Summary
Описан способ внутрипротокового введения реагентов для абляционного раствора на основе этанола в дерево протоков молочной железы мыши для визуализации in vivo и профилактики рака молочной железы. Инъекция непосредственно в отверстие соска позволяет нацеливаться на эпителиальные клетки молочной железы с минимальным повреждением коллатеральной ткани.
Abstract
Рак молочной железы является наиболее распространенным раком и второй по значимости причиной смерти, связанной с раком, для женщин в США. Для женщин с высоким риском профилактическая мастэктомия является наиболее эффективной стратегией первичной профилактики. Профилактическая мастэктомия – это агрессивная хирургическая процедура, которая полностью удаляет эпителиальные клетки молочной железы, из которых возникает рак молочной железы вместе с окружающими тканями. Мы стремимся разработать минимально инвазивную внутрипродукционную процедуру в качестве альтернативы профилактической мастэктомии для локального удаления эпителиальных клеток молочной железы до того, как они могут стать злокачественными. Мы и другие разработали процедуру внутрипротоковой доставки для достижения и лечения этих эпителиальных клеток в моделях рака молочной железы грызунов. В то время как грудная железа мыши с одним неанастомозированным протоковым деревом в соске имеет гораздо менее сложную и извилистую архитектуру, чем человеческая грудь, химически индуцированные и генетически модифицированные мышиные модели рака молочной железы ценны для проведения экспериментальных исследований новых профилактических стратегий. Здесь мы описываем процедуру внутрипротоковой доставки абляционного раствора на основе этанола, содержащего контрастное вещество на основе микро-КТ / рентгеновского тантала, в дереве протоков молочной железы мыши для терапевтической цели первичной профилактики рака молочной железы. Внутрипротоковая доставка водных реагентов (например, цитотоксических соединений, siRNAs, AdCre) была ранее описана на мышиных моделях. Таким образом, мы фокусируем наше описание протокола на методологических модификациях и уникальных экспериментальных соображениях для оптимизации доставки этанола, для минимизации локальных и системных побочных эффектов введения этанола и для визуализации in vivo заполнения протокового дерева с помощью микро-КТ / рентгеноскопической визуализации. Визуализация протокового дерева сразу после инъекции контрастсодержащего раствора позволяет подтвердить полное заполнение или неудачные результаты, такие как недозаполнение или перелив. Эта процедура может быть применена для доставки и визуализации других абляционных соединений, направленных либо на предотвращение образования опухолей, либо на местное лечение опухолей на ранней стадии, доступных через проточное дерево.
Introduction
Рак молочной железы является распространенным и потенциально смертельным заболеванием с несколькими вариантами, доступными для профилактики1. Наиболее эффективным вмешательством является профилактическая мастэктомия; однако только лица с высоким риском предпочитают проходить эту процедуру, поскольку это операция с серьезными последствиями, изменяющими жизнь2. Процедура полностью удаляет эпителиальные клетки молочной железы, из которых возникает рак молочной железы, вместе с окружающими тканями. Это может привести к физическому, психологическому и социальному стрессу для человека и часто отговаривает людей от продолжения этой хирургической процедуры в качестве первой линии первичного вмешательства.
Мы продемонстрировали, что доставка абляционного раствора, содержащего 70% этанола (EtOH), непосредственно в протоковое дерево эффективна для уничтожения эпителиальных клеток молочной железы с ограниченным повреждением коллатеральной ткани и для предотвращения опухолей молочной железы в мышиных моделях3. EtOH уже давно используется клинически в качестве абляционного или склерозирующего агента для местного лечения. Чрескожная инъекция EtOH применяется в качестве абляционного средства при неоперабельных опухолях печени, новообразованиях почек и надпочечников, кистозных опухолях поджелудочной железы4,5,6; для нейролиза целиакийного сплетения для уменьшения боли7; и для лечения псевдоаневризм молочной железы8. Внутрисосудистая инъекция EtOH используется в качестве склерозирующего средства для устранения отеков и деформаций от артериовенозных мальформаций (АВМ), а также для косметического лечения сосудистых звездочек и варикозного расширения вен9,10,11,12,13. Как и профилактическая мастэктомия, успех профилактики с местной доставкой абляционного раствора зависит от способности полностью удалить все эпителиальные клетки молочной железы, из которых потенциально может возникнуть рак. Это требует подтверждения того, что абляционное вещество успешно заполнило проточное дерево, тем самым контактируя со всеми эпителиальными клетками молочной железы напрямую. Легко доступны клинические средства для введения веществ в молочные железы и их визуализации с помощью рентгеноскопии или дуктографии с визуальным контролем14,15; таким образом, можно будет как доставить, так и подтвердить успешную доставку, когда эта процедура может потребовать оценки в клинических испытаниях.
Демонстрация осуществимости этого подхода, основанного на изображениях, на лабораторных животных является ключевым шагом в установлении эффективности и трансляционной осуществимости интратроковой (ID) абляции в качестве профилактической меры при раке молочной железы. В нашей лаборатории мы разработали метод успешного введения всем молочным железам мышам абляционного раствора, содержащего контрастное вещество, в течение курса еженедельных инъекций, чтобы гарантировать, что животное не поддастся передозировке EtOH (Рисунок 1, Рисунок 2, ссылка Nos.3,16). Эта процедура помещает иглу 34 Г внутрь отверстия соска мыши, обезболенной изофлураном, для инъекции исследуемого раствора. Некоторые ключевые улучшения процедуры включают использование газонепроницаемых шприцев для жидкости и газов, инъекцию больших объемов на проточные деревья17 и расширенное противовоспалительное лечение. Доклиническое лечение 5 мг/кг карпрофена, НПВП, от 2 до 7 д после процедуры ID соответствует клинической склерозирующей терапии АВМ. Как правило, после системной анестезии пациенты получают противовоспалительные препараты, такие как НПВП, в течение 2 дней после процедуры, которые могут быть продлены для смягчения любого местного воспаления или боли12. Алкогольная интоксикация значительно смягчается внутрибрюшинной инъекцией 5% раствора сахарозы у мышей. При введении этого раствора сахарозы мышам можно безопасно вводить до 160 мкл 70% EtOH (до четырех проточных деревьев; около 0,4 г/дл содержания EtOH в крови); животные полностью выздоравливали в течение 4 ч после инъекций ИД. Для инъекции более четырех желез мышам и / или более высоких концентраций EtOH мы выполняем последовательные сеансы, чтобы обеспечить достаточное время восстановления. Алкогольная интоксикация у женщин будет меньше беспокоить из-за меньшей доли алкоголя в массе тела. Учитывая количество проточных деревьев в груди человека 14,15, около 16, и предполагаемый объем для заполнения каждого древовидного протока18,19, будет введено до 32 мл 70% EtOH. Это количество будет намного ниже, чем 50 мл 95% EtOH, вводимые в других клинических процедурах4,9. Внутривенное введение раствора тиамина и глюкозы может быть использовано для дальнейшей минимизации последствий интоксикации EtOH, особенно в случаях, когда может потребоваться инъекция большего общего объема EtOH и / или для женщин с более низкой толерантностью к употреблению алкоголя (например, аллельные варианты в алкоголе или альдегиддегидрогеназах).
Визуализация с помощью микро-КТ/рентгеноскопии позволяет подтвердить успешное заполнение протоков каждой железы (Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3). Это может быть записано для будущего анализа или оценено в данный момент с помощью рентгеноскопической визуализации в режиме реального времени, как это было бы сделано в клиническом применении, чтобы ограничить общую радиационную нагрузку, налагаемую на животное. Чтобы еще больше улучшить специфические характеристики этого абляционного решения для доставки in vivo с визуальным контролем в режиме реального времени, мы ранее сравнили одобренный FDA йодсодержащий контраст с наночастицами, содержащими оксид тантала (TaOx), синтезированными лабораторией Shapiro 3,16. TaOx показал превосходные характеристики в качестве контрастного вещества микро-КТ для визуализации первоначального заполнения протокового дерева (рисунок 2, рисунок 3). TaOx может быть использован в качестве эталонного контраста для выполнения более систематической и продольной оценки других контрастных агентов пула крови на основе наночастиц (например, йода, висмута или золота, содержащих) и совместимости TaOx с различными концентрациями этилцеллюлозы в качестве гелеобразующего агента20,21.
Protocol
Все эксперименты, описанные здесь, были проведены в соответствии с протоколами, одобренными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Мичиганском государственном университете.
1. Расширенное противовоспалительное лечение
- Убедитесь, что мышам, получающим инъекционные растворы, содержащие EtOH или другие потенциальные раздражители, предоставляется противовоспалительное лечение от 2 дней до инъекции до 7 дней после инъекции. Предпочтительным способом дозирования является пероральная доставка через чашку сукралозного геля, содержащую карпрофен в соответствующей концентрации.
- Готовят карпрофен с необходимой концентрацией. Для этого эксперимента готовили рабочий раствор 2 мг/мл (стандартный раствор составляет 50 мг/мл) путем разбавления в стерильном PBS для инъекции 0,5 мл для достижения конечной дозы 1 мг на чашку. Добавьте 1% v/v стерильного синего пищевого красителя (BFD) вместо доли PBS от общего объема, необходимого для разведения, чтобы лучше визуализировать полное смешивание препарата с сукралозным гелем.
- Подготовьте чашку для добавления карпрофена в соответствии с рекомендацией производителя. Если не рекомендуется иное, поместите чашку на водяную баню при температуре 60 °C в течение 15 минут. Снимите чашки и высушите их, чтобы свести к минимуму возможность загрязнения.
- Используйте 70% EtOH или салфетку EtOH, чтобы очистить поверхность крышки чашки и дать высохнуть. Используйте шприц для введения необходимого количества раствора карпрофена через крышку. Для этого эксперимента вводится 500 мкл. Накройте место инъекции наклейкой и энергично встряхните в течение 15 с.
- Вращайте чашку в течение 15 с, а затем храните для последующего использования после визуальной проверки полного перемешивания. Проверьте чашки на однородное смешивание, ища темно-синие комочки. Дайте чашкам выйти на комнатную температуру перед перемещением в холодильник для хранения до одного месяца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти чашки также можно хранить при комнатной температуре после дозирования, если это необходимо, но обратите внимание на руководство по эффективности препарата от производителя. Датировка наклейки помогает отслеживать дату инъекции, не рискуя ручкой или острым маркером проколоть крышку.
- Когда все будет готово к использованию, протрите внешнюю часть чашки 70% EtOH. Снимите крышку и поместите чашку в клетку вместе с мышами. Заменяйте чашки через день или когда они пусты. Одной чашки должно хватить до пяти мышей на 1-2 дня.
2. Предоперационная подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг произойдет за 2-3 дня до инъекции.
- Обезболить мышь с помощью испарителя изофлурана (2%-3% изофлурана, 1,5 л/мин кислорода) и нанести смазку для глаз. Поддерживайте анестезию на уровне 1%-3% изофлурана по мере необходимости на протяжении всей процедуры с помощью носового конуса, тщательно контролируя частоту дыхания животного.
- Нанесите смазку для глаз мыши на глаза мыши, находясь на носовом конусе, а затем поместите мышь на спину. Используйте аппликатор с хлопковым наконечником, чтобы нанести безрецептурный крем для депиляции на область соска (область молочной железы, которая будет вводиться). Втирайте крем в область в течение 10-30 с аппликатором, чтобы помочь быстро разрыхлить мех.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте крем на животном дольше, чем это необходимо, и удалите полностью, чтобы избежать ожога кожи. - После 10-30 с применения используйте теплую воду на марле, чтобы полностью удалить крем и разрыхлить шерсть животного. Выполните не менее двух-четырех полосканий области свежей марлей для удаления крема перед сушкой чистой сухой марлей после окончательного ополаскивания. Проверьте область удаления меха, чтобы подтвердить хорошую видимость и доступ к соскам. При необходимости повторите нанесение крема для депиляции.
- Поместите мышь в отдельную чистую, сухую клетку восстановления на грелке, чтобы восстановиться после анестезии. Наблюдайте за мышью до тех пор, пока она полностью не оправится от анестезии и верните ее в домашнюю клетку.
- Обеспечьте мышей одной чашкой раствора сукралозного геля, содержащего карпрофен (1 мг/чашка) для предварительного дозирования противовоспалительного средства после выздоровления. Одна чашка может обеспечить до пяти мышей карпрофеном на срок до 2 дней. Проверяйте чашку ежедневно и заменяйте по мере необходимости или через день, если она не полностью потребляется.
3. Внутрипротоковые инъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап будет происходить через 2-3 дня после предоперационной подготовки.
- Приготовьте 333,3 мМ раствора оксида тантала (TaOx) из закупленного порошкового состава, как описано в статье 16 , используя фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS). Используйте мягкое тепло, если порошок не полностью растворяется в растворе.
- Сделайте абляционное решение для визуализации, смешивая три части TaOx с семью частями 100% EtOH для окончательного 70% раствора EtOH 100mM TaOx . Добавьте 1% v/v синего пищевого красителя в конечный раствор для вспомогательной визуализации во время инъекции. Подготовьте том в зависимости от потребности в эксперименте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пары желез 1 и 5 могут содержать до 30 мкл раствора, в то время как все другие пары могут быть введены до 50 мкл в возрасте 9 недель или старше мышей FVB. - Обезболивают мышь изофлураном, как при предоперационной подготовке, и перемещают мышь к носовому конусу после полного обезболивания. Нанесите смазку для глаз перед тем, как положить животное на спину для инъекции. При необходимости закрепите мышь под стереоскопом с помощью ленты.
- Подготовьте шприц с нужным объемом раствора для инъекций. Загрузите 21-51 мкл раствора для инъекций в шприц объемом 50 мкл с прикрепленной иглой 34 Г. Загрузите дополнительный 1 мкл раствора, чтобы учесть потенциальную утечку этого объема после удаления иглы из соска.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные выше тома относятся к типичным процедурам, представленным здесь. Можно вводить любой желаемый объем с пониманием того, что большинство желез будут переполнены, если превысить 30 мкл или 50 мкл в парах желез 1 и 5 или 2-4 соответственно. Полезно заполнить иглу дополнительным объемом инъекционного раствора, чтобы проверить свободный поток раствора непосредственно перед инъекцией. Если вводите более одной молочной железы, предварительно заполните несколько шприцев, чтобы сэкономить время. Однако не оставляйте раствор в шприце надолго. - Подготовьте соски к инъекции, удалив любую мертвую кожу, которая покрывает отверстие соска тонкими заостренными щипцами.
- Осторожно подержите сосок пинцетом. Когда виден скос иглы, вставьте иглу в отверстие соска до тех пор, пока скос не будет полностью покрыт с помощью щипцов с тонкими наконечниками. Возможно, потребуется подтянуть сосок к игле, а не проталкивать иглу в сосок (таблица 1).
- Как только скос иглы будет полностью окружен соском и окажется в главном протоке, начните вводить раствор с постоянной скоростью примерно 40 мкл/мин. Избегайте слишком быстрого введения, чтобы убедиться, что проточное дерево не повреждено. Держите иглу в соске в течение 30 с после того, как объем будет полностью введен, прежде чем снимать иглу с помощью щипцов. Это делается для того, чтобы раствор не выплеснулся из соска (рисунок 2).
- Оцените область на наличие каких-либо признаков неудачной инъекции. Появление купола может указывать на инъекцию жировой подушки или травму области.
- Приступают к инъекции в оставшиеся молочные железы.
- Пока животное все еще находится под наркозом, вводят 200-250 мкл 5% раствора сахарозы (до 10 мл/кг) внутрибрюшинно, чтобы свести к минимуму потенциальные последствия алкогольной интоксикации.
4. микро-КТ визуализация
- После инъекции всех желаемых желез быстро переместите животное в систему микро-КТ и продолжайте поддерживать анестезию с помощью встроенного испарителя изофлурана. Животное может быть заклеено для стандартизации положения изображения. Например, заклеивание каждой задней ноги в вытянутом положении помогает удерживать кости ног животного дальше от нижних желез, представляющих интерес на результирующем изображении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные могут быть сфотографированы с использованием различных параметров сканирования для визуализации протокового дерева, если приняты меры для определения соответствующей приемлемой дозы радиации в течение жизни для животного, и кумулятивные дозы не превышают этот уровень. Рентгеноскопические фотографии и видео могут быть сгенерированы без выполнения сканирования для дальнейшего снижения радиационного облучения (рисунок 2). - Поместите мышь в соответствующее поле зрения с помощью функции предварительного просмотра рентгеноскопии.
- Выполняйте TaOx-визуализацию дерева протоков мыши с хорошим разрешением и возможностью повторного стандартного (2 мин) сканирования. Используйте следующие параметры сканирования: 90 kVp/88 μA; поле зрения (FOV), 36 мм; количество срезов, 512; толщина среза, 72 мкм; воксельное разрешение, 72 мкм3.
- Получайте более длинные (4 или 14 минут) сканы с высоким разрешением для еще лучшего разрешения у животных. Они приемлемы в качестве терминальных процедур перед эвтаназией. Они, однако, неприемлемы для животных, которые сканируются продольно с использованием тех же параметров, поскольку это вызовет лучевую болезнь.
- После завершения протокола визуализации удалите животное из наркоза и переведите в отдельную чистую, сухую клетку восстановления на грелке. Наблюдайте за животным до полного выздоровления, а затем возвращаем его в домашнюю клетку. Держите животных, которым вводили абляционный раствор карпрофена, до 7 дней после инъекции.
- Делайте быстрые представления любых отсканированных изображений в программном обеспечении micro-CT (встроенной системе), чтобы лучше оценить любые утечки контраста или отсутствие заполнения (рисунок 2) без формального анализа.
- Выполните дальнейший формальный анализ изображений для публикации или подробный анализ сканов, которые при желании позволяют сегментировать интересующую область (рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Основное различие между этими методами будет заключаться в возможности порогового значения только для дерева протоков (формальное представление) по сравнению с необходимостью порога для всего изображения (быстрое представление). Другие измерения и изображения могут быть сгенерированы с использованием пакетов программного обеспечения, чтобы наилучшим образом продемонстрировать успех заполнения канального дерева.
5. Анализ изображений
- Выполните рендеринг инжектированного протокового дерева с помощью специализированного программного пакета. Для этого сегментируйте жировую прокладку молочной железы с дальнейшей обработкой изображения.
- Чтобы сегментировать жировую подушку (более темный отсек по сравнению с брюшинной полостью, бедренными мышцами и кожей), в которой содержится интересующее протоковое дерево, выберите опцию «Трассировка сплайна » в меню руководства. Трассировка контура жировой прокладки на каждом третьем фрагменте данных.
- Нажмите на опцию «Распространить объекты» в полуавтоматическом меню, чтобы соединить все отслеживаемые и неотслеживаемые фрагменты в один объект.
- Выберите опцию «Пороговый объем» в полуавтоматическом меню, чтобы ввести желаемый диапазон HU (300-3000 HU является хорошей отправной точкой), а затем нажмите кнопку Threshold Rendition, чтобы создать представление, которое отображает только контрастность (TaOx) в дереве протоков и устраняет мягкие ткани.
- Переключите кнопку Вид на Представление как основное , чтобы просмотреть только 3D-представление без окружающих структур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные функции программного обеспечения позволяют проводить измерения 3D-представления (т.е. длины, объема и т.д.).
Representative Results
Самки мышей имеют пять пар молочных желез с одним проточным деревом, которое открывается на отверстии соска22. На кончиках развивающегося протокового дерева находятся концевые концевые почки (ТЕБ), пролиферативные структуры, которые направляют рост и ветвление. После полового созревания, когда фаза удлинения завершена, TEBs регрессируют и становятся функционально и анатомически неотличимыми от концевых протоков или альвеолярных почек23. Концевые проточные дольковые единицы выполняют ту же функцию у людей, что и TEB у мышей, и являются участками, из которых преимущественно возникает рак молочной железы24,25. Мы можем ввести до 50 мкл 70% раствора EtOH для заполнения всего протокового дерева грудной и брюшной молочных желез 9-недельного FVB/N, NSG и других штаммов мышей (Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, см. ссылки3,16). В типичном эксперименте мы можем ввести до восьми молочных желез абляционным раствором 70% EtOH и 100 мМ TaOx в двух последовательных процедурах идентификации, разделенных 7 днями, чтобы обеспечить восстановление животных (рисунок 2). Животные визуализируются с помощью микро-КТ сразу после последней инъекции ID для оценки успешной доставки раствора ко всему протоковому дереву (рисунок 2). По нашему опыту, соски паховых желез пригодны для инъекций примерно у 60% животных, а соски шейных желез примерно у 40%. При необходимости мы можем ввести до 30 мкл 70% раствора EtOH для заполнения всего протокового дерева шейных и паховых молочных желез (рисунок 2). Штаммы FVB и NSG обычно представляют собой более подходящие соски для инъекций, чем C57BL/6J или смешанные штаммы генетического фона. Протокол двойного окрашивания всего крепления или 3D-конфокальная микроскопия являются хорошими ортогональными методами для подтверждения того, в какой степени проточное дерево было заполнено (рисунок 3). Эти тканекоррелятные анализы совместимы и могут быть выполнены после визуализации in vivo. Очевидное ограничение этих ортогональных методов заключается в том, что они требуют терминации животных для сбора и анализа тканей; однако на этапе оптимизации новой абляционной формулировки они обеспечивают независимую валидацию.
Рисунок 1: Рабочий процесс внутрипродукционной процедуры и анализа изображений. Выделены ключевые этапы процедуры идентификации. Пожалуйста, посмотрите видео для получения более подробной информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Успешная канюляция и доставка абляционного раствора в несколько молочных желез. (A) Репрезентативная пестрота сосков у мышечных штаммов FVB и NSG. Длинные соски легче канюлировать, чем короткие, тогда как слишком короткие или рудиментарные соски не могут быть канюлятированы. После канюляции размер соска не влияет на успешные внутрипротоковые роды. (B) Валовой анатомический анализ синего красителя в абляционном растворе дает ex vivo доказательства успешности заполнения и доставки протокового дерева. (С,Г) Рентгеноскопия в режиме реального времени и 3D-микро-КТ-визуализация после получения изображения обеспечивают in vivo доказательства успеха доставки. (D) Успешная инъекция как брюшных, так и паховых желез, а также трех из четырех грудных желез (инъекция жировой прокладки в железу No 2). Шкалы соответствуют 1 мм на изображениях при разном увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Демонстрация in vivo и ex vivo заполнения протокового дерева. 70% наночастицы EtOH/100 мМ TaOx /Evans Blue вводили внутрипродукционно в брюшную молочную железу мыши и сразу же визуализировали с помощью микро-КТ и обрабатывали для двойного окрашивания всего крепления. Проточное дерево было реконструировано с использованием программного пакета для анализа изображений. Раствор полностью заполняет карминовое квасцеобразное проточное дерево. Отдельная железа была иммуноокрашена для E-cadherin (Cdh1), очищена с использованием бензилового спирта: бензилбензоата и визуализирована конфокальной микроскопией, как описано26. Проточное дерево было реконструировано с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Псевдоокрасочная визуализация конфокального изображения (т.е. черный фон на белый, зеленый маркер сигнала на пурпурный) была получена с помощью функции инвертирования изображения программного обеспечения для редактирования изображения. Шкалы соответствуют 1 мм на изображениях при разном увеличении. Эта цифра была изменена по сравнению со ссылкой No 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Выпуск | Внешность | Решение | |||
| Короткий сосок (рис. 2) | Сосок имеет низкий профиль - трудно схватить | Иногда легче удерживать кожу возле соска и нацеливать иглу на центр соска. Игла, скорее всего, будет погружаться под кожу. Медленное подтягивание может привести к тому, что сосок будет немного выше кончика иглы и даст место, чтобы схватить и потянуть его оставшуюся часть пути на иглу. Будьте очень осторожны при погружении под кожу относительно угла иглы. Легко непреднамеренно получить инъекцию жировой подушки, ударив под неправильным углом. | |||
| Толстый сосок | Намного больше, чем другие соски с небольшой отслаивающейся мертвой кожей – легко видимые без прицела | Очень легко получить инъекцию жировой прокладки на эти соски. Будьте очень осторожны с углом наклона иглы при введении в сосок. | |||
| Инъекция жировой прокладки (рис. 2) | Опухает вокруг соска и, возможно, в самом соске - легче всего увидеть, добавляется ли цвет в раствор для инъекций | Если сосок отекает с первыми несколькими инъекциями, удалите иглу и попытайтесь вставить снова с большей осторожностью угла. Начните инъекцию еще раз и следите за дальнейшим отеком. Если отек продолжается, откажитесь от попытки. Очень редко можно успешно ввести сосок, который начинался как инъекция жировой подушки. | |||
| Раны/ссадины | Открытая рана или ссадина вблизи места инъекции раствора EtOH | Нанесите тройную антибиотическую мазь на открытые раны, но оставьте в покое скошенные раны. Нанесение мази на струпья может увеличить вероятность того, что животное будет беспокоить струп и удалять его. Проверяйте каждые 1-2 дня до заживления в зависимости от тяжести раны. Карпрофен следует давать до тех пор, пока он не заживет, даже если он находится за пределами нормального окна. | |||
Таблица 1: Устранение неполадок и полезные советы.
Discussion
Профилактическая мастэктомия в настоящее время является наиболее эффективным вмешательством при раке молочной железы, но она имеет некоторые серьезные негативные последствия. Локальная абляция эпителиальных клеток молочной железы раствором на основе EtOH является многообещающей альтернативной терапией, как мы продемонстрировали в экспериментальном исследовании агрессивной мышиной модели рака молочной железы FVB-Tg-C3(1)-TAg. ИД-инъекция этого абляционного раствора позволяет нацеливаться на эпителиальные клетки молочной железы, из которых возникает рак молочной железы с ограниченным побочным повреждением. Добавление рентгеноконтрастного вещества к абляционному раствору позволяет лучше понять эффективность раствора при профилактике, так как мы можем видеть, успешно ли заполнено каждое проточное дерево после инъекции (рисунок 2B). Просмотр введенных желез с помощью рентгеноскопии сразу после инъекции отражает то, что, скорее всего, будет сделано в клинике для подтверждения успешного заполнения протокового дерева. Визуальное подтверждение доставки решения лучше всего сообщит, были ли достигнуты все части дерева в режиме реального времени. Это может позволить выполнить дальнейшую инъекцию для завершения заполнения во время или в будущем сеансе. Очень важно, чтобы абляционный раствор достигал всех частей протокового дерева, чтобы гарантировать, что все эпителиальные клетки могут быть доступны для уничтожения (рисунок 3). Оставление живых эпителиальных клеток внутри дерева позволит предположить, что рак молочной железы все еще может возникнуть. Использование контраста в инъекциях ID для получения изображения успеха инъекции также может быть полезно для других составов. В таблице 1 приведены сведения об устранении неполадок и полезные советы. В других исследованиях были описаны протоколы доставки идентификаторов для вирусных частиц (например, AdCre, CRISPR guide RNAs), гормонов, цитотоксических соединений, siRNAs и / или целевых агентов у мышей3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ,38, крысы24,32,39,40,41 и кролики42,43,44,45,46,47. Независимые клинические исследования сообщили об успешной канюляции до восьми протоков на грудь для местных родов химиотерапии40,48,49. Визуализация полного наполнения при доставке других решений, направленных на профилактику или ориентированных на лечение, была бы целесообразной по аналогичным причинам. Знание того, что решение достигло всех ветвей и конечных концов дерева, будет информативным при оценке успешной профилактики или лечения.
Нам не известно о каких-либо других методах внутрипротоковой визуализации у мышей33,34 или других животных моделей47, которые обеспечивают высокое разрешение наночастиц TaOx. Следует отметить, что TaOx в мышином протоковом дереве превосходит одобренные FDA контрастные агенты для диагностической дуктографии3,16. Поскольку мы продолжаем оценивать абляционную процедуру ID на предмет ее способности предотвращать рак молочной железы, мы сможем более точно определить, из каких желез возникает рак с помощью дополнительных данных, полученных с помощью визуализации после доставки ID. Например, можно определить, является ли железа, которая была заполнена только частично, более вероятной, чем неинъекционированная железа, чтобы привести к образованию опухоли, что решает профиль безопасности и проблему неудачных инъекций женщине с высоким риском. Этот метод имеет некоторые ограничения. Это относительно сложная техника мыши, которая требует ловкости и мастерства оператора для манипулирования и успешного канюляции каждого протока. Каждая отдельная инъекция является самостоятельным событием, поэтому неудачная инъекция в одну или несколько желез может поставить под угрозу интерпретацию результата. Учитывая размер мышевой молочной железы и хрупкость соска, рентгеноскопия или аналогичная техника визуализации недоступны для информирования в режиме реального времени, когда прекратить инфузию. Это руководство по изображениям в режиме реального времени будет обязательным требованием для клинической реализации локальной доставки абляционного раствора.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана, в частности, грантами Национального института рака R21 CA226579 и R01 CA258314 для LFS и грантом Национального института биомедицинской визуализации и биоинженерии R01 EB029418 для EMS. Мы хотели бы поблагодарить Институт количественного (IQ) МГУ по науке о здоровье и инженерии Imaging Core за использование их систем визуализации и технических знаний. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Даниэль Фергюсон за обзор содержания видео и цифр на предмет соблюдения руководящих принципов защиты животных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
| Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
| Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
| Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
| Imaris | Bitplane | n/a | For confocal image processing |
| MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
| Model 1705 RN Syringe, 50μL | Hamilton | 7655-01 | For intraductal injection |
| Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
| Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
| Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) | Hamilton | 207434 | For intraductal injection |
| Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
| Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
| Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
| Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
| Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
| Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
| Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |
References
- Britt, K. L., Cuzick, J., Phillips, K. A. Key steps for effective breast cancer prevention. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 417-436 (2020).
- Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
- Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
- Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
- Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal Gastroenterol. 18 (10), 1003-1008 (2012).
- Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal Gastroenterol. 19 (22), 3397-3403 (2013).
- Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
- Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the Breast Treated with Percutaneous Ethanol Injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
- Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutics Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
- Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
- Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
- Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
- Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
- Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
- Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
- Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50692 (2013).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
- Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Transactions of Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
- Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
- Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
- Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Res Treat. 73 (1), 75-83 (2002).
- Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
- Arora, R., et al. Insights from imaging the implanting embryo and the uterine environment in three dimensions. Development. 143 (24), 4749-4754 (2016).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Science Translational Medicine. 6 (217), (2014).
- de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
- Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast- A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 903-913 (2019).
- Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
- Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
- Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
- Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
- Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51171 (2014).
- Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59502 (2019).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4030 (2012).
- Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translation Medicine. 3 (106), (2011).
- Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
- Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. The Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. The Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
- Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. Biochemistry Journal. 115 (5), 58 (1969).
- Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
- Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
- Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal Visualized Experiments: JoVE. (121), e55209 (2017).
- Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Prevention Research (Philadelphia). 6 (1), 51-58 (2013).
