Summary
En metode for intraduktiv injeksjon av reagenser for en etanolbasert ablativ løsning på musens brystkanaltre for in vivo-avbildning og forebygging av brystkreft er beskrevet. Injeksjon direkte inn i brystvorteåpningen gjør det mulig å målrette pattedyr epitelceller med minimal sikkerhetsvevsskade.
Abstract
Brystkreft er den mest utbredte kreftformen og den nest ledende årsaken til kreftrelatert død for kvinner i USA. For høyrisikokvinner er profylaktisk mastektomi den mest effektive primære forebyggingsstrategien. Profylaktisk mastektomi er en aggressiv kirurgisk prosedyre som helt fjerner pattedyrets epitelceller hvorfra brystkreft oppstår sammen med det omkringliggende vevet. Vi søker å utvikle en minimalt invasiv intraductal prosedyre som et alternativ til profylaktisk mastektomi for å lokalt fyre opp pattedyrets epitelceller før de kan bli ondartede. Vi og andre har utviklet en intraduktiv leveringsprosedyre for å nå og behandle disse epitelcellene i gnagermodeller av brystkreft. Mens musen brystkjertelen med en enkelt ikke-anastomosed duktør tre åpning på brystvorten har en mye mindre kompleks og tortuous arkitektur enn det menneskelige brystet, kjemisk indusert og genetisk konstruert mus modeller av brystkreft er verdifulle for å produsere proof-of-concept studier av nye forebyggende strategier. Her beskriver vi en prosedyre for intraductal levering av en etanolbasert ablativ løsning som inneholder mikro-CT / røntgen tantalbasert kontrastmiddel i musens brystkanaltre for terapeutisk formål med primær forebygging av brystkreft. Intraductal levering av vandige reagenser (f.eks. cytotoksiske forbindelser, siRNAer, AdCre) er tidligere beskrevet i musemodeller. Dermed fokuserer vi vår protokollbeskrivelse på metodologiske modifikasjoner og unike eksperimentelle hensyn for optimalisering av levering av etanol, for å minimere lokale og systemiske bivirkninger av etanoladministrasjon, og for in vivo-visualisering av kanaltrefylling via mikro-CT / fluoroskopiavbildning. Visualisering av kanaltreet umiddelbart etter injeksjon av en kontrastholdig løsning gir mulighet for bekreftelse av fullstendig fylling eller mislykkede resultater som underfylling eller overfylling. Denne prosedyren kan brukes til levering og avbildning av andre ablative forbindelser som tar sikte på enten å forhindre tumordannelse eller lokalt behandle tidlige svulster som er tilgjengelige via kanaltreet.
Introduction
Brystkreft er en vanlig og potensielt dødelig sykdom med få alternativer tilgjengelig for forebygging1. Den mest effektive intervensjonen er profylaktisk mastektomi; Imidlertid velger bare høyrisikopersoner å gjennomgå denne prosedyren, da det er en operasjon med store livsendrende konsekvenser2. Prosedyren fjerner helt pattedyrets epitelceller hvorfra brystkreft oppstår sammen med det omkringliggende vevet. Dette kan føre til fysisk, psykologisk og sosialt stress for individet, og fraråder ofte enkeltpersoner å fortsette med denne kirurgiske prosedyren som deres første linje med primærintervensjon.
Vi har vist at levering av en ablativ løsning som inneholder 70% etanol (EtOH) direkte inn i kanaltreet, er effektiv til å drepe pattedyr epitelceller med begrenset sikkerhetsvevsskade og ved å forhindre brysttumorer i musemodeller3. EtOH har lenge vært brukt klinisk som et ablativt eller skleroserende middel for lokal behandling. Perkutan EtOH injeksjon brukes som et ablativt middel for unresectable leversvulster, nyre- og binyre neoplasmer, og bukspyttkjertelen cystiske svulster4,5,6; for cøliaki plexus neurolyse for å redusere smerte7; og for behandling av bryst pseudoaneurysmer8. Intravaskulær EtOH injeksjon brukes som et skleroserende middel for å eliminere hevelse og deformasjon fra arteriovenøse misdannelser (AVM), og for kosmetisk behandling av edderkopp årer og åreknuter9,10,11,12,13. Som profylaktisk mastektomi, hengsler suksessen med forebygging med lokal levering av en ablativ løsning på evnen til å fjerne alle pattedyr epitelceller som kreft potensielt kan oppstå fra. Dette krever bekreftelse på at det ablative stoffet har fylt kanaltreet, og dermed kontaktet alle pattedyr epitelceller direkte. Kliniske midler for injeksjon av stoffer i brystkjertlene og visualisering av dem ved bildestyrt fluoroskopi eller dukografi er lett tilgjengelig14,15; Derfor vil det være mulig å både levere og bekrefte vellykket levering når denne prosedyren kan garantere evaluering i kliniske studier.
Å demonstrere gjennomførbarheten av denne bildestyrte tilnærmingen hos forsøksdyr er et viktig skritt i å etablere effekt og translasjonell gjennomførbarhet av intraductal (ID) ablasjon som et forebyggende tiltak for brystkreft. I vårt laboratorium har vi utviklet en metode for å injisere alle brystkjertler i mus med en ablativ løsning som inneholder et kontrastmiddel over et kurs av ukentlige injeksjoner for å sikre at dyret ikke bukker under for en overdose av EtOH (figur 1, figur 2, referansenr.3,16). Denne prosedyren plasserer en 34 G nål inne i brystvorteåpningen til en isofluranbedøvelses-bedøvet mus for å injisere testløsningen. Noen viktige forbedringer av prosedyren inkluderer bruk av gastight sprøyter for væske og gasser, injeksjon av høyere volumer per ductal trær17, og utvidet antiinflammatorisk behandling. Den prekliniske behandlingen av 5 mg/kg carprofen, en NSAID, fra 2 d før til 7 d etter ID-prosedyren er i tråd med klinisk sklerosbehandling for AVM. Vanligvis, etter systemisk anestesi, mottar pasientene antiinflammatoriske medisiner, som NSAIDs, i 2 dager etter prosedyren som kan utvides for å redusere lokal betennelse eller smerte12. Alkoholforgiftning reduseres betydelig ved intraperitoneal injeksjon av en 5% sukroseoppløsning hos mus. Ved administrering av denne sukroseløsningen kan mus trygt injiseres med opptil 160 μL 70% EtOH (opptil fire kanaltrær; ca. 0,4 g / dl EtOH-innhold i blod); dyr fullstendig gjenopprettet innen 4 timer etter ID-injeksjoner. For injeksjon av mer enn fire kjertler hos mus og / eller høyere EtOH-konsentrasjoner, utfører vi sekvensielle økter for å gi nok gjenopprettingstid. Alkoholforgiftning hos kvinner ville være en mindre bekymring på grunn av den lavere andelen alkohol som utgjør kroppsvekten. Gitt antall kanaltrær i humant bryst14,15, ca 16, og estimert volum for å fylle hver trekanal18,19, vil opptil 32 ml av 70% EtOH administreres. Denne mengden vil være mye lavere enn 50 ml av 95% EtOH administrert i andre kliniske prosedyrer4,9. Intravenøs administrering av tiamin- og glukoseoppløsning kan brukes til ytterligere å minimere effekten av EtOH-forgiftning, spesielt i tilfeller der et større totalt volum av EtOH kanskje må injiseres og/eller for kvinner som har lavere toleranse for alkoholforbruk (f.eks. alleliske varianter i alkohol eller aldehyddehydrogenaser).
Ved å avbilde via mikro-CT/fluoroskopi kan vi bekrefte vellykket kanalfylling av hver kjertel (figur 1, figur 2, bilde 3). Dette kan registreres for fremtidig analyse, eller vurderes i øyeblikket via sanntids fluoroskopiavbildning, som det ville bli gjort i klinisk anvendelse, for å begrense den totale strålingsbyrden som pålegges dyret. For ytterligere å forbedre spesifikke funksjoner i denne ablative løsningen for sanntids bildestyrt levering in vivo, sammenlignet vi tidligere FDA-godkjent jodholdig kontrast til et tantaloksid (TaOx)-inneholdende nanopartikkel syntetisert av Shapiro lab3,16. TaOx viste overlegen ytelse som et mikro-CT kontrastmiddel for visualisering av den første fyllingen av kanaltreet (figur 2, figur 3). TaOx kan brukes som referansekontrast for å utføre en mer systematisk og langsgående vurdering av andre nanopartikkelbaserte kontrastmidler i blodpoolen (f.eks. jod-, vismut- eller gullholdig) og kompatibilitet med TaOx med forskjellige konsentrasjoner av etylcellulose som gellingmiddel20,21.
Protocol
Alle eksperimentene som er beskrevet her ble utført under protokoller godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Michigan State University.
1. Utvidet antiinflammatorisk behandling
- Sørg for at mus som mottar injeksjonsløsninger som inneholder EtOH eller andre potensielle irriterende stoffer, får antiinflammatorisk behandling fra 2 dager før injeksjon til 7 dager etter injeksjon. Den foretrukne metoden for dosering er oral levering gjennom en sucralose gel kopp som inneholder carprofen i en passende konsentrasjon.
- Forbered carprofen med ønsket konsentrasjon. For dette eksperimentet ble en arbeidsløsning på 2 mg/ml (lageroppløsning 50 mg/ml) fremstilt ved fortynning i steril PBS for å injisere 0,5 ml for å oppnå en sluttdose på 1 mg per kopp. Tilsett 1% v / v steril blå matfargestoff (BFD) i stedet for en brøkdel av PBS av det totale volumet som trengs for fortynning for bedre å visualisere fullstendig blanding av stoffet i sucralose gel.
- Forbered en kopp for carprofen tillegg i henhold til produsentens anbefaling. Med mindre annet er anbefalt, plasser koppen i 60 °C vannbad i 15 minutter. Fjern koppene og tørk dem av for å minimere muligheten for forurensning.
- Bruk 70 % EtOH eller en EtOH-klut til å rengjøre overflaten på kopplokket og la det tørke. Bruk en sprøyte til å injisere den nødvendige mengden karprofenoppløsning gjennom lokket. For dette eksperimentet injiseres 500 μL. Dekk injeksjonsstedet med et klistremerke og rist kraftig i 15 s.
- Virvel koppen i 15 s, og lagre deretter for senere bruk etter visuelt verifisering av fullstendig blanding. Kontroller koppene for homogen blanding ved å lete etter mørkeblå klumper. La koppene komme til romtemperatur før du flytter til kjøleskapet for lagring opptil en måned.
MERK: Disse koppene kan også lagres ved romtemperatur når de er dosert, om nødvendig, men pass på å være oppmerksom på legemiddeleffektveiledning fra produsenten. Dating klistremerket hjelper med å holde oversikt over injeksjonsdatoen uten å risikere en penn eller skarp markør punktering lokket.
- Når du er klar til bruk, tørk av utsiden av koppen med 70% EtOH. Skrell av lokket og legg koppen i buret med musene. Skift ut koppene annenhver dag eller når de er tomme. En kopp skal være nok for opptil fem mus i 1-2 dager.
2. Preoperativ forberedelse
MERK: Dette trinnet vil skje 2-3 dager før injeksjonen.
- Bedøv musen ved hjelp av en isofluran fordamper (2%-3% isofluran, 1,5 l / min oksygen) og påfør øyesmøremiddel. Oppretthold anestesi ved 1%-3% isofluran etter behov gjennom hele prosedyren med en nesekegle mens du nøye overvåker dyrets åndedrettsfrekvens.
- Påfør øyesmøremiddelet på museøyne mens du er ved nesekjeglen, og plasser deretter musen på ryggen. Bruk en bomullsspisset applikator for å påføre over-the-counter depilatorisk krem til brystvorten området (området av brystkjertelen som vil bli injisert). Gni kremet inn i området i 10-30 s med applikatoren for å løsne pelsen raskt.
MERK: Ikke la kremen stå på dyret lenger enn nødvendig og fjern den helt for å unngå å brenne huden. - Etter 10-30 s av søknaden, bruk varmt vann på gasbind for å fjerne kremen helt og løsne pelsen fra dyret. Utfør minst to til fire skyllinger av området med frisk gasbind for kremfjerning før tørking med en ren tørr gasbind etter den endelige skyllingen. Kontroller området for pelsfjerning for å bekrefte god synlighet og tilgang til brystvorten. Gjenta med depilatorisk krempåføring om nødvendig.
- Plasser musen i et separat rent, tørt gjenopprettingsbur på en varmepute for å gjenopprette fra anestesi. Vær oppmerksom på musen til den er fullstendig gjenopprettet fra anestesi og returner den til hjemmeburet.
- Gi mus en kopp sucralose geloppløsning som inneholder carprofen (1 mg/kopp) for pre-dosering av det antiinflammatoriske middelet etter gjenoppretting. En kopp kan gi opptil fem mus med carprofen i opptil 2 dager. Sjekk koppen daglig og skift ut etter behov, eller annenhver dag hvis den ikke er fullt konsumert.
3. Intraduktal injeksjon
MERK: Dette trinnet vil skje 2-3 dager etter preoperativ forberedelse.
- Forbered 333,3 mM tantaloksid (TaOx) lagerløsning fra anskaffet pulverformulering som beskrevet i16 ved hjelp av fosfatbufret saltvann (PBS). Bruk mild varme hvis pulveret ikke oppløses helt i løsningen.
- Lag en ablativ bildeløsning ved å blande tre deler lager TaOx med syv deler 100% EtOH for en endelig 70% EtOH 100mM TaOx-løsning . Tilsett 1% v / v blå matfargestoff til den endelige løsningen for hjelpevisualisering under injeksjon. Forbered et volum basert på behov for eksperimentet.
MERK: Kjertelpar 1 og 5 kan holde opptil 30 μL av oppløsningen, mens alle andre par kan injiseres med opptil 50 μL i 9 uker eller eldre FVB-mus. - Bedøv musen med isofluran som i preoperativ forberedelse og flytt musen til nesekjeglen når den er fullstendig bedøvet. Påfør øyesmøremiddel før du legger dyret på ryggen for injeksjonen. Fest musen under stereoskopet ved hjelp av tape om nødvendig.
- Forbered sprøyten med ønsket injeksjonsvolum. Legg 21-51 μL av injeksjonsoppløsningen i en 50 μL sprøyte med en 34 G kanyle festet. Last en ekstra 1 μL av løsningen for å ta hensyn til potensiell lekkasje av det volumet etter at nålen er fjernet fra brystvorten.
MERK: Volumene ovenfor er for de typiske prosedyrene som presenteres her. Man kan injisere ethvert volum som ønskes med forståelsen av at de fleste kjertler vil bli overfylt hvis man går over 30 μL eller 50 μL i kjertelpar henholdsvis 1 og 5, eller 2-4. Det er nyttig å fylle nålen med ekstra volum av injeksjonsoppløsningen for å teste for fri flyt av løsningen umiddelbart før injeksjonen. Hvis du injiserer mer enn en brystkjertel, fyll flere sprøyter for å spare tid. La imidlertid ikke oppløsningen stå i sprøyten lenge. - Forbered brystvorten til injeksjonen ved å fjerne død hud som dekker brystvorteåpningen med fine spisse tang.
- Hold brystvorten forsiktig med pinsett. Når nålen er synlig, setter du nålen inn i brystvorteåpningen til skråkanten er helt dekket med veiledningshjelp fra finspissede tang. Det kan være nødvendig å trekke brystvorten opp på nålen i stedet for å skyve nålen inn i brystvorten (tabell 1).
- Når nålekanten er helt omgitt av brystvorten og er i hovedkanalen, begynner du å injisere løsningen med en jevn hastighet på ca. 40 μL / min. Unngå å injisere for raskt for å sikre at kanaltreet ikke blir skadet. Hold nålen i brystvorten i 30 s etter at volumet er fullstendig injisert før du fjerner nålen med hjelp ved hjelp av tangene. Dette gjøres for å unngå at oppløsningen søler ut av brystvorten (figur 2).
- Vurder området for tegn på mislykket injeksjon. Et kuppelformet utseende kan indikere en fettputeinjeksjon eller traumer til området.
- Fortsett å injisere de resterende brystkjertlene.
- Mens dyret fortsatt er bedøvet, injiser 200-250 μL 5% sukroseoppløsning (opptil 10 ml / kg) intraperitonealt for å minimere de potensielle effektene av alkoholforgiftning.
4. mikro-CT-avbildning
- Etter å ha injisert alle de ønskede kjertlene, flytt dyret raskt til mikro-CT-systemet og fortsett å opprettholde anestesi ved hjelp av den inkorporerte isofluran fordamperen. Dyret kan teipes for å standardisere bildeposisjonen. For eksempel bidrar teiping av hvert bakben i en utvidet posisjon til å holde dyrets benben lenger fra de nedre kjertlene av interesse for det resulterende bildet.
MERK: Dyrene kan avbildes ved hjelp av forskjellige skanneparametere for visualisering av kanaltreet hvis det tas hensyn til å bestemme en passende akseptabel livstidsdose av stråling for dyret, og de kumulative dosene overstiger ikke dette nivået. Fluoroskopi stillbilder og videoer kan genereres uten å utføre skanninger for å redusere strålingseksponeringen ytterligere (figur 2). - Plasser musen i riktig synsfelt med forhåndsvisningsfunksjonen fluoroskopi.
- Utfør TaOx-avbildning av museknukttreet med god oppløsning og mulighet for gjentatte standard (2 min) anskaffelsesskanninger. Bruk følgende skanneparametere: 90 kVp/88 μA; synsfelt (FOV), 36 mm; antall stykker, 512; skivetykkelse, 72 μm; voxel oppløsning, 72 μm3.
- Skaff deg lengre (4 eller 14 min) skanninger med høy oppløsning for enda bedre oppløsning hos dyr. Disse er akseptable som terminalprosedyrer før eutanasi. Disse er imidlertid ikke akseptable for dyr å bli skannet langsgående ved hjelp av de samme parametrene som det vil forårsake strålingssykdom.
- Etter ferdigstillelse av bildeprotokollen, fjern dyret fra anestesi og overfør til et eget rent, tørt gjenopprettingsbur på en varmepute. Vær oppmerksom på dyret til det er helt gjenopprettet, og returner det deretter til hjemmeburet. Hold dyrene injisert med ablativ oppløsning på karprofen til 7 dager etter injeksjon.
- Lag raske gjengivelser av skannede bilder i mikro-CT-programvaren (innebygd system) for bedre å sette pris på eventuelle kontrastlekkasjer eller mangel på fylling (figur 2) uten formell analyse.
- Utfør ytterligere formell bildeanalyse for publisering eller detaljert analyse av skanninger som tillater segmentering av interesseområdet hvis ønskelig (figur 3).
MERK: Den primære forskjellen mellom disse metodene vil være evnen til å terskele bare kanaltreet (formell gjengivelse) kontra å måtte terskelere hele bildet (rask gjengivelse). Andre målinger og bilder kan genereres ved hjelp av programvarepakkene for best å demonstrere suksessen med kanaltrefylling.
5. Bildeanalyse
- Utfør gjengivelse av det injiserte kanaltreet ved hjelp av en spesialisert programvarepakke. For å gjøre dette, segmenter ut mammaryfettputen med videre bildebehandling.
- For å segmentere fettputen (mørkere rom sammenlignet med bukhulen, lårmuskulaturen og huden) der kanaltreet av interesse er inneholdt, velger du Spline Trace-alternativet fra den manuelle menyen. Spor fettputeomrisset ved hvert tredje datastykke.
- Klikk på Overfør objekter alternativet fra den halvautomatiske menyen for å koble alle sporede og ikke-sporede stykker til ett enkelt objekt.
- Velg alternativet Terskelvolum fra den halvautomatiske menyen for å angi ønsket HU-område (300-3000 HU er et godt utgangspunkt), og klikk deretter på Terskelgjengivelse-knappen for å opprette en gjengivelse som bare viser kontrasten (TaOx) i kanaltreet og eliminerer mykt vev.
- Sett Vis -knappen til Gjengivelse som Primær for å vise bare 3D-gjengivelsen uten omkringliggende strukturer.
MERK: Ytterligere programvarefunksjoner gjør det mulig å foreta målinger av 3D-gjengivelsen (dvs. lengde, volum osv.).
Representative Results
Kvinnelige mus har fem par brystkjertler med et enkelt kanaltre som åpnes ved brystvorten orifice22. På spissene til det utviklende kanaltreet er terminale endeknopper (TEBs), proliferative strukturer som styrer vekst og forgrening. Etter puberteten når forlengelsesfasen er fullført, går TEBs tilbake og blir funksjonelt og anatomisk uutslettelig fra terminalkanaler eller alveolarknopper23. Terminale kanalformede lobulære enheter tjener en lignende funksjon hos mennesker som TEB-er gjør hos mus og er stedene hvor brystkreft hovedsakelig oppstår24,25. Vi kan injisere opptil 50 μL 70% EtOH-løsning for å fylle hele kanaltreet av thorax- og magepattedyrkjertler av 9 uker gamle FVB / N, NSG og andre musestammer (figur 1, figur 2, figur 3, se referanser3,16). I et typisk eksperiment kan vi injisere opptil åtte brystkjertler med en ablativ løsning på 70% EtOH og 100 mM TaOx i to påfølgende ID-prosedyrer skilt med 7 dager for å tillate dyregjenoppretting (figur 2). Dyr avbildes av mikro-CT umiddelbart etter siste ID-injeksjon for å vurdere vellykket levering av løsningen til hele kanaltreet (figur 2). Etter vår erfaring er brystvorten av inguinale kjertler egnet for injeksjon hos ca 60% av dyrene, og brystvorten av livmorhalskjertler i ca 40%. Når det passer, kan vi injisere opptil 30 μL 70% EtOH-løsning for å fylle hele kanaltreet av livmorhals- og inguinale brystkjertler (figur 2). FVB- og NSG-stammer presenterer generelt mer egnede brystvorter for injeksjon enn C57BL/6J eller blandede genetiske bakgrunnsstammer. Helde mount dual staining protocol eller 3D confocal microscopy er gode ortogonale metoder for å bekrefte i hvilken grad kanaltreet ble fylt (figur 3). Disse vevskorreleringsanalysene er kompatible med og kan utføres etter in vivo-avbildning. Den åpenbare begrensningen av disse ortogonale metodene er at de krever dyreavslutning for vevsinnsamling og analyse; I en optimaliseringsfase av en ny ablativ formulering gir de imidlertid uavhengig validering.
Figur 1: Arbeidsflyt for intraductal prosedyre og bildeanalyse. Viktige trinn i ID-prosedyren er uthevet. Se videoen for mer informasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vellykket kannasjon og levering av ablativ løsning på flere brystkjertler. (A) Representativ brystvortevariasjon i FVB- og NSG-musestammer. Lange brystvorter er lettere å kanylere enn korte brystvorter, mens for korte eller vestigiale brystvorter ikke kanyleres. Når den er kanylert, påvirker størrelsen på brystvorten ikke vellykket intraductal levering. (B) Grov anatomisk analyse av blått fargestoff i en ablativ løsning gir ex vivo bevis på ductal trefylling og leveringssuksess. (C,D) Sanntids fluoroskopi og 3D-mikro-CT-gjengivelse etter bilde gir in vivo bevis på leveringssuksess. (D) Vellykket injeksjon av både buk- og inguinalkjertler, og tre av fire thoraxkjertler (fettputeinjeksjon i kjertelen #2). Skalalinjer tilsvarer 1 mm i bilder med forskjellig forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: In vivo og ex vivo demonstrasjon av rørtrefylling. 70% EtOH / 100 mM TaOx nanopartikler / Evans Blue-løsning ble intraductally injisert i musens abdominale brystkjertel og umiddelbart avbildet av mikro-CT og behandlet for dobbel hel monteringsfarging. Kanaltreet ble rekonstruert ved hjelp av en programvarepakke for bildeanalyse. Løsningen fyller helt karmin alum-farget kanaltre. En separat kjertel ble immunostert for E-Cadherin (Cdh1), ryddet ved hjelp av Benzylalkohol:Benzylbenzoat og avbildet ved konfokal mikroskopi som beskrevet26. Kanaltreet ble rekonstruert ved hjelp av programvare for bildeanalyse. Pseudo-coloring gjengivelse av konfekt bilde (dvs. svart bakgrunn til hvit, grønn markør signal til magenta) ble oppnådd med bildet invertering funksjon av bilderedigering programvare. Skalalinjer tilsvarer 1 mm i bilder med forskjellig forstørrelse. Dette tallet er endret fra referanse nr.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Utstede | Utseende | Løsning | |||
| Kort brystvorte (fig. 2) | Brystvorten har lav profil - vanskelig å ta tak i | Det er noen ganger lettere å holde huden nær brystvorten og målrette midten av brystvorten med nålen. Nålen vil sannsynligvis dykke under huden. Å trekke sakte opp kan avsløre brystvorten å være litt over spissen av nålen og gi plass til å gripe og trekke den resten av veien på nålen. Vær veldig forsiktig når du dykker under huden om nålens vinkel. Det er lett å utilsiktet få en fett pute injeksjon ved å stikke i feil vinkel. | |||
| Fett brystvorte | Mye større enn andre brystvorter med liten peelbar død hud – lett synlig uten omfang | Veldig lett å få en fett pute injeksjon på disse brystvortene. Vær veldig forsiktig med nålens vinkel når du setter den inn i brystvorten. | |||
| Fettputeinjeksjon (fig. 2) | Hovent rundt brystvorten og muligens i brystvorten selv - enklest å se om farge legges til injeksjonsoppløsning | Hvis brystvorten er hevelse med de første få ul injisert, fjern nålen, og prøv å sette inn igjen med mer forsiktighet tatt av vinkel. Begynn injeksjonen igjen og se etter ytterligere hevelse. Hvis hevelsen fortsetter, forlat forsøket. Det er svært sjelden å injisere en brystvorte som har startet som en fett pute injeksjon. | |||
| Sår/scabbing | Åpent sår eller scabbing nær injeksjonsstedet til EtOH-oppløsning | Påfør trippel antibiotikasalve for å åpne sår, men la scabbed sår være i fred. Å bruke salve på scabs kan øke sannsynligheten for at dyr vil plage scab og fjerne den. Kontroller hver 1-2 dager til den er helbredet avhengig av alvorlighetsgraden av såret. Carprofen bør gis til den er helbredet selv om den er utenfor det normale vinduet. | |||
Tabell 1: Feilsøking og nyttige tips.
Discussion
Profylaktisk mastektomi er for tiden den mest effektive intervensjonen for brystkreft, men den har noen alvorlige negative konsekvenser. Lokal ablasjon av pattedyr epitelceller med en EtOH-basert løsning er en lovende alternativ terapi som vi demonstrerte i en konseptgodkjenningsstudie om den aggressive FVB-Tg-C3(1)-TAg musemodellen av brystkreft3. ID-injeksjon av denne ablative løsningen muliggjør målretting av pattedyrets epitelceller hvorfra brystkreft oppstår med begrenset sikkerhetsskade. Tilsetning av et røntgenkontrastmiddel til den ablative løsningen gir økt forståelse av effektiviteten av løsningen ved forebygging, da vi kan se om hvert kanaltre er vellykket fylt etter injeksjon (figur 2B). Visning av injiserte kjertler ved fluoroskopi umiddelbart etter injeksjon speiler hva som sannsynligvis vil bli gjort i klinikken for å bekrefte vellykket fylling av kanaltreet. Visuell bekreftelse på løsningslevering vil best informere om alle deler av treet er nådd i sanntid. Dette kan føre til at ytterligere injeksjon kan utføres for å fullføre fyllingen på det tidspunktet eller i en fremtidig økt. Det er av stor betydning at ablativ løsning når alle deler av kanaltreet for å sikre at alle epitelceller kan nås for drap (figur 3). Å etterlate seg levende epitelceller i treet ville tillate muligheten for at brystkreft fortsatt kunne oppstå. Bruk av kontrast i ID-injeksjoner til bildesuksess av injeksjonen kan også være nyttig for andre formuleringer. Tabell 1 inneholder feilsøking og nyttige tips. Andre studier har beskrevet ID-leveringsprotokoller for viruspartikler (f.eks. AdCre, CRISPR-guide RNAer), hormoner, cytotoksiske forbindelser, siRNAer og/eller målrettingsmidler hos mus3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ,38, rotter24,32,39,40,41, og kaniner42,43,44,45,46,47. Uavhengige kliniske studier rapporterte vellykket kannkulasjon på opptil åtte kanaler per bryst for lokal levering av kjemoterapi40,48,49. Å visualisere full fylling når du leverer andre løsninger rettet mot forebygging eller rettet mot behandling, vil være verdt av lignende grunner. Kunnskapen om at løsningen har nådd alle grener og terminalender av treet vil være informativ i vurderingen av vellykket forebygging eller behandling.
Vi er ikke klar over andre intraductal avbildningsmetoder hos mus33,34 eller andre dyremodeller47 som har råd til den høye oppløsningen av TaOx nanopartikler. Vær oppmerksom på at TaOx i murinkanaltreet overgår FDA-godkjente kontrastmidler for diagnostisk dukografi3,16. Når vi fortsetter å vurdere ID-ens ablative prosedyre for dens evne til å forebygge brystkreft, vil vi kunne bestemme nærmere nøyaktig hvilke kjertler kreft oppstår ved hjelp av tilsatte data gitt gjennom avbildning etter ID-levering. For eksempel kan man avgjøre om en kjertel som bare var delvis fylt er mer sannsynlig enn en ikke-injisert kjertel for å resultere i tumordannelse, som adresserer sikkerhetsprofilen og bekymringen for mislykkede injeksjoner på en høyrisikokvinne. Denne teknikken har noen begrensninger. Dette er en relativt utfordrende museteknikk som krever fingerferdighet og dyktighet fra operatøren for å manipulere og lykkes med å kanylere hver kanal. Hver enkelt injeksjon er en uavhengig hendelse og dermed mislykket injeksjon på en eller flere kjertler kan kompromittere resultat tolkning. Gitt størrelsen på murinpattedyrkjertelen og skjørheten i brystvorten, er fluoroskopi eller lignende bildeveiledningsteknikk ikke tilgjengelig for å informere i sanntid når infusjonen skal stoppes. Denne sanntids bildeveiledningen vil være et krav for klinisk implementering av lokal levering av en ablativ løsning.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av National Cancer Institute R21 CA226579 og R01 CA258314 tilskudd til AKU og av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 stipend til EMS. Vi vil takke MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core for bruk av bildesystemer og teknisk ekspertise. Vi vil takke Dr. Danielle Ferguson for å ha gjennomgått innholdet i videoen og tallene for overholdelse av retningslinjer for dyrevelferd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
| Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
| Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
| Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
| Imaris | Bitplane | n/a | For confocal image processing |
| MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
| Model 1705 RN Syringe, 50μL | Hamilton | 7655-01 | For intraductal injection |
| Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
| Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
| Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) | Hamilton | 207434 | For intraductal injection |
| Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
| Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
| Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
| Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
| Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
| Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
| Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |
References
- Britt, K. L., Cuzick, J., Phillips, K. A. Key steps for effective breast cancer prevention. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 417-436 (2020).
- Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
- Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
- Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
- Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal Gastroenterol. 18 (10), 1003-1008 (2012).
- Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal Gastroenterol. 19 (22), 3397-3403 (2013).
- Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
- Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the Breast Treated with Percutaneous Ethanol Injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
- Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutics Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
- Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
- Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
- Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
- Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
- Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
- Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
- Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50692 (2013).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
- Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Transactions of Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
- Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
- Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
- Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Res Treat. 73 (1), 75-83 (2002).
- Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
- Arora, R., et al. Insights from imaging the implanting embryo and the uterine environment in three dimensions. Development. 143 (24), 4749-4754 (2016).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Science Translational Medicine. 6 (217), (2014).
- de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
- Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast- A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 903-913 (2019).
- Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
- Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
- Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
- Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
- Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51171 (2014).
- Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59502 (2019).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4030 (2012).
- Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translation Medicine. 3 (106), (2011).
- Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
- Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. The Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. The Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
- Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. Biochemistry Journal. 115 (5), 58 (1969).
- Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
- Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
- Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal Visualized Experiments: JoVE. (121), e55209 (2017).
- Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Prevention Research (Philadelphia). 6 (1), 51-58 (2013).
