Summary
En metode til intraduktal injektion af reagenser til en ethanolbaseret ablativ opløsning til musebrystkanaltræet til in vivo-billeddannelse og forebyggelse af brystkræft er beskrevet. Injektion direkte i brystvorteåbningen gør det muligt at målrette brystepitelceller med minimal sikkerhedsvævsskade.
Abstract
Brystkræft er den mest udbredte kræft og den næststørste årsag til kræftrelateret død for kvinder i USA. For højrisikokvinder er profylaktisk mastektomi den mest effektive primære forebyggelsesstrategi. Profylaktisk mastektomi er en aggressiv kirurgisk procedure, der fuldstændigt fjerner brystepitelcellerne, hvorfra brystkræft opstår sammen med det omgivende væv. Vi søger at udvikle en minimalt invasiv intraduktal procedure som et alternativ til profylaktisk mastektomi for lokalt at ablate brystepitelcellerne, før de kan blive ondartede. Vi og andre har udviklet en intraduktal leveringsprocedure for at nå og behandle disse epitelceller i gnavermodeller af brystkræft. Mens musebrystkirtlen med en enkelt ikke-anastomoseret duktal træåbning ved brystvorten har en meget mindre kompleks og snoet arkitektur end det menneskelige bryst, er kemisk inducerede og genetisk manipulerede musemodeller af brystkræft værdifulde til at producere proof-of-concept-undersøgelser af nye forebyggende strategier. Her beskriver vi en procedure for intraduktal levering af en ethanolbaseret ablativ opløsning indeholdende mikro-CT/røntgentantalbaseret kontrastmiddel i musebrystkanalens træ med det terapeutiske formål primær forebyggelse af brystkræft. Intraduktal levering af vandige reagenser (f.eks. cytotoksiske forbindelser, siRNA'er, AdCre) er tidligere beskrevet i musemodeller. Således fokuserer vi vores protokolbeskrivelse på metodologiske modifikationer og unikke eksperimentelle overvejelser for optimering af levering af ethanol, for at minimere lokale og systemiske bivirkninger af ethanoladministration og for in vivo-visualisering af duktal træfyldning via mikro-CT / fluoroskopi billeddannelse. Visualisering af duktaltræet umiddelbart efter injektion af en kontrastholdig opløsning muliggør bekræftelse af fuldstændig påfyldning eller mislykkede resultater såsom underfyldning eller overfyldning. Denne procedure kan anvendes til levering og billeddannelse af andre ablative forbindelser med det formål enten at forhindre tumordannelse eller lokalt behandle tidlige stadier af tumorer, der er tilgængelige via duktaltræet.
Introduction
Brystkræft er en almindelig og potentielt dødelig sygdom med få muligheder for forebyggelse1. Den mest effektive intervention er profylaktisk mastektomi; Det er dog kun personer med høj risiko, der vælger at gennemgå denne procedure, da det er en operation med store livsændrende konsekvenser2. Proceduren fjerner fuldstændigt brystepitelcellerne, hvorfra brystkræft opstår sammen med det omgivende væv. Dette kan resultere i fysisk, psykologisk og social stress for den enkelte og afskrækker ofte enkeltpersoner fra at fortsætte med denne kirurgiske procedure som deres første linje af primær intervention.
Vi har påvist, at levering af en ablativ opløsning indeholdende 70 % ethanol (EtOH) direkte ind i duktaltræet er effektiv til at dræbe brystepitelceller med begrænset sikkerhedsvævsskade og til at forebygge brysttumorer i musemodeller3. EtOH har længe været anvendt klinisk som et ablativt eller skleroserende middel til lokal behandling. Perkutan EtOH-injektion anvendes som et ablativt middel til ikke-resekterbare levertumorer, nyre- og binyresyreneoplasmer og cystiske tumorer i bugspytkirtlen4,5,6; til cøliaki plexus neurolyse for at reducere smerte7; og til behandling af brystpseudoneurismer8. Intravaskulær EtOH-injektion anvendes som et skleroserende middel til at eliminere hævelse og deformation fra arteriovenøse misdannelser (AVM) og til kosmetisk behandling af edderkopper og åreknuder9,10,11,12,13. Ligesom profylaktisk mastektomi afhænger forebyggelsens succes med lokal levering af en ablativ opløsning af evnen til fuldstændigt at fjerne alle brystepitelceller, hvorfra kræft potentielt kan opstå. Dette kræver bekræftelse på, at det ablative stof med succes har fyldt duktaltræet og dermed kontaktet alle brystepitelceller direkte. Kliniske midler til injektion af stoffer i brystkirtlerne og visualisering af dem ved hjælp af billedstyret fluoroskopi eller kanalografi er let tilgængelige14,15; Det vil derfor være muligt både at levere og bekræfte en vellykket levering, når denne procedure kan berettige evaluering i kliniske forsøg.
At demonstrere gennemførligheden af denne billedstyrede tilgang hos forsøgsdyr er et vigtigt skridt i retning af at fastslå effektiviteten og den translationelle gennemførlighed af intraduktal (ID) ablation som en forebyggende foranstaltning mod brystkræft. I vores laboratorium har vi udviklet en metode til med succes at injicere alle brystkirtler i mus med en ablativ opløsning indeholdende et kontrastmiddel i løbet af ugentlige injektioner for at sikre, at dyret ikke bukker under for en overdosis etOH (figur 1, figur 2, reference nr. 3,16). Denne procedure placerer en 34 G-nål inde i brystvorteåbningen af en isofluran-anæstesiiseret mus for at injicere testopløsningen. Nogle vigtige forbedringer af proceduren omfatter brugen af gastætte sprøjter til væske og gasser, injektion af højere volumener pr. duktale træer17 og udvidet antiinflammatorisk behandling. Den prækliniske behandling af 5 mg/kg carprofen, et NSAID, fra 2 d før til 7 d efter ID-proceduren er i overensstemmelse med behandlingen af klinisk skleroserende behandling for AVM. Efter systemisk anæstesi modtager patienterne typisk antiinflammatoriske lægemidler, såsom NSAID'er, i 2 dage efter proceduren, der kan forlænges for at afbøde enhver lokal betændelse eller smerte12. Alkoholforgiftning mindskes signifikant ved intraperitoneal injektion af en 5% saccharoseopløsning i mus. Ved administration af denne saccharoseopløsning kan mus sikkert injiceres med op til 160 μL 70% EtOH (op til fire duktale træer; ca. 0,4 g / dl EtOH-indhold i blod); dyr, der er fuldt genoprettet inden for 4 timer efter ID-injektioner. Til injektion af mere end fire kirtler i mus og / eller højere EtOH-koncentrationer udfører vi sekventielle sessioner for at give tilstrækkelig restitutionstid. Alkoholforgiftning hos kvinder ville være en mindre bekymring på grund af den lavere andel af alkoholmængde til kropsvægt. I betragtning af antallet af kanaltræer i menneskebryst14,15, ca. 16 og anslået volumen til at fylde hver trækanal18,19, vil op til 32 ml 70% EtOH blive administreret. Denne mængde vil være meget lavere end de 50 ml etOH, der administreres i andre kliniske procedurer4,9. Intravenøs administration af thiamin og glucoseopløsning kan anvendes til yderligere at minimere virkningerne af EtOH-forgiftning, især i tilfælde, hvor det kan være nødvendigt at injicere et større samlet volumen EtOH og/eller for kvinder, der har en lavere tolerance over for alkoholforbrug (f.eks. allelvarianter i alkohol eller aldehyddehydrogenaser).
Billeddannelse via mikro-CT / fluoroskopi giver os mulighed for at bekræfte en vellykket kanalfyldning af hver kirtel (figur 1, figur 2, figur 3). Dette kan registreres med henblik på fremtidig analyse eller vurderes i øjeblikket via fluoroskopi i realtid, som det ville ske i klinisk anvendelse, for at begrænse den samlede strålingsbyrde, der pålægges dyret. For yderligere at forbedre specifikke egenskaber ved denne ablative løsning til billedstyret levering i realtid in vivo sammenlignede vi tidligere FDA-godkendt jodholdig kontrast med et tantaloxid (TaOx)-indeholdende nanopartikel syntetiseret af Shapiro-laboratoriet3,16. TaOx viste overlegen ydeevne som et mikro-CT-kontrastmiddel til visualisering af den indledende fyldning af duktaltræet (figur 2, figur 3). TaOx kan anvendes som referencekontrast til at udføre en mere systematisk og langsgående vurdering af andre nanopartikelbaserede blodpoolkontrastmidler (f.eks. jod-, vismut- eller guldholdige) og TaOx's kompatibilitet med forskellige koncentrationer af ethylcellulose som geleringsmiddel20,21.
Protocol
Alle de her beskrevne forsøg blev udført under protokoller godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Michigan State University.
1. Udvidet antiinflammatorisk behandling
- Sørg for, at mus, der modtager injektionsopløsninger indeholdende EtOH eller andre potentielle irriterende stoffer, får antiinflammatorisk behandling fra 2 dage før injektion til 7 dage efter injektion. Den foretrukne doseringsmetode er oral levering gennem en sucralose gelkop indeholdende carprofen i en passende koncentration.
- Forbered carprofen med den krævede koncentration. Til dette forsøg blev der fremstillet en arbejdsløsning på 2 mg/ml (Stock-opløsning er 50 mg/ml) ved fortynding i steril PBS for at injicere 0,5 ml for at opnå en endelig dosis på 1 mg pr. kop. Tilsæt 1% v / v sterilt blåt madfarvestof (BFD) i stedet for en brøkdel af PBS af det samlede volumen, der er nødvendigt for fortynding for bedre at visualisere fuldstændig blanding af lægemidlet i sucralose gelen.
- Forbered en kop til carprofen tilsætning i henhold til producentens anbefaling. Medmindre andet anbefales, anbringes koppen i 60 °C vandbad i 15 minutter. Fjern kopperne og tør dem af for at minimere muligheden for forurening.
- Brug 70% EtOH eller en EtOH-aftørring til at rengøre overfladen af koplåget og lade det tørre. Brug en sprøjte til at injicere den nødvendige mængde carprofenopløsning gennem låget. Til dette eksperiment injiceres 500 μL. Dæk injektionsstedet med et klistermærke og ryst kraftigt i 15 s.
- Vortex koppen i 15 s, og opbevar derefter til senere brug efter visuel verifikation af fuldstændig blanding. Kontroller kopperne for homogen blanding ved at kigge efter mørkeblå klumper. Lad kopperne komme til stuetemperatur, inden de flyttes til køleskabet til opbevaring i op til en måned.
BEMÆRK: Disse kopper kan også opbevares ved stuetemperatur, når de er doseret, hvis det er nødvendigt, men pas på at være opmærksom på vejledning om lægemiddeleffektivitet fra producenten. Datering af klistermærket hjælper med at holde styr på injektionsdatoen uden at risikere, at en pen eller skarp markør punkterer låget.
- Når du er klar til brug, skal du tørre koppens yderside af med 70% EtOH. Skræl låget af og læg koppen i buret med musene. Udskift kopperne hver anden dag, eller når de er tomme. En kop skal være nok til op til fem mus i 1-2 dage.
2. Præoperativ forberedelse
BEMÆRK: Dette trin vil forekomme 2-3 dage før injektionen.
- Anæstesi musen ved hjælp af en isofluranfordamper (2% -3% isofluran, 1,5 L / min ilt) og påfør øjensmøremiddel. Oprethold anæstesi ved 1% -3% isofluran efter behov under hele proceduren med en næsekegle, mens du nøje overvåger dyrets respirationshastighed.
- Påfør øjets smøremiddel på museøjnene, mens du er ved næsekeglen, og placer derefter musen på ryggen. Brug en applikator med bomuldsspids til at påføre hårfjerningscreme i håndkøb på brystvorten (det område af brystkirtlen, der vil blive injiceret). Gnid cremen ind i området i 10-30 s med applikatoren for at hjælpe med at løsne pelsen hurtigt.
BEMÆRK: Efterlad ikke cremen på dyret længere end nødvendigt, og fjern den helt for at undgå at brænde huden. - Efter 10-30 s af applikationen skal du bruge varmt vand på gasbind for helt at fjerne cremen og løsne pelsen fra dyret. Udfør mindst to til fire skylninger af området med frisk gasbind til fjernelse af fløde, inden du tørrer med en ren tør gasbind efter den endelige skylning. Kontroller området for fjernelse af pels for at bekræfte god synlighed og adgang til brystvorterne. Gentag om nødvendigt med hårfjerningscremepåføring.
- Placer musen i et separat rent, tørt genopretningsbur på en varmepude for at komme sig efter anæstesi. Overhold musen, indtil den er helt kommet sig efter anæstesi, og returner den til hjemmeburet.
- Giv mus en kop sucralose gelopløsning indeholdende carprofen (1 mg/kop) til fordoskning af det antiinflammatoriske middel efter genopretning. En kop kan give op til fem mus med carprofen i op til 2 dage. Kontroller koppen dagligt og udskift efter behov eller hver anden dag, hvis den ikke indtages fuldt ud.
3. Intraduktal injektion
BEMÆRK: Dette trin vil forekomme 2-3 dage efter præoperativ forberedelse.
- 333,3 mM tantaloxid (TaOx) stamopløsning fremstilles ud fra den indkøbte pulverformulering som beskrevet i16 under anvendelse af fosfatbufret saltvand (PBS). Brug blid varme, hvis pulveret ikke opløses helt i opløsningen.
- Lav en ablativ billeddannelsesløsning ved at blande tre dele TaOx med syv dele 100% EtOH til en endelig 70% EtOH 100mM TaOx-opløsning . Tilsæt 1% v/v blåt madfarvestof til den endelige opløsning for at hjælpe visualiseringen under injektionen. Forbered et volumen baseret på behovet for eksperimentet.
BEMÆRK: Kirtelpar 1 og 5 kan rumme op til 30 μL af opløsningen, mens alle andre par kan injiceres med op til 50 μL i 9 ugers alderen eller ældre FVB-mus. - Anæstesi musen med isofluran som i præoperativ forberedelse og flyt musen til næsekeglen, når den er fuldt beroliget. Påfør øjensmøremiddel, inden du placerer dyret på ryggen til injektionen. Fastgør musen under stereoskopet ved hjælp af tape, hvis det er nødvendigt.
- Forbered sprøjten med det ønskede volumen injektionsopløsning. 21-51 μL af injektionsopløsningen lægges i en 50 μL sprøjte med en 34 G nål fastgjort. Læg en ekstra 1 μL af opløsningen for at tage højde for den potentielle lækage af dette volumen, efter at nålen er fjernet fra brystvorten.
BEMÆRK: Mængderne ovenfor er til de typiske procedurer, der præsenteres her. Man kan injicere ethvert volumen, der ønskes med den forståelse, at de fleste kirtler vil blive overfyldt, hvis de går over 30 μL eller 50 μL i kirtelpar 1 og 5 eller 2-4, henholdsvis. Det er nyttigt at fylde nålen med yderligere volumen af injektionsopløsningen for at teste for opløsningens frie strømning umiddelbart før injektionen. Hvis du injicerer mere end en brystkirtel, skal du fylde flere sprøjter på forhånd for at spare tid. Forlad dog ikke opløsningen i sprøjten længe. - Forbered brystvorterne til injektionen ved at fjerne enhver død hud, der dækker brystvorteåbningen med fine spidse tang.
- Hold forsigtigt brystvorten med en pincet. Når nålens skråning er synlig, skal du indsætte nålen i brystvorteåbningen, indtil skråningen er fuldt dækket med vejledningshjælp fra fine spidse tang. Det kan være nødvendigt at trække brystvorten op på nålen i stedet for at skubbe nålen ind i brystvorten (tabel 1).
- Når nåleskråningen er helt omgivet af brystvorten og er i hovedkanalen, skal du begynde at injicere opløsningen med en jævn hastighed på ca. 40 μL/min. Undgå at injicere for hurtigt for at sikre, at duktaltræet ikke beskadiges. Hold nålen i brystvorten i 30 s, efter at volumenet er helt injiceret, før du fjerner nålen med hjælp fra tangen. Dette gøres for at undgå, at opløsningen spildes ud af brystvorten (figur 2).
- Vurder området for tegn på mislykket injektion. Et kuplet udseende kan indikere en fedtpudeinjektion eller traume i området.
- Fortsæt med at injicere de resterende brystkirtler.
- Mens dyret stadig er anæstesi, injiceres 200-250 μL 5% saccharoseopløsning (op til 10 ml / kg) intraperitonealt for at minimere de potentielle virkninger af alkoholforgiftning.
4. mikro-CT-billeddannelse
- Efter injektion af alle de ønskede kirtler skal du flytte dyret hurtigt til mikro-CT-systemet og fortsætte med at opretholde anæstesi ved hjælp af den indbyggede isofluranfordamper. Dyret kan tapes for at standardisere billeddannelsespositionen. For eksempel hjælper tape af hvert bagben i en forlænget position med at holde dyrets benben længere væk fra de nedre kirtler af interesse for det resulterende billede.
BEMÆRK: Dyrene kan afbildes ved hjælp af forskellige scanningsparametre til visualisering af duktaltræet, hvis der tages hensyn til at bestemme en passende acceptabel livstidsdosis af stråling for dyret, og de kumulative doser ikke overstiger dette niveau. Fluoroskopi stillbilleder og videoer kan genereres uden at udføre scanninger for yderligere at reducere strålingseksponeringen (figur 2). - Placer musen i det relevante synsfelt med fluoroskopi preview-funktionen.
- Udfør TaOx-billeddannelse af musens duktaltræ med god opløsning og mulighed for gentagne standard (2 min) anskaffelsesscanninger. Brug følgende scanningsparametre: 90 kVp/88 μA; synsfelt (FOV), 36 mm; antal skiver, 512; skivetykkelse, 72 μm; voxel opløsning, 72 μm3.
- Få længere (4 eller 14 min) scanninger i høj opløsning for at få endnu bedre opløsning hos dyr. Disse er acceptable som terminale procedurer før eutanasi. Disse er imidlertid ikke acceptable for dyr, der scannes i længderetningen ved hjælp af de samme parametre, da det vil forårsage strålingssygdom.
- Efter færdiggørelsen af billeddannelsesprotokollen skal du fjerne dyret fra anæstesi og overføre til et separat rent, tørt genopretningsbur på en varmepude. Overhold dyret, indtil det er fuldt genoprettet, og returner det derefter til hjemmeburet. Hold dyrene injiceret med ablativ opløsning på carprofen indtil 7 dage efter injektion.
- Lav hurtige gengivelser af scannede billeder i mikro-CT-softwaren (indbygget system) for bedre at værdsætte eventuelle kontrastlækager eller manglende påfyldning (figur 2) uden formel analyse.
- Udfør yderligere formel billedanalyse til offentliggørelse eller detaljeret analyse af scanninger, der muliggør segmentering af interesseområdet, hvis det ønskes (figur 3).
BEMÆRK: Den primære forskel mellem disse metoder vil være evnen til kun at tærskle duktaltræet (formel gengivelse) i forhold til at skulle tærskle hele billedet (hurtig gengivelse). Andre målinger og billeder kan genereres ved hjælp af softwarepakkerne for bedst at demonstrere succesen med duktal træfyldning.
5. Billedanalyse
- Udfør gengivelse af det injicerede duktaltræ ved hjælp af en specialiseret softwarepakke. For at gøre dette skal du segmentere brystfedtpuden med yderligere billedbehandling.
- For at segmentere fedtpuden (mørkere rum sammenlignet med bughulen, lårbensmusklerne og huden), inden for hvilken det duktale træ af interesse er indeholdt, skal du vælge indstillingen Spline Trace i den manuelle menu. Spor fedtpudekonturen ved hver tredje dataudsnit.
- Klik på indstillingen Forplantning af objekter i den halvautomatiske menu for at forbinde alle de sporede og ikke-sporede udsnit til et enkelt objekt.
- Vælg indstillingen Threshold Volume (Tærskelvolumen) i den halvautomatiske menu for at indtaste det ønskede HU-område (300-3.000 HU er et godt udgangspunkt), og klik derefter på knappen Threshold Rendition for at oprette en gengivelse, der kun viser kontrasten (TaOx) i kanaltræet og eliminerer blødt væv.
- Skift knappen Vis til Gengivelse som Primær for kun at få vist 3D-gengivelsen uden omgivende strukturer.
BEMÆRK: Yderligere softwarefunktioner gør det muligt at foretage målinger af 3D-gengivelsen (dvs. længde, volumen osv.).
Representative Results
Hunmus har fem par brystkirtler med et enkelt duktaltræ, der åbner ved brystvorteåbningen22. Ved spidserne af det udviklende duktale træ er de terminale endeknopper (TEB'er), proliferative strukturer, der styrer vækst og forgrening. Efter puberteten, når forlængelsesfasen er afsluttet, regresserer TEB'er og bliver funktionelt og anatomisk uadskillelige fra terminalkanaler eller alveolære knopper23. Terminale kanalformede enheder tjener en lignende funktion hos mennesker som TEB'er gør hos mus og er de steder, hvorfra brystkræft overvejende opstår24,25. Vi kan injicere op til 50 μL 70% EtOH-opløsning for at fylde hele duktaltræet af thorax- og abdominale brystkirtler i 9 uger gamle FVB / N, NSG og andre musestammer (figur 1, figur 2, figur 3, se referencer3,16). I et typisk eksperiment kan vi injicere op til otte brystkirtler med en ablativ opløsning på 70% EtOH og 100 mM TaOx i to på hinanden følgende ID-procedurer adskilt af 7 dage for at muliggøre dyrets genopretning (figur 2). Dyr afbildes ved mikro-CT umiddelbart efter den sidste ID-injektion for at vurdere en vellykket levering af opløsningen til hele kanaltræet (figur 2). Efter vores erfaring er brystvorterne i lyskekirtlerne egnede til injektion hos ca. 60% af dyrene og brystvorterne i livmoderhalskirtlerne hos ca. 40%. Når det er egnet, kan vi injicere op til 30 μL 70% EtOH-opløsning for at fylde hele duktaltræet af livmoderhals- og lyskebrystkirtler (figur 2). FVB- og NSG-stammer præsenterer generelt mere egnede brystvorter til injektion end C57BL / 6J eller blandede genetiske baggrundsstammer. Hele mount dual staining protocol eller 3D confocal mikroskopi er gode ortogonale metoder til at bekræfte, i hvilket omfang duktaltræet blev fyldt (figur 3). Disse vævskorrelative analyser er kompatible med og kan udføres efter in vivo-billeddannelse. Den åbenlyse begrænsning af disse ortogonale metoder er, at de kræver dyreafslutning til vævsindsamling og analyse; Men i en optimeringsfase af en ny ablativ formulering giver de uafhængig validering.
Figur 1: Arbejdsgang af intraduktal procedure og billedanalyse. De vigtigste trin i ID-proceduren fremhæves. Se videoen for flere detaljer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vellykket kanylering og levering af ablativ opløsning til flere brystkirtler. A) Repræsentativ brystvortevariation i FVB- og NSG-musestammer. Lange brystvorter er lettere at kanyle end korte brystvorter, mens for korte eller vestigiale brystvorter ikke kan kanyles. Når den er kanylet, påvirker brystvortens størrelse ikke en vellykket intraduktal levering. (B) Grov anatomisk analyse af blåt farvestof i en ablativ opløsning giver ex vivo bevis for duktal træfyldning og leveringssucces. (C,D) Fluoroskopi i realtid og 3D-mikro-CT-gengivelse efter billedoptagelse giver in vivo bevis for leveringssucces. (D) Vellykket injektion af både abdominale og inguinale kirtler og tre ud af fire brystkirtler (fedtpudeinjektion i kirtel nr. 2). Skalabjælker svarer til 1 mm i billeder med forskellig forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: In vivo og ex vivo demonstration af duktal træfyldning. 70% EtOH/100 mM TaOx nanopartikler/Evans Blue-opløsning blev intraduktalt injiceret i musens abdominale brystkirtel og straks afbildet af micro-CT og behandlet til dobbelt helmonteringsfarvning. Duktaltræ blev rekonstrueret ved hjælp af en softwarepakke til billedanalyse. Opløsningen fylder helt det karmin alunfarvede duktaltræ. En separat kirtel blev immunholdt for E-Cadherin (Cdh1), ryddet ved hjælp af benzylalkohol:Benzylbenzoat og afbildet ved konfokal mikroskopi som beskrevet26. Duktaltræet blev rekonstrueret ved hjælp af billedanalysesoftware. Pseudo-farvegengivelse af konfokalt billede (dvs. sort baggrund til hvidt, grønt markørsignal til magenta) blev opnået med billedinverteringsfunktionen i billedredigeringssoftwaren. Skalabjælker svarer til 1 mm i billeder med forskellig forstørrelse. Dette tal er ændret fra reference nr. 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Spørgsmål | Udseende | Opløsning | |||
| Kort brystvorte (fig. 2) | Brystvorten har lav profil – svær at få fat i | Det er nogle gange lettere at holde huden nær brystvorten og målrette midten af brystvorten med nålen. Nålen vil sandsynligvis dykke under huden. At trække langsomt op kan afsløre, at brystvorten er lidt over spidsen af nålen og give plads til at gribe og trække den resten af vejen på nålen. Vær meget forsigtig, når du dykker under huden om nålens vinkel. Det er let utilsigtet at få en fedtpudeinjektion ved at stikke i den forkerte vinkel. | |||
| Fed brystvorte | Meget større end andre brystvorter med lidt skrællelig død hud – let synlig uden omfang | Meget let at få en fedtpudeinjektion på disse brystvorter. Vær meget forsigtig med nålens vinkel, når du indsætter i brystvorten. | |||
| Injektion af fedtpude (fig. 2) | Hævet omkring brystvorten og muligvis i selve brystvorten – nemmest at se, om der tilsættes farve til injektionsopløsningen | Hvis brystvorten hæver med de første par ul injiceret, skal du fjerne nålen og forsøge at indsætte igen med mere omhu taget af vinklen. Begynd injektionen igen og pas på yderligere hævelse. Hvis hævelsen fortsætter, skal du opgive forsøget. Det er meget sjældent at med succes injicere en brystvorte, der er startet som en fedtpudeinjektion. | |||
| Sår/skorpe | Åbent sår eller skorpe nær injektionsstedet for EtOH-opløsning | Påfør tredobbelt antibiotisk salve til at åbne sår, men lad scabbed sår være i fred. Anvendelse af salve på skorper kan øge sandsynligheden for, at dyret vil genere skuret og fjerne det. Kontroller hver 1-2 dag, indtil den er helet afhængigt af sårets sværhedsgrad. Carprofen skal gives, indtil den er helet, selvom den ligger uden for det normale vindue. | |||
Tabel 1: Fejlfinding og nyttige tip.
Discussion
Profylaktisk mastektomi er i øjeblikket den mest effektive intervention for brystkræft, men det har nogle alvorlige negative virkninger. Lokal ablation af brystepitelceller med en EtOH-baseret opløsning er en lovende alternativ behandling, som vi demonstrerede i et proof-of-concept-studie om den aggressive FVB-Tg-C3(1)-TAg-musemodel for brystkræft3. ID-injektion af denne ablative opløsning muliggør målretning af brystepitelcellerne, hvorfra brystkræft opstår med begrænset sikkerhedsskade. Tilsætning af et røntgenkontrastmiddel til den ablative opløsning giver mulighed for øget forståelse af opløsningens effektivitet ved forebyggelse, da vi kan se, om hvert duktaltræ med succes er fyldt efter injektion (figur 2B). Visning af injicerede kirtler ved fluoroskopi straks efter injektion afspejler, hvad der sandsynligvis vil blive gjort i klinikken for at bekræfte en vellykket påfyldning af duktaltræet. Visuel bekræftelse af løsningslevering vil bedst informere om, hvorvidt alle dele af træet er nået i realtid. Dette kan gøre det muligt at udføre yderligere injektion for at fuldføre påfyldningen på det tidspunkt eller i en fremtidig session. Det er af stor betydning, at ablativ opløsning når alle dele af duktaltræet for at sikre, at alle epitelceller kan tilgås til aflivning (figur 3). Efterladelse af levende epitelceller i træet ville give mulighed for, at brystkræft stadig kunne opstå. Brug af kontrast i ID-injektioner til billedsucces af injektionen kan også være nyttig til andre formuleringer. Tabel 1 indeholder fejlfinding og nyttige tip. Andre undersøgelser har beskrevet ID-leveringsprotokoller for virale partikler (f.eks. AdCre, CRISPR-guide-RNA'er), hormoner, cytotoksiske forbindelser, siRNA'er og/ eller målretningsmidler i mus3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ,38, rotter24,32,39,40,41 og kaniner42,43,44,45,46,47. Uafhængige kliniske undersøgelser rapporterede vellykket kanylering af op til otte kanaler pr. Bryst til lokal levering af kemoterapi40,48,49. Visualisering af fuld påfyldning, når du leverer andre løsninger, der sigter mod forebyggelse eller rettet mod behandling, ville være umagen værd af lignende grunde. Viden om, at løsningen har nået alle grene og terminale ender af træet, vil være informativ i vurderingen af vellykket forebyggelse eller behandling.
Vi er ikke bekendt med andre intraduktale billeddannelsesmetoder i mus33,34 eller andre dyremodeller47, der giver den høje opløsning af TaOx nanopartikler. Bemærk, at TaOx i murine duktaltræet overgår FDA-godkendte kontrastmidler til diagnostisk kanalografi3,16. Da vi fortsætter med at vurdere ID-ablativeproceduren for dens evne til at forhindre brystkræft, vil vi være i stand til at bestemme mere præcist, hvorfra kirtler kræft opstår ved hjælp af tilføjede data givet gennem billeddannelse efter ID-levering. For eksempel kunne man afgøre, om en kirtel, der kun var delvist fyldt, er mere tilbøjelig end en ikke-injiceret kirtel til at resultere i tumordannelse, hvilket adresserer sikkerhedsprofilen og bekymringen for mislykkede injektioner på en højrisikokvinde. Denne teknik har nogle begrænsninger. Dette er en relativt udfordrende museteknik, der kræver fingerfærdighed og dygtighed hos operatøren til at manipulere og med succes kanyle hver kanal. Hver enkelt injektion er en uafhængig begivenhed, så mislykket injektion på en eller flere kirtler kan kompromittere resultatfortolkningen. I betragtning af størrelsen af murine brystkirtlen og skrøbelighed i brystvorten er fluoroskopi eller lignende billedvejledningsteknik ikke tilgængelig for at informere i realtid, hvornår infusionen skal stoppes. Denne realtidsbilledvejledning vil være et krav til klinisk implementering af lokal levering af en ablativ løsning.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af National Cancer Institute R21 CA226579 og R01 CA258314 tilskud til LFS og af National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 tilskud til EMS. Vi vil gerne takke MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core facilitet for brug af deres billeddannelsessystemer og tekniske ekspertise. Vi vil gerne takke Dr. Danielle Ferguson for at gennemgå indholdet af videoen og tallene for overholdelse af dyrevelfærdsretningslinjerne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
| Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
| Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
| Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
| Imaris | Bitplane | n/a | For confocal image processing |
| MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
| Model 1705 RN Syringe, 50μL | Hamilton | 7655-01 | For intraductal injection |
| Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
| Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
| Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) | Hamilton | 207434 | For intraductal injection |
| Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
| Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
| Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
| Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
| Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
| Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
| Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |
References
- Britt, K. L., Cuzick, J., Phillips, K. A. Key steps for effective breast cancer prevention. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 417-436 (2020).
- Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
- Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
- Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
- Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal Gastroenterol. 18 (10), 1003-1008 (2012).
- Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal Gastroenterol. 19 (22), 3397-3403 (2013).
- Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
- Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the Breast Treated with Percutaneous Ethanol Injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
- Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutics Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
- Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
- Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
- Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
- Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
- Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
- Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
- Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50692 (2013).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
- Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Transactions of Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
- Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
- Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
- Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Res Treat. 73 (1), 75-83 (2002).
- Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
- Arora, R., et al. Insights from imaging the implanting embryo and the uterine environment in three dimensions. Development. 143 (24), 4749-4754 (2016).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Science Translational Medicine. 6 (217), (2014).
- de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
- Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast- A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 903-913 (2019).
- Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
- Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
- Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
- Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
- Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51171 (2014).
- Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59502 (2019).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4030 (2012).
- Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translation Medicine. 3 (106), (2011).
- Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
- Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. The Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. The Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
- Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. Biochemistry Journal. 115 (5), 58 (1969).
- Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
- Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
- Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal Visualized Experiments: JoVE. (121), e55209 (2017).
- Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Prevention Research (Philadelphia). 6 (1), 51-58 (2013).
