Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En tyngdekraftsmatet transkardiasjonsperfusjonsmetode for histologisk analyse av musens sentralnervesystem

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63386
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, State University of New York Upstate Medical University, 2Department of Neurology, State University of New York Upstate Medical University, 3Department of Neuroscience and Physiology, State University of New York Upstate Medical University

Summary

En praktisk tyngdekraftmatet perfusjonsmetode for histologisk analyse av musens sentralnervesystem presenteres. Immunfluoreserende påvisning av fosforylatert α-synuklein er demonstrert i en musemodell av Parkinsons sykdom. Dette arbeidet beskriver også omfattende transkardiell perfusjon, disseksjon, vevsfrysing / innebygging og frosne seksjoneringstrinn.

Abstract

Den histologiske analysen av hjerne- og ryggmargsprøver isolert fra mus er vanlig praksis for vurdering av patologi i dette modellsystemet. For å opprettholde morfologien til disse delikate vevene, er det rutinemessig å administrere et kjemisk fikseringsmiddel som paraformaldehyd via kannulation av hjertet hos bedøvede dyr (transkardiell perfusjon). Transkardial perfusjon av musehjertet har tradisjonelt vært avhengig av bruk av peristaltiske pumper eller lufttrykk for å levere både saltvanns- og fikseringsløsningene som er nødvendige for denne prosessen. Som et lett tilgjengelig alternativ til disse metodene demonstrerer dette arbeidet bruken av en tyngdekraftsmatet metode for perfusatlevering som bruker materialer som er tilgjengelige i de fleste maskinvareforretninger.

For å validere denne nye perfusjonsmetoden demonstrerer dette arbeidet alle de påfølgende trinnene som er nødvendige for sensitiv deteksjon av fosforylatert α-synuklein i både hjernen og ryggmargen. Inkludert i disse trinnene er disseksjonen av det faste hjerne- og ryggmargsvevet, rask frysing / innbygging og kryooseksjon av vevet og immunfluorescerende farging. Siden denne metoden resulterer i helkroppslevering av fixative, kan den også brukes til å forberede andre ikke-nevronale vev for histologisk analyse.

Introduction

Histologisk karakterisering av patologi i musens sentralnervesystem (CNS) er en rutinemessig teknikk som brukes i studier av nevrodegenerasjon. Ettersom nevronvev raskt forringes etter døden, er det vanlig praksis å levere et kjemisk fikseringsmiddel som paraformaldehyd til CNS-vevet for å bevaremorfologien 1,2. Kjemisk fiksering kan utføres enten gjennom perfusjon av hele kroppen med en fikseringsløsning eller gjennom isolering av vev og nedsenking i en fixativ løsning (kalt "drop fixation"). Perfusjon er den foretrukne metoden for fixative levering, da dråpefiksering kanskje ikke tillater rask penetrasjon av den fikseringsløsningen i dype CNS-strukturer 3,4,5. Videre, da det er vanskelig å fjerne den uløste ryggmargen fra vertebrale kolonnen, tillater levering av den fikseringsløsningen via perfusjon in situ bevaring av ryggmargen mikroskopisk og grov anatomi og stiver vevet for å minimere skade under fjerning.

Levering av buffer- og fikseringsløsninger som er nødvendige for fiksering, utføres vanligvis ved hjelp av kommersielt tilgjengelige pumper eller lufttrykk. Gravity levering av perfusate kan tjene som et alternativ til pumpe levering av følgende grunner: (1) Pumpe eller lufttrykk levering kan i noen tilfeller kreve at en bruker manuelt opprettholder trykket i systemet gjennom perfusjonen. Tyngdekraftslevering av perfusat kan opprettholdes uten brukermedvirkning. (2) Et tyngdekraft levert perfusatapparat kan konstrueres til lav pris for brukeren ved å skaffe materialer tilgjengelig fra standard vitenskapelige leverandører. Dette arbeidet beskriver hvordan du konstruerer en enkel gravitasjonsperfusjonsenhet ved hjelp av vaskeflasker og vinylrør. Ved hjelp av en musemodell av Parkinsons sykdom demonstrerer dette arbeidet effekten av dette systemet ved å parfyme hjernen og ryggmargsvevet før isolasjonen for frossen seksjonering. Dette arbeidet beskriver grundig alle trinn, teknikker og materialer som trengs for å dissekere det faste vevet ut av dyret, raskt fryse / legge inn og kryose vevet, og oppdage tilstedeværelsen av fosforylatert α-synuclein i både hjernen og ryggmargen via indirekte immunofluorescence mikroskopi.

Protocol

Dataene og eksperimentelle trinnene som presenteres i denne protokollen ble generert ved hjelp av C57BL / 6J mus. Alle metoder som involverer dyr ble godkjent av State University of New York Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Bygging av perfusjonsapparat og disseksjonsplattform

  1. Som vist i figur 1, trim de indre sugerørene fra to 500 ml vaskeflasker ved å kutte disse spylingene til innsiden av skruehetten med et skarpt barberblad. Klipp et 4 cm x 4 cm firkantet hull i bunnen av hver bufferflaske. Klipp et lite hull i bunnen av hver flaske for å tillate passasje av en bøyd mikrospatula i rustfritt stål.
  2. Lag en "S" formet bøyning i mikrospatulas slik at de kan brukes som kroker for å henge bufferflaskene. Sett de bøyde mikrospatellene inn i de riktige åpningene i bufferflaskene.
  3. Klipp to 25 cm lengder av slanger og koble disse tett til de ytre flaskestråuttakene. Slå sammen endene av disse rørene sammen med Y-kontakten. Klipp 2 m med slanger og koble dette til den frie enden av Y-kontakten.
  4. Fjern stempelet fra 1 ml sprøyten og kutt sprøyten ca. 6 cm fra sprøytespissen. Klipp sprøyten ved først å skåre plasten med et barberblad og deretter knipse sprøyteplasten skarpt.
  5. Sett sprøytens skjæreskive inn i den frie enden av plastslangen. Sett inn på tilstrekkelig dybde for å sikre en tett forsegling.
    MERK: Det er viktig at alle tilkoblinger i perfusjonsapparatet er tilstrekkelig stramme til å unngå lekkasje. Ved løse tilkoblinger kan små slangeklemmer i rustfritt stål plasseres og strammes ved veikryss etter ønske for å sikre en tett forsegling om nødvendig.
  6. Merk én bufferflaske som PFA og én flaske som PBS (buffer). Mål omtrent 1/3rd av lengden bort fra flaskeåpningen og tegn en linje rundt flaskeomkretsen på dette tidspunktet for å betegne riktig fyllingsnivå av de perfusate løsningene.
  7. Rett ut og lag deretter en løkke i en stor binders som passer rundt omkretsen av slangen. Plasser denne løkken rundt slangen bare proksimalt til sprøyten.
  8. Plasser en Styrofoam-blokk med riktig størrelse i glassbrettet. Plasser endene av bindersen i Styrofoam-blokken for å feste slangen.
  9. Bruk papirhåndklær til å heve den fremre enden av glassbrettet med ca. 2 cm.
    MERK: Dette vil plassere musen i omtrent 20° av Trendelenburg-posisjonen (bakovervinkel) for å muliggjøre enklere visualisering av membranen under disseksjon og oppmuntre til drenering av væsker under perfusjon.

Figure 1
Figur 1: Diagram som viser det monterte perfusjonsapparatet. Forkortelser: PBS = fosfatbufret saltvann; PFA = paraformaldehyd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Fremstilling av paraformaldehyd (PFA) løsning

MERK: PFA-oppløsningen må tilberedes fersk på perfusjonsdagen og kastes på slutten av perfusjonen i en bestemt avfallsbeholder før avhending av opplært personell. Denne protokollen gjør 1 L av 4% PFA-løsning, som er tilstrekkelig til å parfyme ca 4 mus. PFA er svært giftig, og det må utvises forsiktighet for å unngå innånding eller direkte hudkontakt i enten pulverisert eller flytende form. De fleste forberedelsestrinn utføres derfor mens du bruker hansker, protectove-briller og en labfrakk under en avtrekkshette.

  1. Skyll et 1 L beger ved hjelp av destillert vann og fyll med ca. 800 ml 18 mΩ molekylærbiologisk H2O.
  2. Varm opp begeret på H2O i en mikrobølgeovn i 3 minutter eller til vanntemperaturen når 65 °C. Plasser på en varme-/røreplate som oppbevares i en avtrekkshette.
  3. Skyll en rørestang med destillert vann og legg den i varmt vann. Start røreren og skru varmeplaten opp til middels varme. Pass på at vanntemperaturen ikke går over 70 °C.
  4. Bruk kirurgisk maske, hansker, vernebriller og labfrakk og mål 40 g PFA-pulver. Hell dette pulveret i det oppvarmede vannet.
  5. Bruk en overføringspipette, legg til noen dråper 5 M NaOH til løsningen. La PFA-pulveret oppløses helt. Hvis pulveret ikke er fullstendig oppløst etter noen minutter, tilsett dråper på 5 M NaOH etter behov.
  6. Når nesten alt PFA har oppløst (vil virke litt uklart), stopp omrøring / oppvarming og tilsett umiddelbart 100 ml 10x fosfatbufret saltvann (PBS). Til slutt fyller du opp vannet til 1 L-merket på begeret ved hjelp av 18 mΩ molekylærbiologisk klasse H2O. Dekk begeret med plastfolie og legg det i en -20 ° C fryser til løsningen når romtemperatur (ca. 45 min).
  7. Kalibrer en pH-måler ved hjelp av de riktige standardene. Mens begeret er på en røreplate, måler du pH i løsningen og tilsett HCl til pH når 7,4. Tilsett om nødvendig 5 M NaOH for å øke pH hvis den er for lav.
  8. Koble en vakuumflaske til vakuum og plasser en ren keramisk Büchner-trakt med filterpapir i kolben. Slå på vakuumet og fukt filterpapiret ved hjelp av en overføringspipette fylt med 4% PFA-løsningen.
  9. Hell langsomt 4 % PFA-oppløsningen på filterpapiret til all oppløsningen er filtrert.
  10. Overfør den filtrerte oppløsningen til en ren, lysbeskyttet beholder og oppbevar den ved 4 °C til bruk (oppbevar ikke mer enn 24 timer).

3. Transkardiale "pumpefrie" perfusjon

  1. I avtrekkshetten plasserer du en Styrofoam dissekeringsblokk i et glassbrett. Sørg for at dissekeringsblokken har 5-6 korte nåler for å holde musen tilbake under operasjonen og 2 lange nåler for å støtte perfusjonsslangen.
  2. Skyll perfusjonsapparatet med destillert vann. La alt vannet renne før du henger perfusjonsapparatet. Heng perfusjonsflaskene 1 m over det perfunderte dyret (for en 20-30 g mus).
  3. Forbered en ikke-steril løsning av 1x PBS ved hjelp av 10x PBS fortynnet med 18 mΩ molekylærbiologi-grad H2O.
  4. Som vist i figur 2, klem hovedledningen til perfusjonsapparatet ved hjelp av en hemostat. Klem PFA-linjen med en annen hemostat.
    MERK: Okklusjon med flere hemostater kan være nødvendig per linje for å forhindre strømning helt.
  5. Fyll bufferbeholderen med 1x PBS ved romtemperatur.
  6. Plasser sprøyteenden av perfusjonsapparatet i et beger for å samle avfallsbufferen og fjerne hemostaten som okkluderer hovedledningen (figur 2, venstre).
  7. La PBS strømme gjennom linjen mens du fjerner fanget luft ved å trykke kraftig på veggene på røret.
  8. Når all luft er fjernet fra bufferen og hovedledningene, okkluderer du strømmen ved å plassere en hemostat på hovedlinjen.
  9. Fjern hemostaten fra PFA-linjen og la PBS strømme på en retrograd måte opp til PFA-flasken mens du tapper ut eventuelle bobler i PFA-linjen (figur 2, midten). Fortsett å la PBS komme inn i PFA-linjen til PBS kan sees like over åpningen av flasken. Okkluder PFA-linjen med en hemostat for å stoppe strømmen inn i PFA-flasken.
  10. Koble sommerfuglinfusjonsnålen til perfusjonssprøyten og skyll PBS gjennom linjen (ved å åpne hovedlinjen hemostat) for å fjerne bobler fra perfusjonssprøyten. Lukk hovedlinjen hemostat.
  11. Forsikre deg om at PBS-flasken nå er omtrent 1/3rd full av PBS. Skyll om nødvendig PBS gjennom hovedlinjen eller fyll mer PBS i bufferflasken til 1/3rd av full kapasitet.
  12. Når alle bobler er fjernet fra PBS, PFA og hovedlinjene, fyll PFA-flasken med 4% PFA-oppløsning ved romtemperatur opp til det svarte merket på flasken (ca. 1/3rd full) (figur 2, høyre).

Figure 2
Figur 2: Klargjøring av perfusjonsapparatet for perfusjonskirurgi. Først lukker du PFA-linjen hemostat og åpner hemostaten på PBS-linjen og hovedlinjen. Fyll PBS og fjern bobler fra PBS-linjen og hovedlinjen. Fyll deretter PFA-linjen med PBS ved å åpne hemostaten på PFA-linjen og lukke hemostaten på hovedlinjen. Fjern bobler i PFA-linjen. Til slutt lukker du hemostaten på PFA-linjen når PBS når åpningen av PFA-flasken. Fyll PFA-flasken 1/3rd full av PFA. Forsikre deg om at nivået på PBS i PBS-flasken er 1/3rd fullt og fyll enten med PBS eller tøm PBS ved å åpne hovedledningen hemostat om nødvendig. Forkortelser: PBS = fosfatbufret saltvann; PFA = paraformaldehyd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Forbered deg på ikke-overlevelseskirurgi ved å rengjøre følgende instrumenter med vann etterfulgt av 70% etanol: stor saks, fin dissekering saks, hud tang, fine fenestrated buede tang.
  2. Forbered anestesi ved å plassere støvfrie våtservietter i et 50 ml konisk rør. I en avtrekkshette, suge støvfrie våtservietter grundig med isofluran og plasser det åpne røret opp ned i et 500 ml beger. Pass på at det ikke er væskeisfluran på bunnen av begeret og kast eventuell flytende isofluran før du plasserer en mus i begeret.
  3. Plasser musen i begeret og legg plastfolie over åpningen for å begynne anestesi.
  4. Administrer anestesi til musen slutter å puste (ca. 1 min og 30 s).
  5. Når pusten har stoppet, fjern straks musen fra begeret og bytt ut hetten på det koniske røret på 50 ml.
  6. Kontroller at musen er tilstrekkelig bedøvet ved hjelp av tåklemmefleksen. Hvis dyret ikke er tilstrekkelig bedøvet, administrer mer isofluran som beskrevet i trinn 3.15.
  7. Arbeid raskt, plasser musen på Styrofoam-blokken og fest potene utover ved hjelp av fire korte nåler (f.eks. 22 G sprøytenåler).
  8. Løft bukhuden med hud tang, bruk den store saksen til å kutte gjennom bukveggen. Pass på at ingen bukorganer er kuttet!
  9. Fortsett abdominal kuttet overlegent mot leveren. Løsne leveren fra den fremre bukveggen og fortsett det første snittet overlegent mot membranen. Stopp dette snittet ca 1 cm dårligere enn membranen. Pass på at leveren ikke er kuttet!
  10. Fortsett det første snittet sidelengs opp mot høyre og venstre side av membranen for å lage et "Y"-formet snitt (figur 3A).
  11. Når snittet når membranen, lag et hull i membranen ved hjelp av den fine dissekeringssaksen og kutt gjennom ribbenene på dyrets høyre side. Klipp ribbenene omtrent halvveis til høyre axilla.
  12. Lag et lignende, men lengre snitt gjennom venstre side av membranen nesten helt til venstre axilla.
  13. Reflekter brystveggen og fest den til Styrofoam-blokken.
  14. Om nødvendig, disseker bort fettet fra rundt hjertet for å eksponere venstre ventrikel. Identifiser venstre ventrikel basert på den relativt lysere fargen sammenlignet med høyre ventrikel.
  15. Etter å ha identifisert venstre ventrikel, hold hjertet stødig ved hjelp av lett trykk med de fine buede tangene. Åpne hovedlinjen hemostat slik at PBS å strømme gjennom nålen. Gjennombor straks venstre ventrikel og sørg for at nålen ikke er satt inn mer enn 0,5 cm inn i ventrikelen. Trekk nålen litt ut om nødvendig.
    MERK: Nøyaktig plassering av nålen i venstre ventrikel indikeres ved retrograd blodstrøm inn i nåleslangen. Det er viktig å sikre at nålen ikke er for dypt satt inn i ventrikelen. Dette kan føre til retrograd strømning gjennom lungeårene eller piercing interventricular septum.
  16. Hvil sommerfuglslangen på en X laget i Styrofoam med to store 18 G nåler.
    MERK: Dette er kritisk, da det vil unngå bevegelse av sommerfuglnålen i hjertet under perfusjon.
  17. Identifiser den dårligere vena cava når den går ut av leveren og transekter den ved hjelp av den fine dissekeringssaksen (figur 3B). Alternativt kan du åpne riktig atrium med saks.
  18. Åpne straks hovedledningen slik at PBS-perfusjonen kan starte (figur 3C).
  19. Forsikre deg om at PBS drenerer av Styrofoam-blokken og inn i glassbrettet nedenfor. Hvis dette ikke skjer, juster vinkelen på brettet eller Styrofoak-blokken for å tillate drenering av væsker i glassbrettet.
  20. Fortsett PBS-perfusjonen til væsken som strømmer ut av den dårligere vena cava er blodfri (ca. 3 min).
    MERK: Riktig plassering av nålen i hjertet vil resultere i visuell rydding av blod fra leveren, som vil vende seg fra rødt til halmfarget. Hvis dette ikke skjer, kan det løses ved å omplassere infusjonsnålen i venstre ventrikel. Et lite snitt kan gjøres i ventral halebasen for å vurdere kvaliteten på perfusjon. Riktig perfusjon vil resultere i klar PBS som strømmer fra halebaseinnsnittet.
  21. Jobber raskt, okkluderer PBS-linjen med en hemostat og åpner PFA-linjen.
  22. La PFA parfyme i noen minutter til halen begynner å krølle. Når halen begynner å krølle, start en 50 min timer. Hvis halen ikke krøller seg etter 5 min PFA-perfusjon, start en 50 min timer for PFA-perfusjonen.
  23. Overvåk PFA-nivået i flasken kontinuerlig gjennom hele perfusjonen for å sikre at nivået ikke faller for lavt. Fyll mer PFA i flasken hvis nivået faller under 2 cm over flaskelokket.

Figure 3
Figur 3: Diagram som viser transkardial perfusjon. (A) Bukveggen kuttes først, etterfulgt av to lateralt pekende snitt mot at axillaen danner en "Y". (B) Etter å ha kommet inn i thoraxhulen og eksponert hjertet, blir nålen passert inn i venstre ventrikel. Deretter blir IVC eller høyre atrium transektert for å tillate drenering av perfusater etter at de har sirkulert gjennom kroppen. IVC er kuttet overlegen membranen. (C) Prosedyre for administrering av perfusater. Forkortelse = IVC = dårligere vena cava. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Etter 50 min har gått, okkluder hovedlinjen med en hemostat og trekk nålen fra venstre ventrikel.
    MERK: Hele musen er stiv på dette punktet og kan nå plasseres i en merket beholder på 4% PFA over natten ved 4 °C. På dette stadiet er det mulig å dissekere CNS-vevet og plassere de individuelt i fixative over natten. I dette arbeidet er hele musen plassert i fixative da dette forkorter intervallet mellom fiksering og plassering ved 4 °C. Dette unngår også mulig mekanisk forvrengning av nervevev som kan oppstå hvis dyr er fordelt før overnattingsfiksering er fullført.

4. CNS-disseksjon

  1. Forbered følgende instrumenter for disseksjon ved å vaske med vann etterfulgt av 70% etanol: saks, hud tang, buede fenestrated tang, buede fine tang, rette fine tang, fin saks.
  2. Merk fire rør per mus som følger og fyll med steril 20% sukrose: Mus-ID, Hjerne 1, Muse-ID, Hjerne 2, Muse-ID, Lumbar, Muse-ID, Cervical.
  3. Fjern musen fra PFA-løsningen og flekk den tørr med et papirhåndkle for å fjerne overflødig PFA.
  4. Bruk den store saksen, fjern musens hode ved å kutte i nakken.
  5. Plasser kroppen i PFA-løsningen. Behold hodet for å dissekere hjernen fra skallen.
  6. For å dissekere hjernen, begynn med å reflektere kranialhuden fremover for å eksponere hele skallen (figur 4A).
  7. Lag et grunt kutt i den hørbare kanalen ved hjelp av den fine dissekeringssaksen for å få inngang i skallen
  8. Fortsett dette kuttet langs den tverrgående sinusen til skallen er kuttet hele veien mellom begge hørbare kanaler.
  9. Lag et kutt vinkelrett på det forrige kuttet langs langsgående sprekk hele veien til den mest rostrale delen av skallen (omtrent mellom øynene).
  10. Bruk de fenestrerte buede tangene, reflektere skallen lateralt for å eksponere forebrain. Fortsett å fjerne skallen til hele forebrain, inkludert olfaktoriske pærer, er utsatt.
  11. Begynn å dissekere kaudalområdet i skallen ved å lage et kutt gjennom oksipitalbenet og sakte fortsette dette kuttet ned mot foramen magnum.
  12. Reflekter de to hodeskallestykkene sidelengs for å eksponere cerebellum og hjernestamme årsakssammenheng (figur 4B).
  13. Bruk de ultrafine buede tangene til å skille de olfaktoriske pærene fra den fremre skallen og begynn å skrelle hjernen bort fra skallebasen som starter ved de olfaktoriske pærene.
  14. Når hjernen skrelles bort fra hodeskallebasen, bruk ultrafine tang for å kutte kranialnervene og tillate fjerning av hjernen.
  15. Fortsett å skrelle bort hjernen fra hodeskallebasen til hele den intakte hjernen er fjernet (figur 4C,D).
  16. Klipp hjernen i to langs langsgående sprekk for å skille høyre og venstre halvkule fra hverandre (figur 4E, F).
  17. Plasser en halvkule i hjernen 1 rør og den andre halvkule i hjernen 2 tube. Oppbevar disse rørene ved 4 °C til hjernehalvøya synker (omtrent over natten).

Figure 4
Figur 4: Fjerning av fast hjerne. (A) Toppen av skallen. (B) Eksponert hjerne i skallen. (C) Isolert hjerne (dorsalt aspekt). (D) Isolert hjerne (ventral aspektet). (E) Venstre halvkule (sideaspektet). (F) Venstre halvkule (medial aspektet). Skalastenger = 1 cm (E og F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. For å dissekere ryggmargen, fjern musekroppen fra PFA og flekk den tørr.
  2. Plasser musen på en Styrofoam dissekering blokk i utsatt posisjon og fest potene i blokken ved hjelp av fire nåler.
  3. Begynn disseksjonen ved å kutte huden ned midtlinjen av musen fra nakke til hale for å eksponere hele baksiden.
  4. Reflekter muskelen og fasciaen på ryggen for å eksponere den bakre delen av vertebrale kolonnen.
  5. Begynn med de mest kraniale ryggvirvlene, bruk den fine dissekeringssaksen til å skjære gjennom laminaen samtidig som du unngår ryggmargen (figur 5A).
  6. Plasser de ultrafine buede tangene under laminaen og trekk oppover for å sprekke ryggvirvlene for å eksponere ryggmargen (figur 5B).
  7. Bruk de buede tangene til å reflektere de oppsprukne ryggvirvlene og eksponere de mest laterale områdene i ryggmargen.
  8. Fortsett denne prosessen for neste ryggvirvler ved å plassere de ultrafine buede tangene under laminaen og sprekke ryggvirvlene. Fortsett å sprekke ryggvirvler til hele livmorhalsryggen og thoraxryggen er eksponert (figur 5C).
  9. Fortsett å eksponere ryggmargen til enden av lumbal ryggmargen (figur 5D).
  10. Bruk et skarpt barberblad, klipp hele veien gjennom midthoracic ryggmargen.
  11. Ved hjelp av ultrafine buede tang, transekt ryggnervene lateralt fra ryggraden og fascia fremre til ryggmargen for å skille cervical ryggmargen sakte fra vertebrale kolonnen.
  12. Fortsett å dissekere ut livmorhalsmargen til den er fri for ryggvirvlene (figur 5E). Plasser cervical-midthoracic ryggmargen i røret merket Cervical. Oppbevar dette røret ved 4 °C til ryggmargen i livmorhalsen synker (omtrent over natten).
  13. Fortsett å sprekke brystvirvlene helt til cauda equina som beskrevet i trinn 4.22 til 4.25. Når cauda equina er utsatt, bruk et skarpt barberblad for å kutte ryggmargen 1 cm under lumbale ryggmargen (figur 5F).
  14. Disseker lumbal ryggmargen bort fra ryggvirvlene som beskrevet i trinn 4.26-4.27. Plasser lumbal-mid cauda equina ryggmargen i røret merket lumbal. Oppbevar dette røret ved 4 °C til lumbal ryggmargen synker (omtrent over natten).
  15. Når alle vevene har sunket i 20% sukrose, overfør dem til merkede rør med 30% sukrose til de har sunket eller i 3 dager.
    MERK: Spinalvev synker ofte ikke ved 30% sukrose.

Figure 5
Figur 5: Fjerning av faste ryggmargssegmenter. (A) Første kutt i livmorhalsens ryggvirvler. (B) Plassering av buede tang for å sprekke individuelle ryggvirvler. (C) Den eksponerte cervical ryggraden. (D) Eksponert cervical, thoracic, og lumbal ryggraden. (E) Fjerning av livmorhalsen ryggraden etter kutting spinal nerver. (F) Kutting av sakral ryggraden. (G) Isolert cervical ryggrad. (H) Isolert lumbal ryggraden. Skalastenger = 1 cm (G og H). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. OCT innebygging og vev lagring

  1. For hver mus merker du fire rektangulære kryomolder: Muse-ID, Høyre halvkule, Innebyggingsdato; Muse-ID, Venstre halvkule, Innebyggingsdato; Muse-ID, Cervical, Dato for innebygging; Muse-ID, Lumbar, Innebyggingsdato.
  2. Sett opp en Styrofoam-beholder og heng en metallkopp over beholderen.
  3. Fyll Styrofoam-beholderen med flytende nitrogen omtrent halvveis. Fyll metallkoppen med frisk 2-metylbutane omtrent halvveis.
    MERK: 2-Methylbutane er giftig, svært flyktig og brannfarlig. Det må utvises forsiktighet for å unngå innånding ved å utføre påfølgende trinn i en avtrekkshette og vekk fra forbrenningskilder.
  4. Senk metallkoppen langsomt ned i det flytende nitrogenet og unngå sprut av det flytende nitrogenet i metallkoppen.
  5. La 2-metylbutane begynne å fryse. Mens 2-Methylbutane fryser, ta ønsket vev ut av 30% sukroseoppløsningen og flekk den tørr på en støvfri klut.
  6. Plasser vevet i en kryonom med rostralområdet rettet mot den øverste (umerkede) delen av formen.
  7. Hell sparsomt optimal skjæretemperaturinnbyggingsmedium (OCT) over vevet i kryomaljen, og bruk bare nok til å dekke vevet helt. Unngå å bruke overdreven OCT, da dette kan forårsake sprekker. Fjern eventuelle bobler fra Tilpasningsverktøy for Office.
  8. Når frossen 2-metylbutane har dekket den indre overflaten av metallkoppen fullt ut, senk kryonomen helt ned i den overliggende væskefasen 2-metylbutan i 12 s. Etter 12 s, plasser kryonomen for å drenere i et merket aluminiumsfolietorg og pakk hele kryonomen. Plasser straks den innpakkede kryomolden på tørris og unngå å tine. Sørg for at den frosne OCT/cryomold alltid er dekket av tørris.
  9. Gjenta trinn 5.6 til 5.8 for alle vev. Legg vevet for en mus i en forseglet liten plastpose og deretter i en kryosikker, forseglet beholder. Oppbevar denne beholderen i dypfryseren -80 °C til seksjonene er kuttet.

6. Kryoosectioning

  1. Før du gråter, må du sørge for at kryostatkammertemperaturen og prøvehodet er satt til de riktige innstillingene.
    MERK: En kammertemperatur på -20 °C, en prøvehodetemperatur på -20 °C og en seksjonstykkelse på 30 μm brukes til å kutte hjerneseksjoner. For kutting av ryggmargsseksjoner brukes en kammertemperatur på -23 °C, en prøvehodetemperatur på -30 °C og en seksjonstykkelse på 30 μm. Det er viktig å merke seg at kryostatinnstillingene (spesielt prøvehodetemperaturen) må justeres under seksjonering for å løse problemer med vevskvalitet. Generelt senkes prøvehodetemperaturen for å korrigere for vevssmøring. Omvendt økes prøvehodetemperaturen for å korrigere for overdreven vevskrølling.
  2. Fjern ønsket OCT-blokk fra -80 °C fryseren og plasser den utpakkede cryomold/OCT-blokken i kryostatkammeret.
  3. La OCT-blokken akklimatisere seg til kammertemperaturen i 30 min.
  4. Rengjør en chuck med 70% etanol og tørk den tørr med en støvfri klut. Plasser den rensede chucken i kryostatkammeret og lag en sirkel av OKT i myntstørrelse på chucken. La Tilpasningsverktøy for Office fryse (ca. 1-2 min).
  5. Når OCT har frosset, legg en ert-størrelse prikk av fersk OCT på chucken og legg umiddelbart vevet OCT blokk på chucken. Påse at vevet er helt vinkelrett på chucken før OCT fryser helt.
    MERK: Generelt er den mest rostrale regionen av hjernen plassert mot chucken slik at seksjonering begynner fra kaudal ende. For ryggmargen er vanligvis den mest kaudale regionen plassert på chucken slik at seksjonering begynner fra rostralenden.
  6. Når Oct har herdet, plasser mer OCT rundt bunnen av OCT blokken for å fungere som strukturell støtte under seksjonering. Når denne støtten er litt herdet, plasser chucken på prøvehodet og la OCT-blokken nå temperaturen på prøvehodet i 30 minutter.
  7. Plasser et mikrotomblad i bladholderen og rengjør antirollplaten. Juster avstanden til antirollplaten for å sikre at vevet passerer like under platen under seksjonering. For mer informasjon om riktig plassering av antirollplaten, se kryostathåndboken.
  8. Etter at OCT-blokken har akklimatiserte seg til prøvehodetemperaturen, begynner du å trimme OCT-blokken til vevet er nådd. Når vev er synlig, bytt fra trimming til seksjonering og begynn å kutte 30 μm seksjoner. Flytt til side antirollplaten, og bruk et mikroskopsklie til å plukke opp delen.
  9. Fortsett å kutte og samle seksjoner til fornøyd med den anatomiske plasseringen av seksjonene eller alt vevet er kuttet. Plasser lysbildene for å tørke ved romtemperatur i 1-3 dager. Etter tørking plasserer du lysbildene i en glideboks og legger denne boksen i en forseglet plastpose. Merk posen med muse-ID-en og vevsinformasjonen før du plasserer lysbildene i -80 °C dypfryseren.

7. Immunfluorescent farging

  1. Tine lysbildene i 1 time ved romtemperatur.
  2. Plasser lysbildene i en horisontal skyveburk og vask seksjonene 3 ganger i PBS i 10 minutter hver vask ved romtemperatur på en shaker.
  3. Klargjør blokkeringsbuffer (2 % BSA + 0,3 % Triton-X-100 i 1x PBS). Bruk ca. 1 ml per lysbilde.
  4. Lag et fuktet kammer ved å legge vann til bunnen. Legg lysbildene med forsiden opp horisontalt og ikke la dem tørke ut. Tilsett 1 ml blokkeringsbuffer i hvert lysbilde og inkuber i minst 1 time ved romtemperatur.
  5. Forbered primær antistoffløsning ved å fortynne det primære antistoffet i antistoffbuffer (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 i 1x PBS).
    MERK: For fosforylatert α-synuklein antistoff ble det brukt en fortynningsfaktor på 1:500.
  6. Tilsett 200-300 μL primær antistoffløsning per lysbilde. Dekk med en dekslelip for å spre antistoffet og inkubere ved 4 °C over natten.
  7. Neste dag fjerner du lysbildene fra det fuktede kammeret og legger dem i en vertikal Coplin-krukke fylt med 1x PBS slik at dekslene faller av. Gjør dette for hvert lysbilde individuelt og pass på at du ikke forstyrrer vevsdelen når du fjerner dekslene.
  8. Plasser lysbildene i en horisontal skyveburk og vask seksjonene 3 ganger i PBS i 10 minutter hver vask ved romtemperatur på en shaker.
    MERK: Alle påfølgende trinn må utføres med lysene av for å unngå fotobleking av fluoroforen!
  9. Forbered den sekundære antistoffløsningen ved å fortynne det sekundære antistoffet i antistoffbufferen.
    MERK: For påvisning av fosforylatert α-synuklein ble antikanin sekundær konjugert til Alexa 488 med en fortynningsfaktor på 1:500 i antistoffbuffer (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 i 1x PBS) brukt.
  10. Legg lysbildene horisontalt i det fuktede kammeret og tilsett 200-300 μL sekundær antistoffløsning per lysbilde. Dekk med en dekslelip for å spre antistoffet. Inkuber ved romtemperatur i minst 2 timer.
  11. Fjern lysbildene fra det fuktede kammeret og legg dem i en vertikal Coplin-krukke fylt med 1x PBS slik at dekslene faller av. Gjør dette for hvert lysbilde individuelt og pass på at du ikke forstyrrer vevsdelen når du fjerner dekslene.
  12. Plasser lysbildene i en horisontal skyveburk og vask seksjonene 3 ganger i PBS i 10 minutter hver vask ved romtemperatur på en shaker.
  13. Blot-tørk siden av lysbildene på et håndkle og rist av overflødig PBS.
  14. Tilsett 3 dråper monteringsmedium på hvert lysbilde. Tilsett dekslene og skyv forsiktig ut bobler med et par tang ved å trykke på dekslene før du avbildning ved konfokal mikroskopi.

Representative Results

Perfusjon av høy kvalitet indikeres ved fravær av blod i leveren, ryggmargen og dype CNS-strukturer (figur 4C og figur 5G, H). Beholdt blod under dura mater (for eksempel innenfor venøse bihuler) eller mellom dura mater og skallen har ikke vært problematisk, da dette blodet ikke er innenfor hjernen parenchyma. Blodet sett i figur 4A ligger mellom skallen og dura-saken og er derfor ikke problematisk eller antydende for perfusjon av dårlig kvalitet. Den friske hjernen og ryggmargen er ganske myk og lett skadet under håndtering. Tilstrekkelig fast vev, til sammenligning, er faste. For å vurdere kvaliteten på vevet og bevaring av morfologi av vev ved denne perfusjonsmetoden, viser dette arbeidet påvisning av fosforylatert α-synuklein i midtbrain og lumbale ryggmargen til en 15 måneder gammel mus og en 7 måneder gammel mus som uttrykker menneskelig A53T-α-synuklein (figur 6).

A53T-mutasjonen er overrepresentert hos pasienter med autosomal dominerende Parkinsons sykdom (PD). Videre kan human α-synuclein med A53T-mutasjonen rekapitulere mange av egenskapene til menneskelig PD når det uttrykkes hos mus 6,7. Fosforylering av α-synuklein ved Serine 129-rester har vist seg in vivo og in vitro for å indusere α-synukleinaggregering8. Lewey kropper er den klassiske histologiske funn tilstede hos pasienter med PD eller Lewey kroppen demens9. Et flertall av de α synuklein tilstede i Lewey-legemer er fosforylert ved Serine 129 10,11. Som et resultat brukes akkumuleringen av fosforylatert α-synuklein som en markør for den histologiske alvorlighetsgraden av PD-patologi. Den nåværende studien finner at fosforylatert α-synuklein akkumuleres på et betydelig høyere nivå hos 15,5 måneder gamle symptomatiske mus i forhold til 7 måneder gamle asymptomatiske mus som uttrykker menneskelig A53T-α-synuklein. Dette er i samsvar med rapporter som beskriver en berikelse av cytopatologi i de fremre hornene i ryggmargen og midbrain av disse musene. 6 Fra dette konkluderes det med at den forenklede perfusjonsmetoden beskrevet her gir høy kvalitet fiksering av CNS vev for nedstrøms histolog karakterisering.

Figure 6
Figur 6: Etikett for fosforylatert α-synuklein i midbrain og lumbale ryggmargsvev fra en musemodell av Parkinsons sykdom. Den aldrende (15,5 måneder gamle) lammede musen i sluttfasen sammenlignes med den 7 måneder gamle sunne musen. Begge musene uttrykker en misfolding utsatt mutant variant (A53T) av menneskelig α-synuclein som induserer Parkinsons-lignende patologi. Skalastenger = 100 μm (øvre paneler) og 50 μm (nedre paneler). Forkortelse: α syn-A53T = A53T mutant av α-synuclein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; PS129 = fosforylatert Serine 129 av α-synuklein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Dette arbeidet beskriver de kritiske trinnene for å utføre transkardielle perfusjoner. Ved konstruksjon av perfusjonsapparatet (protokolldel 1) er det viktig å bruke slanger som er fleksible nok til å bli fullstendig okkludert av en hemostat. Noen stive slanger kan ikke være tilstrekkelig okkludert av en hemostat og kan fortsatt tillate PFA å lekke inn i hovedlinjen under den første PBS-perfusjonen. Ved tilberedning av 4% PFA-løsningen er det viktig å sikre at pH er fysiologiske (7,4). Som forberedelse av PFA-løsningen innebærer oppvarming til 65 °C, må oppløsningen avkjøles ned til 25 °C før du måler pH, da dette er temperaturen der pH kalibreres på måleren.

Når du gjør det første snittet i magen, må det tas hensyn til å unngå kutt i bukorganene (protokoll avsnitt 2). Når du dissekerer overlegent mot membranen, er det viktig å unngå kutt i leveren, da det er vanlig at leveren følges med den fremre bukveggen. For å overvinne dette blir leveren forsiktig og rett og slett dissekert bort fra den fremre veggen før den fortsetter et snitt mot membranen. Når du går inn i thoracic hulrommet gjennom membranen, er det viktig å unngå kutt i hjertet, store kar og lungen. For å unngå dette holdes saksespissen overfladisk og i en akutt vinkel med ribbeina.

Den første disseksjonen for å eksponere hjertet tar omtrent 2 minutter fra det første snittet. Det forventes at i løpet av denne tiden har noe luft kommet inn i spissen av sommerfuglnålen. Innføringen av denne luften i musens sirkulasjon vil gi dårlig kvalitet perfusjon. Derfor er det kritisk at hovedlinjen åpnes og PBS skylles gjennom nålen umiddelbart før kanylering av hjertet for å fjerne luftbobler. Ideelt sett er hjertet kanylert mens en liten PBS-trickle strømmer gjennom nålespissen for å sikre fullstendig fravær av luft når du punkterer LV.

Når nålen kommer inn i LV, må den ikke gå så dypt som å introdusere nålespissen i høyre ventrikel (RV). Plassering av nålen i enten bobilen eller utenfor mitralventilen vil resultere i umiddelbar "inflasjon" av lungene når perfusjon startes. Dette er uønsket, og nålen må trekkes litt tilbake for å sikre LV-plassering. Hvis nålen er plassert riktig, vil lungene forbli flate gjennom perfusjon. Når perfusjon initieres, observeres det noen ganger at en klar væske kommer fra dyrets åpne munn. Dette skyldes vanligvis et perfusjonstrykk som er for høyt eller på grunn av feilplassering av nålen i hjertet. Forfatterne spekulerer i at forhøyet perfusjonstrykk resulterer i ekstravasasjon av perfusatet fra arteriolar kapillærsengen og retrogradstrømmen av PBS via bronkialtreet inn i spiserøret og munnhulen.

Perfusjonstrykket må senkes ved enten å redusere nivået av PBS i PBS-flasken eller ved å senke høyden på PBS-flasken. Alternativt, hvis nålen er plassert for dypt inn i venstre ventrikel, kan den bevege seg gjennom mitralventilen og levere perfusate til venstre atrium. Dette kan føre til retrograd strømning gjennom lungeårene og ekstravasasjon av perfusat i arteriolene, som beskrevet ovenfor. Grundig klaring av blod fra sirkulasjonssystemet med PBS er spesielt viktig for å unngå fixative-indusert krysskobling av blodkomponenter som resulterer i kar okklusjon ved etterfølgende fixative perfusjon. Clearance vurderes effektivt ved en fargeendring av leveren og PBS-strømmen fra et snitt i ventral halebasen. Blodclearance er vanligvis fullført med 3 min perfusjon med PBS; Men hvis visuelle tegn på klaring oppstår på kortere tidspunkter, blir fixative introdusert raskere enn 3 min. Lengre klareringstider anbefales ikke, da forsinket fikseringsperfusjon fører til artefakter i CNS finstruktur1.

Når PFA administreres, er det viktig å overvåke nivået av PFA-løsning i PFA-flasken. Fyll opp PFA-flasken hvis nivået på PFA faller til mindre enn 4 cm over munnen på PFA-flasken. Etter at perfusjonen er fullført, må perfusjonsapparatet skylles grundig med destillert vann. Dette er viktig ettersom gjenværende PFA i hovedlinjen vil forurense den første PBS-perfusjonen med PFA og resultere i perfusjon av dårlig kvalitet. Til slutt anbefales 25 G sommerfuglnåler generelt for voksne mus i gjennomsnitt i området 20-30 g. Imidlertid kan større eller mindre mus kreve litt større eller mindre gauge nåler i tillegg til justeringen av fikseringsflaskene for å gi optimale strømningshastigheter.

For CNS-disseksjon og OCT-innebygging (protokolldel 3) er det vanlig at ryggmargsvev ikke helt synker i 30% sukrose. Disse vevene er derfor igjen i sukrose i 2 dager og deretter innebygd i OCT, uansett om de synker eller ikke. Ved frysing av vev i OCT er det mulig at visse vev kan sprekke når de plasseres i avkjølt 2-metylbutan. Dette er mer vanlig med hjernen og oppstår vanligvis når for mye OCT er plassert på vevet. For å unngå dette, plasser bare nok OCT til å dekke vevsflatene før umiddelbar frysing. I noen protokoller er cracking mindre vanlig til tross for fullstendig nedsenking i OCT. Dette skyldes vanligvis en langsommere frysemetode som når du bruker tørriskjølt 2-metylbutan eller plasserer kryonomenet på en blokk med tørris direkte. Flytende nitrogenkjølt 2-metylbutane foretrekkes i dette arbeidet, da frysehastigheten er vesentlig raskere og bedre kan bevare vevsmorfologi enn langsommere frysemetoder.

Ved kryoseksjon av vevet (protokolldel 4) er det viktig å unngå flere fryse-tine sykluser. Derfor er det optimalt å kutte alle seksjoner fra en enkelt OCT-blokk for å oppnå en bestemt hjerneregion for analyse i stedet for å tine og fryse utvalgte områder på nytt. Hvis dette ikke er levedyktig, etter å ha fått noen få seksjoner, kan brukerne fryse på nytt og lagre OCT-blokkene i -80 °C dypfryser 1-2 ganger til for fremtidig bruk.

De viktigste fordelene med denne metoden fremfor mer tradisjonell pumpe- eller lufttrykklevering av perfusat er som følger: (1) lav pris og tilgjengelighet av perfusjonsapparatet. (2) Brukere trenger ikke å opprettholde trykket manuelt i perfusjonsapparatet gjennom perfusjonen. (3) Lavere og mer konsistent perfusjonstrykk enn andre rimelige alternativer for perfusjon som via sprøytelevering. Ved hjelp av Bernoullis ligning beregnes det at det tyngdekraftsfôrede perfusjonsapparatet som er konstruert her, vil opprettholde et perfusjonstrykk på ca. 73 mm Hg når de perfusatflaskene plasseres i 1 m høyde i forhold til nålen. Gitt at dette er betydelig under systolisk blodtrykk av disse dyrene, er dette perfusjonstrykket sannsynligvis tilstrekkelig lavt for å unngå vaskulær brudd12.

Forfatterne har så langt med hell brukt dette perfusjonssystemet for å oppdage tilstedeværelsen av fosforylatert α-synuklein i en musemodell av Parkinsons sykdom. I løpet av denne tiden har det ikke oppstått betydelige begrensninger med denne perfusjonsmetoden som ikke er til stede med en pumpeperfusjonsleveringsmetode. Den største begrensningen i denne teknikken er den tidkrevende karakteren av perfusjon versus dråpefiksering. Denne teknikken er å foretrekke å slippe fiksering som perfusjon resulterer i dypere penetrasjon av fixative til CNS strukturer. En annen begrensning av denne teknikken er at det krever litt kirurgisk ferdighet å utføre, da hjertet må hermuleres raskt etter inngangen til thoraxhulen. Men med erfaring kan trente brukere rutinemessig kanoulere hjertet innen 1 min etter det første snittet i magen.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Xiaowen Wang, Liam Coyne og Jason Grullon for deres hjelp til å utvikle denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskuddene AG061204 og AG063499.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific 03551-4
Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T Compound Fisher Scientific NC1029572
Artman Instruments 4.5" Straight Castroveijo Spring Action Scissors Amazon B0752XHK2X "fine scissors"
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 18 G Fisher Scientific 14-826-5D
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 22 G Fisher Scientific 14-826B
Corning PES Syringe Filters Fisher Scientific 09-754-29
Cytiva HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Fisher Scientific SH30258
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder Fisher Scientific BP9703100
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps Fisher Scientific 16-100-110 "curved fenestrated forceps"
Fisherbrand Curved Very Fine Precision Tip Forceps Fisher Scientific 16-100-123 "curved fine forceps"
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122 "straight fine forceps"
Fisherbrand Micro Spatulas with Rounded Ends Fisher Scientific 21-401-5
Fisherbrand Porcelain Buchner Funnels with Fixed Perforated Plates Fisher Scientific FB966J
Fisherbrand Premium Cover Glass, 24 x 50 Fisher Scientific 12-548-5M
Fisherbrand Premium Tissue Forceps 1X2 Teeth 5 in. German Steel Fisher Scientific 13-820-074 "skin forceps"
Fisherbrand Reusable Heavy-Wall Filter Flasks Fisher Scientific FB3002000
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-951-20 "dissecting scissors"
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-464
Fisherbrand Straight Locking Hemostats Fisher Scientific 16-100-115
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Fisherbrand Vinyl Tubing and Connector Kits, 1/4 in. Fisher Scientific 14-174-1C
Fisherbrand Wet-Strengthened Qualitative Filter Paper Circles Fisher Scientific 09-790-12F
Fisherbrand Y Connector with 1/4 in. ID - Polypropylene - QC Fisher Scientific 01-000-686
Garvey Economy Single Edge Cutter Blade Amazon B001GXFAEQ
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 488 ThermoFisher Scientific 35552
Ideal Clamp Stant High-Pressure Clamps Fisher Scientific 14-198-5A "hose clamps"
IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Low Profile Microtome Blades, Dispoisable Fisher Scientific NC9822467
Kawasumi 25 Gauge Standard Winged Blood Collection Set Fisher Scientific 22-010-137 "butterfly needle"
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06-666
Molecular Probes ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36962
Nalgene Narrow-Mouth Right-to-Know LDPE Wash Bottles ThermoFisher Scientific 2425-0506 "buffer bottles"
PAP pen abcam ab2601
Paraformaldehyde Granular Electron Microscopy Systems 19210
Pyrex Glass Drying Dishes, 34.9 x 24.9 x 6 cm Fisher Scientific 15-242D
Recombinant Anti-Alpha-synuclein (phospho S129) antibody [EP1536Y] abcam ab51253
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465-2.5kg
Stainless Steel Drinking Cup 18-oz amazon B0039PPO9U
Sucrose for Molecular Biology CAS: 57-50-1 Us Biological S8010
Triton X-100 Us Biological T8655
Vetone Fluriso Isoflurane USP MWI Animal Health 502017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tao-Cheng, J. H., Gallant, P. E., Brightman, M. W., Dosemeci, A., Reese, T. S. Structural changes at synapses after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 501 (5), 731-740 (2007).
  2. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  3. McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 146 (2019).
  4. Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (3), 389-398 (1986).
  5. Adickes, E. D., Folkerth, R. D., Sims, K. L. Use of perfusion fixation for improved neuropathologic examination. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 121 (11), 1199-1206 (1997).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
  7. Martin, L. J., et al. Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death. Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).
  8. Fujiwara, H., et al. alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions. Nature Cell Biology. 4 (2), 160-164 (2002).
  9. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
  10. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
  11. Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO Reports. 3 (6), 583-588 (2002).
  12. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14, 405-408 (2001).

Tags

Nevrovitenskap utgave 179
En tyngdekraftsmatet transkardiasjonsperfusjonsmetode for histologisk analyse av musens sentralnervesystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rana, A., Massa, P. T., Chen, X. J.… More

Rana, A., Massa, P. T., Chen, X. J. A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System. J. Vis. Exp. (179), e63386, doi:10.3791/63386 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter