחרת היה פוגע בהדמיה) וגם החלפת מדיה ללא סיכון לניתוק המטריצה ולהרס תרביות האורגנואידים. שקופיות אלה הופכות את ההדמיה בשדה בהיר ואת מיקרוסקופיית הכתמים החיים לפשוטה, עם זריעה ראשונית, צמיחה והדמיה באותה מנה. אורגנואידים יאבדו במהלך תהליך האיסוף, הקיבעון והכתם, ולכן יש להקפיד על זהירות במהלך כל שלב, ויש להשיג מספרים התחלתיים מספיקים כדי להבטיח הצלחה. גידול אורגנואידים בתוספות תרבית יכול לעזור כאשר טכניקות אלה מפותחות.
טכניקות הדמיה המשתמשות במיקרוסקופי מעבדה נפוצים כלולות. עם זאת, הבדיקות הפונקציונליות האוטומטיות משתמשות במערכת הדמיה מורכבת ודורשת משתמש מיומן היטב. פרוטוקול זה פותח עבור משתמשים עם רמה בסיסית של ניסיון באמצעות מיקרוסקופ זה ותוכנתו. מומלץ להכשיר תחילה את הפרטים על השימוש העיקרי במכשיר ובתוכנה על ידי נציגי היצרן; אותו נוהג מתבצע במעבדה שלנו. נדרשו לפחות 4 שבועות של אימונים כדי להשתמש במיקרוסקופ זה ביעילות לניסויים.
כפי שתואר לעיל, למתודולוגיה זו יש כמה מגבלות. יש צורך במומחיות באיסוף ביופסיה, זמן עיבוד מהיר ומתקן עם פיברובלסטים מזינים כדי להרחיב בהצלחה ולתרבת את האורגנואידים של HNE. שיטה זו פותחה באמצעות ריאגנטים וציוד ספציפיים שייתכן שאינם זמינים באופן אוניברסלי. המתודולוגיה הוכיחה את עצמה כיעילה למחקר בסיסטיק פיברוזיס 3,11,13 וייתכן שאינה רלוונטית לתהליכי מחלה אחרים25. עם זאת, שיטות וציוד אחרים עשויים לשמש לפיתוח אסטרטגיות דומות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JSG רשום כממציא בבקשת פטנט 20170242033 מאוניברסיטת צפון קרוליינה המתאר מודל דומה. כאשר טכנולוגיה מורשית של UNC מייצרת תמלוגים, הממציאים מקבלים נתח מההכנסות. אחרת, המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף, בניתוח או בפרשנות של נתונים, בכתיבת כתב היד או בהחלטה לפרסם את התוצאות.
Acknowledgments
אנו מודים תודה על תרומתם של כל המשתתפים שתרמו ביופסיות מברשת HNE לפיתוח פרוטוקול זה. אנו מודים ללטונה קרש ולצוות היחידה לחקר ילדים על תיאום גיוס מתנדבי המחקר ואיסוף הדגימות. אנו מודים ללילי דנג, ג'ונתן ביילי וסטיבן מקיי, מתאמנים לשעבר במעבדה שלנו, על הסיוע הטכני. אנו מודים לז'ונג ליו ולרוי ז'או על עזרתם הטכנית. סטיבן מ. רואו, מנהל מרכז המחקר CF ב- UAB, מספק מנהיגות ומשאבים, שבלעדיהם עבודה זו לא תהיה אפשרית. אנו רוצים גם להודות לשרה גואדיאנה בביוטק על הסיוע בהכשרת מכשירים, לרוברט גרבסקי על הסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית במתקן ההדמיה ברזולוציה גבוהה של UAB, ולדז'י וואנג על הסיוע ההיסטולוגי בליבת ההיסטולוגיה של UAB. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH.) מענק K23HL143167 (ל- JSG), מענק GUIMBE18A0-Q של קרן סיסטיק פיברוזיס (ל- JSG), מרכז גרגורי פלמינג ג'יימס סיסטיק פיברוזיס [מענקי NIH R35HL135816 ו- DK072482 ותוכנית המחקר והפיתוח של אוניברסיטת CFF בברמינגהאם (UAB) (Rowe19RO)], ומרכז UAB למדע קליני ותרגומי (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , Discovery Labware, Inc. Bedford, MA. (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
