Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

CRISPR-genredigeringsverktøy for analyse av mikroRNA-klyngenettverk

Published: April 25, 2022 doi: 10.3791/63704
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

Summary

Denne protokollen beskriver en høy gjennomstrømningsklynget regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) genredigeringsarbeidsflyt for mikroRNA-klyngenettverksanalyse som tillater rask generering av et panel av genetisk modifiserte cellelinjer som bærer unike miRNA-klyngemedlemsslettingskombinasjoner så store som 35 kb i et enkelt eksperiment.

Abstract

MikroRNA (miRNA) har dukket opp som viktige cellulære regulatorer (tumor suppressorer, pro-onkogene faktorer) av kreft og metastase. De fleste publiserte studier fokuserer på et enkelt miRNA når man karakteriserer rollen som små RNA i kreft. Imidlertid er ~ 30% av humane miRNA-gener organisert i grupperte enheter som ofte uttrykkes samtidig, noe som indikerer et komplekst og koordinert system for ikke-kodende RNA-regulering. En klarere understating av hvordan grupperte miRNA-nettverk fungerer sammen for å regulere tumorvekst, kreft aggressivitet og stoffresistens er nødvendig før man oversetter ikke-kodende små RNA-er til klinikken.

Bruken av en høy gjennomstrømningsklynget regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) -mediert genredigeringsprosedyre har blitt ansatt for å studere den onkogene rollen til en genomisk klynge av syv miRNA-gener som ligger i et lokus som spenner over ~ 35.000 bp i lengde i sammenheng med prostatakreft. For denne tilnærmingen ble humane kreftcellelinjer infisert med en lentivirusvektor for doxycyklin (DOX) -induserbar Cas9-nuklease dyrket i DOX-inneholdende medium i 48 timer. Cellene ble deretter samtransfisert med syntetiske transaktiverende CRISPR RNA (tracrRNA) kompleks med genomisk stedsspesifikk CRISPR RNA (crRNA) oligonukleotider for å tillate rask generering av kreftcellelinjer som bærer hele miRNA-klyngeslettingen og individuelle eller kombinasjon miRNA-genklyngeslettinger i et enkelt eksperiment.

Fordelene med dette høykapasitets genredigeringssystemet er evnen til å unngå tidkrevende DNA-vektorunderkloning, fleksibiliteten i transfekterende celler med unike guide-RNA-kombinasjoner i et 24-brønns format, og den billigere PCR-genotypingen ved bruk av råcellelysater. Studier som bruker denne strømlinjeformede tilnærmingen lover å avdekke funksjonelle redundanser og synergistiske / antagonistiske interaksjoner mellom miRNA-klyngemedlemmer, noe som vil hjelpe til med å karakterisere de komplekse små ikke-kodende RNA-nettverkene som er involvert i menneskelig sykdom og bedre informere fremtidig terapeutisk design.

Introduction

Bedre forskningsverktøy er nødvendig for å undersøke bidraget fra ikke-kodende RNA i menneskelig sykdom. MiRNA-dysregulering observeres ofte ved menneskelige lidelser som kreft når man sammenligner uttrykksprofilene til disse små ikke-kodende RNA-ene i vev og kroppsvæsker (f.eks. blod, urin) hos kreftpasienter versus ikke-kreft, friske individer, bruk av mikromatriser, kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR) og neste generasjons dype sekvenseringsteknologier 1,2 . Nylig arbeid har karakterisert en stor delmengde av disse miRNA som tumorundertrykkende, onkogene og metastasefaktorer som styrer tumordannelse, sykdomsprogresjon og stoffresistens. Eksperimentell overekspresjon og/eller nedregulering/tap av miRNA resulterer i funksjonelle og pleiotropiske konsekvenser i cellen, noe som gjenspeiler det brede spekteret av kreftassosierte aktiviteter disse ikke-kodende RNA-ene koordinerer - vekst, apoptose, differensiering, kromatinremodellering, angiogenese, epitelial til mesenkymal (EMT) og MET-overganger, metabolisme og immunrespons3.

MiRNA er kodet som enkeltgener eller bor i genomiske klynger, som transkriberes i kjernen og behandles grundig før de genererer de biologisk modne, enkeltstrengede ~ 22 nukleotid (nt) miRNA-artene lokalisert i cytoplasma4. Disse små RNA-ene utøver sine effekter posttranskripsjonelt og fungerer som negative genregulatorer som binder seg til messenger-RNA (mRNA) -mål på en sekvensspesifikk måte for å bringe det katalytiske RNA-induserte silencingkomplekset (RISC) til mRNA-stedet, noe som resulterer i mRNA-nedbrytning og / eller en blokk i proteinoversettelse. MiRNA er en ekstremt rikelig klasse av ikke-kodende RNA i dyresystemer, og 2,654 modne miRNA eksisterer i det menneskelige genomet (miRBase release 22.1)5. MiRNA assosieres vanligvis med ufullstendig komplementaritet til deres mRNA-mål4. Derfor kan et enkelt miRNA regulere titalls til hundrevis av forskjellige mRNA-mål og funksjonelt påvirke et stort utvalg av biologiske veier. For å øke kompleksiteten til miRNA-baserte mekanismer, kan et enkelt mRNA reguleres av flere, distinkte miRNA-er. Det er derfor utfordrende å undersøke hvordan miRNA dysregulering forstyrrer kroppens homeostatiske balanse og fører til menneskelig malignitet.

Flertallet av publiserte studier har fokusert på et enkelt miRNA når de karakteriserer sin rolle i sykdomshendelser. Imidlertid er ~ 30% av humane miRNA-gener organisert i grupperte enheter (typisk ~ 10 kilobaser [kb]) som ofte transkriberes i samme retning og uttrykkes samtidig, noe som indikerer et koordinert og komplekst system med ikke-kodende RNA-regulering6. Den største polycistroniske humane miRNA-klyngen er 14q32-klyngen som består av 54 miRNA-forløpere. En av de mest studerte grupperte miRNA-enhetene assosiert med humane kreftformer er miR-17-92 polycistronisk klynge bestående av miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 og miR-92-1 som bor innenfor intron 3 av det ikke-kodende RNA, c13orf25. MiR-17-92-klyngen forsterkes ofte i hematopoietiske maligniteter og overuttrykkes i solide svulster og har etablert onkogene roller for å fremme cellesyklusprogresjon, apoptose og angiogenese7. I tillegg blir den tumorundertrykkende miR-15a- og miR-16-1-klyngen som ligger innenfor intronet til det ikke-kodende genet Leu2 ofte slettet i leukemier og nedregulert i et stort spekter av kreftformer, og fungerer for å blokkere tumorvekst ved å målrette det antiapoptotiske genet BCL2 og ytterligere cellesyklusprogresjonsgener8. MiR-888-klyngen er forhøyet hos pasienter med høygradig prostatakreft og består av syv miRNA-gener (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b og -891a) lokalisert på humant kromosom Xq27.3 9,10.

MiR-888-klyngekartene i HPCX1-lokuset (arvelig prostatakreft, X-bundet 1) som spenner over Xq27-2, som ble identifisert ved koblingsanalyse av arvelige stamtavler for prostatakreftfamilien 11,12,13,14,15,29. Funksjonell karakterisering av individuelle miR-888 grupperte medlemmer ved hjelp av konvensjonelle miRNA-feiluttrykksverktøy - miRNA-etterligninger og antisense-hemmere - indikerte at disse miRNA-ene spiller overlappende roller i regulering av prostatasvulstvekst og invasjon 9,10. Imidlertid egner disse eksperimentelle metodene seg ikke lett til å studere hvordan flere miR-888 grupperte medlemmer opptrer synergistisk eller antagonistisk i et ikke-kodende RNA-nettverk for å kontrollere vevshomeostase og kreftprogresjon. Denne beskrevne strømlinjeformede protokollen ved hjelp av CRISPR-genredigeringsteknologi med høy gjennomstrømning er modifisert for å molekylært dissekere miRNA-klynger assosiert med humane kreftformer (f.eks. MiR-888-klyngen) for å bygge bro over dette kunnskapsgapet.

Bakterielle CRISPR- og CRISPR-assosierte (cas) gener formidler adaptiv immunitet mot bakteriofager16. Oppdagelsen av dette gamle prokaryote overvåkingssystemet ble raskt tilpasset som et effektivt vitenskapelig verktøy for enkelt å målrette mot ethvert ønsket genomisk lokus og gjøre DNA-sekvensendringer innenfor et stort utvalg av dyresystemer og celletyper både in vitro og in vivo16,17. Denne teknikken har stort løfte som en effektiv metode for å forhøre miRNA-nettverk i sammenheng med menneskelig sykdom. For dette formål er denne CRISPR-genredigeringsprotokollen med høy gjennomstrømning for å studere miR-888-klyngen som spenner over ~ 35 kb på menneskelig kromosom X i udødelige humane prostatakreftcellelinjer (LNCaP, PC3-ML) konstruert for å forhøre hvordan klyngemedlemmer koordinerer kreftprogresjonsveier. Denne tilnærmingen kan brukes til å karakterisere en hvilken som helst miRNA-klynge og lar etterforskere raskt generere humane cellelinjer som bærer hele miRNA-klyngeslettingen og individuelle og kombinasjon miRNA-genklyngeslettinger i et enkelt eksperiment.

I denne prosedyren etableres stabile cellelinjer som bærer et doxycyklin (DOX) induserbart lentiviralt ekspresjonssystem som gjør det mulig for etterforskeren å kontrollere Streptococcus pyogenes CRISPR-assosiert endonuklease Cas9 (csn1) genuttrykk gjennom den konstitutive DOX-induserbare promotoren TRE3G. Tet-On 3G-topartssystemet innebærer en konstitutiv menneskelig forlengelsesfaktor 1 alfa (hEF1alpha) promotor for å drive transkripsjonen av både Tet-On 3G-genet og blasticidinresistensgenet (BlastR) som en bicistronisk transkripsjon. Tet-On 3G-transaktivatorproteinet binder seg bare til TRE3G-promotoren i nærvær av DOX, noe som resulterer i robust Cas9-transkripsjon. I fravær av DOX er det ingen eller svært minimal basal Cas9-uttrykk. Derfor kan etterforskeren indusere høy Cas9-proteinproduksjon i celler dyrket i medier supplert med DOX under CRISPR-genredigeringstrinnene og kontroll for rask CAS9-proteinclearance ved DOX-seponering.

Denne protokollen beskriver også utformingen av syntetiske CRISPR RNA (crRNA) oligonukleotider rettet mot regioner som flankerer hele miRNA-klyngen, individuelle miRNA-hårnålsområder (premiRNA) og/eller undergrupper av miRNA-gener i klyngen. Hvert designet crRNA inneholder en unik 5'-terminal 20 nt guidesekvens (komplementær til den genomiske sekvensen av interesse som skal målrettes), etterfulgt av en invariant 22 nt S. pyogenes repetisjonssekvens (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') som muliggjør baseparing med den universelle transaktiverende CRISPR RNA (tracrRNA) oligonukleotider18. Sammen fungerer det glødede crRNA og tracrRNA (blandet 1: 1-forhold) som veiledende RNA for denne protokollen (figur 1A). I hvert eksperiment blir to syntetiske guide-RNA transfisert til DOX-induserte celler for å knytte og eskortere det bakterielle Cas9-proteinet til de genomiske DNA-stedene (5 'og 3') som flankerer miRNA-klyngeområdet som er målrettet for fjerning (figur 1B).

En protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens (5'-NGG-3' for vill type S. pyogenes Cas9) må være tilstede i cellegenomet og plassert umiddelbart ved siden av 20 nt DNA-sekvensen målrettet av guiden RNA17. PAM-sekvensen fungerer som et bindende signal og posisjonerer den katalytiske regionen av endonuklease Cas9-enzymet på det målrettede genomiske DNA-stedet, og fører deretter til rettet, dobbeltstrenget (ds) DNA-spaltning lokalisert ~ 3 nt oppstrøms pam. Cellens DNA-reparasjonsmaskiner reparerer de spaltede DNA-endene, noe som kan resultere i perfekt ligering, men ofte oppstår ikke-homogen endeforbindelse (NHEJ), noe som forårsaker små innsettinger eller slettinger (indels) på reparasjonsstedet. Siden miRNA er ikke-kodende gener som ofte befinner seg i intergene og introniske regioner, har disse indels en lav risiko for å skape uønskede tull / missense mutasjoner.

Ved å bruke syntetiske RNA oligonukleotider (annealed crRNA og tracrRNA, 1: 1 molar ratio) koding for guide RNA-komplekset i disse forsøkene, unngår denne gen knockout-strategien tidkrevende DNA-vektorunderkloning og gir stor fleksibilitet i transfektering av unike guide RNA-kombinasjoner til celler i et 24-brønns format. Fremstilling av råcellelysater for PCR genotype screening unngår også dyre og tidkrevende DNA-rensemetoder, samtidig som det muliggjør strømlinjeformet enkeltkolonicellelinjegenerering og fenotypisk analyse. Faktisk har denne CRISPR-genredigeringsprotokollen med høy gjennomstrømning blitt brukt med hell til å transfektere dyrkede prostatakreftcellelinjer (LNCaP, PC3-ML) med 32 unike guide RNA-kombinasjoner i et enkelt eksperiment og generere knockout-linjer som bærer slettinger for hele ~ 35 kb miR-888-klyngeområdet; mindre slettingskombinasjoner for miR-888-klyngemedlemmer som tilhører familiene miR-743 og miR-891a; samt slettinger for individuelle miRNA-medlemmer i miR-888-klyngen. Studier som disse vil gi en klarere undervurdering av hvordan grupperte miRNA fungerer sammen for å regulere tumorvekst, aggressivitet og stoffresistens før de oversetter miRNA til klinikken som terapeutiske og diagnostiske verktøy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse for CRISPR-genredigering og veilede RNA-design for å generere miRNA-klynge knockoutcellelinjer

  1. Lag en DNA-fil som inneholder den komplette genomiske sekvensen av miRNA-klyngeområdet av interesse (intergen, intronic) og minst 1 kB av omkringliggende genomiske regioner ved hjelp av et DNA-sekvensmerknadsprogram19.
    1. Bruk et funksjonsredigeringsverktøy i den opprettede DNA-filen for å merke det målrettede miRNA-klyngelokuset (intergent, intronic) og hver enkelt miRNA-hårnålssekvens som tilhører miRNA-klyngen, samt notere andre nærliggende kodende og ikke-kodende gener og / eller regulatoriske funksjoner 5,20,21,22.
    2. Forsikre deg om at miRNA-regionene som er målrettet for sletting, ikke utilsiktet forstyrrer nærliggende proteinkodende gener, ikke-kodende gener eller viktige regulatoriske DNA-elementer.
      MERK: Vurder genomisk kompleksitet (f.eks. Kromosomdupliseringer / fusjoner) av cellelinjen som brukes i denne protokollen.
  2. Design syntetiske crRNA-er rettet mot 20 nt genomisk DNA-sekvens som flankerer hele miRNA-klyngen, individuelle miRNA-hårnålsregioner (pre-miRNA) og / eller undergrupper av miRNA-gener i klyngen ved hjelp av et bioinformatisk guide RNA-designprogramvareverktøy (f.eks.23). Forsikre deg om at riktig Cas9-enzym er notert i veiledningen RNA-designverktøy (dvs. S. pyogenes Cas9).
    MERK: Det syntetiserte crRNA vil inneholde denne unike 5'-terminale 20 nt guidesekvensen (komplementær til DNA-målet) etterfulgt av en invariant 22 nt S. pyogenes gjenta sekvens for å tillate baseparing med det syntetiserte universelle tracrRNA oligonukleotid. Annealed sammen, vil de fungere som guide RNA i denne protokollen.
    1. Referer til den opprettede DNA-filen (trinn 1.1.), skriv inn ~ 150 nt DNA-sekvens som ligger umiddelbart oppstrøms (5 ') eller nedstrøms (3 ') av miRNA-hårnålen / klyngelokuset som er målrettet for sletting i den bioinformatiske veiledningen RNA-designprogramvareverktøy23.
      MERK: Designverktøyet vil identifisere unike 20 nt-sekvenser for crRNA oligonukleotiddesign som ligger rett ved siden av PAM-sekvensen (på den ikke-målrettede DNA-strengen) (f.eks . S. pyogenes Cas9 PAM-sekvens NGG). Nedenfor er et eksempel på crRNA-design rettet mot et nettsted umiddelbart oppstrøms (5 ') av mir-891a-genlokuset (spesielt 5A (891a) diskutert i den representative resultatdelen og tabell 1).
      1. Åpne veiledningen RNA design software tool23.
      2. Skriv inn navnet 5A(891a) i Vinduet Enter Name .
      3. I vinduet Skriv inn en DNA-sekvens , skriv inn 150 nt genomisk sekvens som ligger umiddelbart oppstrøms (5 ') av mir-891a forløpergenet: 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
        TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTCTTTGTTTTTTTCTAGGTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. Merk av i boksen merket Aktiver spesifisitetskontroll for å ekskludere nettsteder som ikke er målrettet, og som er oppdaget beregningsmessig av programmet. Velg riktig organisme (dvs. Human [Homo sapiens]).
      5. Angi riktig Cas9 enzym PAM ansatt for studiene, i dette tilfellet Streptococcus pyogenes Cas9-PAM: NGG, for å generere følgende standardinnstillinger: PAM i forhold til mål: Etter; Gjenta sekvens: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; I forhold til guide: 3; Målsekvens lengde: 20; Kutt i forhold til mål 5' start: Sense 17 Anti-sense 17.
      6. Klikk på Neste-knappen for å se resultatene for syntetisk crRNA-syntese.
        MERK: I dette eksemplet vil det foreslåtte crRNA som skal syntetiseres gjenkjenne DNA-målet ATACATGCTGATAGTTACAC og vil bli plassert ved siden av PAM: AGG.
    2. Referer til DNA-filen (opprettet i trinn 1.1.) for å bestemme den beste kandidaten crRNA 20 nt målsekvenser som ligger nærmest miRNA-lokuset som skal slettes og har den høyeste spesifisiteten for det tiltenkte genomiske målet.
      1. Bruk beregningsmessige off-targeting analyseverktøy for å evaluere kandidatens crRNA-spesifisitet og forutsi potensielle off-targeting-nettsteder i genomiske loci som ikke er relatert til den målrettede miRNA-klyngeregionen av interesse (f.eks. 24,25,26,27).
      2. Registrer potensielle resultater utenfor målretting for senere referanse ved genotyping av enkeltkoloni CRISPR klonale cellelinjer ved PCR (trinn 4.2.6.).
        MERK: Omfanget av sekvenskomplementaritet som deles mellom det designede crRNA oligonukleotidet og den genomiske målsekvensen, vil diktere hvor selektivt Cas9-enzymet spalter genomet på det stedet. Siden guiden RNA anneals til det genomiske målet i en 3 'til 5' retning, vil mismatcher på 5'-enden av DNA-målsekvensen (de første 8-10 basene) ofte blokkere Cas9-mediert spaltning. Hvis den genomiske målsekvensen deler homologi med et annet genomisk lokus, bortsett fra innenfor de første åtte basene av DNA-sekvensen, forventes dette guide-RNA å ha liten sjanse for off-targeting på dette stedet.
      3. Design fire unike crRNA-er for hvert målrettede miRNA-lokus: to designede crRNA-er for å målrette komplementære DNA-sekvenser umiddelbart 5' av miRNA-hårnålen/klyngen (5'A, 5'B) og to designede crRNA-crRNA-sekvenser for å målrette komplementære DNA-sekvenser umiddelbart 3' av miRNA-hårnålen/klyngen (3'A, 3'B).
        MERK: Når du utfører CRISPR-transfeksjonene (i seksjon 3), vil fire mulige 5 'og 3' guide RNA-parkombinasjoner (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) bli testet for hvert målrettede miRNA-lokus for å øke sannsynligheten for å generere vellykkede miRNA-locus-slettinger i et enkelt eksperiment.
      4. Bruk et funksjonsredigeringsverktøy i den opprettede DNA-filen (trinn 1.1.) for å markere DNA-målsekvensen (med tilstøtende PAM) for hvert designet crRNA som skal syntetiseres.
  3. Design og syntetiser PCR-primere (fremover, bakover) som flankerer de målrettede miRNA-klyngeområdene for genotyping av CRISPR-cellelinjer (og merk primerne i den opprettede DNA-filen).
    1. For genotyping av cellelinjer som bærer små genomiske delesjoner for tett grupperte eller individuelle miRNA, design PCR-primere (fremover, revers) som bor ca. 150 bp på hver side av Cas9-spaltningsstedet / knockout-regionen som vil muliggjøre deteksjon av både wildtype (~ 600 bp) og knockout (~ 300 bp) DNA-fragmenter i en enkelt PCR-reaksjon via gelelektroforese.
    2. For genotyping av cellelinjer som bærer store genomiske delesjoner for miRNA-forløperkombinasjoner eller hele miRNA-klyngen, må du igjen designe PCR-primere (fremover, revers) som bor omtrent 150 bp på hver side av Cas9-spaltnings- / knockoutstedet. Merk at hvis den målrettede miRNA-klyngeslettingen spenner over >4 kb i lengde, vil PCR-reaksjonen sannsynligvis bare oppdage det mindre (~ 300 bp) knockout DNA-fragmentet, men ikke wildtype DNA-fragmentet. Design derfor ytterligere PCR-primere (fremover, revers) som kan oppdage tilstedeværelse eller fravær av interne miRNA-klyngegener for å hjelpe screeningsprosessen og validere for homozygote knockoutcellelinjer.

2. Generering av stabile lentivirale cellelinjer som bærer den DOX-induserbare Kassetten med Cas9-uttrykk

MERK: Utfør alt cellekultur- og virusarbeid i en sertifisert biosikkerhetshette ved hjelp av BSL2-prosedyrer og aseptisk teknikk.

  1. Bestem riktig cellelinjetype for CRISPR-studiene og foretrukne vekstmedier.
    MERK: Denne protokollen ble utviklet for humane prostatakreftcellelinjer LNCaP (foretrukket medium: RPMI, 10% føtalt bovint serum [FBS]) og PC3-ML (foretrukket medium: DMEM, 10% FBS).
  2. Utfør en blasticidin "død" -kurve for å bestemme den optimale legemiddelkonsentrasjonen som skal velges for lentivirusinfiserte celler som bærer blasticidinresistensgenkassetten (trinn 2.3.).
    1. Plateceller i 11 brønner av en 24-brønns plate og vokser ved 37 ° C, 5% CO2 i det foretrukne medium til ca. 75% sammenflytende.
    2. Fortynn blasticidinet (arbeidsmateriale 1 mg/ml) i det foretrukne med en endelig konsentrasjon fra 0, 1 til 10 mikrogram/ml og fortynnet i trinn på 1 mikrogram/ml.
    3. Merk brønnene på den sådde 24-brønnsplaten fra 1 til 11. Fjern vekstmediet fra brønnene og erstatt med passende blasticidinkonsentrasjoner.
    4. Bytt medium med passende blasticidinkonsentrasjoner annenhver dag i 7-10 dager.
    5. Undersøk cellene daglig i løpet av tidsforløpet og bestem minimum blasticidinkonsentrasjon som kreves for å drepe alle cellene innen 5-7 dager.
      MERK: En blasticidin "kill" -kurve må utføres for hver spesifikk cellelinje som brukes til CRISPR-genredigeringseksperimentene.
  3. Infiser cellene med lentivirus som bærer den DOX-induserbare Cas9-ekspresjonskassetten og utfør blasticidinseleksjon ved hjelp av den optimale konsentrasjonen bestemt i trinn 2.2.
    1. I tre brønner på en 6-brønns plate × frø 5 104 celler per brønn og vokser i det foretrukne mediet ved 37 °C, 5 % CO2 over natten (ON).
    2. Neste dag tiner du lentivirusuttrykksvektoren for DOX-induserbar Cas9 (Lenti-iCas9) på is. Bland forsiktig (ikke virvelviruspartikler).
      MERK: Oppbevar lentiviruset i aliquots ved -80 ° C for å unngå flere fryse / tine sykluser, noe som vil redusere viral titers og infeksjonseffektivitet.
    3. Beregn volumet som trengs for å transdusere 5 × 104 celler med virus ved et mangfold av infeksjon på 0,3 (MOI = 0,3) basert på viral titerkonsentrasjon.
    4. Rør riktig virusvolum til 250 μL (per brønn) serumfritt og antibiotikafritt foretrukket medium supplert med 0,8 μg/ml heksadimetrinbromid. Bland forsiktig.
      MERK: Heksadimetrinbromid er en kationisk polymer funnet å øke viral adsorpsjon og infeksjonseffektivitet.
    5. Fjern mediet. Tilsett 250 μL fremstilt transduksjonsmedium med Lenti-iCas9-virus (MOI = 0,3) til cellene og inkuber ON ved 37 °C, 5 % CO2. (Forkort inkubasjonstiden til 4-6 timer hvis cellene utviser virusrelaterte toksiske effekter.)
    6. Bytt ut mediet med ferskt foretrukket medium og la cellene komme seg i 1-2 dager.
    7. Utfør blasticidinseleksjon på de infiserte cellene i 10-14 dager ved å bruke den optimale blasticidinkonsentrasjonen avledet fra "kill" -kurven beskrevet i trinn 2.2.
      1. Parallelt vokser de uinfiserte cellene i medium med den optimale blasticidinkonsentrasjonen som skal brukes som en positiv kontroll for viral seleksjon.
    8. Endre mediet supplert med optimal blasticidinkonsentrasjon hver 3. dag i løpet av valgtiden for å fjerne døde celler.
      MERK: Bare celler som overlever blasticidinseleksjon vil ha integrert lentiviralvektoren.
    9. Utvid blasticidin-valgte Lenti-iCas9 cellelinjer.
      MERK: Registrer cellens passasjenummer ved hver utvidelse.
      1. Frys ned en del av Lenti-iCas9-cellene i foretrukket medium supplert med 10 % dimetylsulfoksid (DMSO) for langtidslagring av kryovium.
      2. Analyser en del av Lenti-iCas9-cellene ved western blot9 for å identifisere cellelinjen som viser de mest robuste DOX-induserbare Cas9-proteinnivåene (se trinn 2.3.).
  4. Utfør en doksycyklinkonsentrasjonskurve på nyetablerte Lenti-iCas9-cellelinjer for å bestemme de optimale forholdene for Cas9-proteininduksjon.
    1. Sett opp fire uavhengige 6-brønns plater for hver cellelinje som testes for å utføre dette DOX-konsentrasjonstidskurset. Plate 5 × 104 celler per brønn av hver 6-brønns plate og vokser ved 37 °C, 5 % CO2 i det foretrukne mediet i 24 timer.
    2. Fortynn DOX (arbeidsstokk 1 mg/ml) i det foretrukne mediet med en endelig DOX-konsentrasjonskurve fra 0, 50, 100, 150, 250 til 500 ng/ml.
    3. Merk brønnene på hver seedede 6-brønns plate fra 1 til 6. Fjern mediet og erstatt med passende DOX-konsentrasjoner. Vokseplater 1-4 til følgende tidspunkter: 24 timer, 48 timer og 72 timers DOX-induksjon; og 120 timer etter dox-seponering (initialt 72 timer DOX-indusert).
    4. Høst brønnene på platen ved hvert tidspunkt ved hjelp av passende metoder (f.eks. Trypsinisering). Oppbevar cellepellets ved -80 °C. Behandle cellepellets i RIPA-buffer for lysatisolering og Cas9 western blot-analyse.
      1. Kjør 40 μg cellelysat for hver prøve av DOX-induksjonstidskurset ved hjelp av en denaturerende 4% -12% Bis-Tris gel og overfør proteinene til en immunoblotmembran.
      2. Hybridiser immunblotmembranen med et primært antistoff mot Cas9 for å påvise 160 kDa-proteinet. Normaliser Cas9-nivåer ved hjelp av et rengjøringsgen som GAPDH (37 kDa).
    5. Basert på western blot-resultatene, bestem den optimale DOX-konsentrasjonen for å indusere Cas9 i Lenti-iCas9-cellelinjene.
      MERK: Denne gangen kurset vil også avsløre hvor tett Cas9 uttrykk er regulert på 120 h post DOX fjerning.
    6. Etablere enkeltcellekolonier for Lenti-iCas9-cellelinjene som viser robust Cas9-proteinuttrykk for å optimalisere CRISPR-transfeksjonene (i seksjon 3).

3. Utføre CRISPR-reaksjoner ved Cas9-induksjon og syntetisk guide RNA-transfeksjon av celler ved hjelp av et høyt gjennomstrømningsformat

Merk: Et arbeidsflytdiagram er vist i figur 1.

  1. På papiret kartlegger du crRNA-parkombinasjonene som vil bli transfisert i hver brønn av en 24-brønns plate rettet mot hele miRNA-klyngen, forskjellige grupperte miRNA-genkombinasjoner, samt individuelle miRNA-klyngemedlemmer.
    1. På kartet merker du fire brønner per målrettede miRNA-lokus. La hver brønn representere en transfeksjonsreaksjon, med to unike crRNA plassert 5 'og 3' av ønsket miRNA knockout genomisk lokus og tracrRNA (glødet 1: 1 molar ratio).
    2. Sørg for at hver av de fire merkede brønnene representerer et unikt crRNA-par for transfeksjon (f.eks. 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      MERK: Utformingen av to 5 'crRNA og to 3' crRNAer som flankerer hvert målrettet miRNA-lokus (seksjon 1) muliggjør generering av fire mulige 5 'og 3' guide RNA-par i transfeksjonsreaksjonen.
  2. Plate Lenti-iCas9 cellelinjen ved 5 x 104 celler / brønn av en 24-brønns plate i det foretrukne medium som inneholder den optimaliserte DOX-konsentrasjonen (bestemt i trinn 2.4.). Vokse cellene i 24-48 timer ved 37 ° C, 5% CO2 for å indusere Cas9 proteinuttrykk.
  3. Transfect Lenti-iCas9 cellene med de forberedte 5 'og 3' guide RNAene.
    1. Rekonstituer de syntetiserte crRNA- og tracrRNA-oligonukleotidene med nukleasefritt vann til en lagerkonsentrasjon på 10 μM. Oppbevar ved -80 °C på lang sikt.
    2. Merk fire mikroscentrifuger på 1,5 ml per målrettet miRNA-lokus basert på det eksperimentelle kartet designet i trinn 3.1., som representerer de fire mulige 5' og 3' crRNA-parkombinasjonene (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
    3. I hvert rør blander du et 1: 1 molar forhold mellom tracrRNA og unike crRNA (5 'og 3') sammen for å danne 2 μM guide RNA-komplekset ved hjelp av følgende reaksjon (sluttvolum på 10 μL):
      1. Tilsett 2,5 μL tracrRNA (10 μM lager), 1,25 μL av 5' posisjonert crRNA (10 μM lager), 1,25 μL av 3' posisjonert crRNA (10 μM lager), og 5 μL av 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 til et 1,5 ml sentrifugerør. Mikrosentrifuge i 30 s ved 16 000 × g å blande. Rug ved romtemperatur (RT) i 5 minutter.
    4. Til hvert rør tilsettes 40 μL redusert serummedium (f.eks. Opti-MEM) til 10 μL veiledende RNA-kompleksreaksjon (50 μL totalt volum). Bland forsiktig ved pipettering opp og ned.
    5. I et rent sentrifugerør på 1,5 ml blandes 2 μL av transfeksjonsreagenset28 (se NOTE 3.3.5.1.) og 48 μL redusert serummedium (f.eks. Opti-MEM, sluttvolum på 50 μL) forsiktig ved å pipettere opp og ned. Rug på RT i 5 min.
      1. Forbered en masterblanding av transfeksjonsreagenset ved å multiplisere reagenset (2 μL) og redusert serummedium (f.eks. Opti-MEM, 48 μL) mengder med antall brønner som skal transfekteres, pluss 10% ekstra volum for å ta hensyn til små pipetteringsfeil.
        MERK: Velg et transfeksjonsreagens som er optimalisert for små RNA- og CRISPR RNA-oligonukleotidtransfeksjoner, samt for cellelinjetype28.
    6. Til hvert rør som inneholder 50 μL veiledende RNA-blanding (fra trinn 3.3.4), tilsett 50 μL av det fortynnede transfeksjonsreagenset (fra trinn 3.3.5). Rør blandingen sakte opp og ned en gang for å blande. Ruge på RT i 20 min.
    7. Tilsett 400 μL antibiotikafritt medium supplert med DOX (optimal konsentrasjon) til hvert rør som inneholder 100 μL av guide RNA / transfeksjonsblandingen. Pipet forsiktig for å blande.
  4. Fjern mediet fra de DOX-induserte Lenti-iCas9-cellene (trinn 3.2). Legg til 500 μL media / DOX / guide RNA / transfeksjonsblanding basert på 24-brønns plateeksperimentelt kart (trinn 3.1.). Inkuber de transfekterte cellene i 48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
  5. Erstatt mediet med det friske foretrukne mediet uten DOX (for å fjerne Cas9-protein fra cellene). La cellene komme seg i ytterligere 24-48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
  6. Høst de transfiserte cellene (trypsinisering) og forbered deg på genotyping og encellede fortynninger.
    MERK: Celler representerer en blandet populasjon som inneholder transfiserte CRISPR-genredigerte og utransfiserte villtypeceller. Dette trinnet vil bestemme effektiviteten til CRISPR-redigering før du investerer tid / ressurser i encellet koloniutvidelse.
    1. Vask cellene 1x med 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Inkuber cellene i 100 μL trypsin i 5 minutter ved 37 °C, 5 % CO2 og overfør cellene til et rent sentrifugerør på 1,5 ml som inneholder 1 ml medium.
    2. Inverter for å blande og mikrocentrifuge cellene i 5 minutter ved 200 × g ved 20 °C. Fjern mediet og resuspender cellepelleten i 1 ml PBS.
    3. Mikrosentrifuger de vaskede cellene i 5 minutter ved 200 × g ved 20 °C. Fjern PBS og resuspender cellepelleten i 150 μL av det foretrukne medium.
  7. Bestem cellenummeret per mikroliter på 150 μL resuspenderte celler ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celletellingsinstrument.
  8. Skill 150 μL av resuspenderte celler i tre deler.
    1. Frys ned 1/3 transfekterte celler (50 μL) i medium pluss 10 % DMSO (sluttvolum på 150 μL) i kryotider for fremtidig ekspansjon/langtidslagring.
    2. Overfør 1/3 av transfiserte celler (50 μL) til et rent 0,2 ml PCR-rør for genotyping.
      1. Mikrosentrifuger cellene i 5 minutter ved 200 × g ved 4 °C og fjern mediet.
      2. Resuspender cellepelleten i 100 μL PBS.
      3. Mikrosentrifuger cellene i 5 minutter ved 200 × g ved 4 °C og fjern PBS. Oppbevar blandingscellepellets på lang sikt ved -80 °C.
      4. Behandle cellepelletsen for genotyping ved hjelp av arbeidsflyten i seksjon 4.
    3. Forbered den endelige 1/3 av cellene (50 μL) for fortynning og plating i et 96-brønns plateformat for å generere enkeltcellekolonier.
      1. Basert på celletallet i trinn 3.7, beregne fortynningene som kreves for å oppnå 10, 5, 2 og 1 celle (r) i 100 μL medium per brønn av en 96-brønns plate.
      2. Ved hjelp av en 12-kanals multipipettor og et sterilt reagensreservoar, tilsett 100 μL fortynnede celler per brønn til to rader av platen (24 brønner totalt) for hver fortynning (10, 5, 2 eller 1 celle per brønn). Tillat 4-6 uker for cellene å vokse til sammenstrømning for encellet koloniutvidelse. Observer cellene ukentlig under et lysmikroskop og legg merke til om koloniene representerer enkelt- eller flercellekolonier.
      3. Samle ~10-15 encellede kolonier for genotyping (§ 4). Identifiser minst tre uavhengige, knockout, encellede kolonilinjer for hvert målrettede miRNA-lokus. Behold villtype enkeltcellelinjer som kontroller.
        MERK: Screeningnummeret vil avhenge av cellelinjetypen og virkningen av miRNA knockout fenotype på cellevekst / levedyktighet.

4. PCR-genotyping av CRISPR-cellelinjer ved bruk av råcellelysater

  1. Høst individuelle, encellede kolonier fra nærkonfluente brønner av en 96-brønns plate.
    MERK: Fjerning av medium/PBS beskrevet i disse trinnene kan utføres manuelt ved hjelp av en vakuumaspirator i biosikkerhetsskapet, men vær forsiktig så du unngår krysskontaminering. Bruk en ny steril "gul" 200 μL pipetmanspiss for hver brønn på 96-brønnsplaten når du aspirerer, der hver utvekslede gule spiss er godt plassert i enden av en steril glassbeitepipette festet til vakuumaspiratoren.
    1. Vask brønnene 1x med 100 μL PBS. Aspirere PBS.
    2. Tilsett 50 μL trypsin og rug i 2-5 minutter ved 37 °C, 5 % CO2.
    3. Rør forsiktig opp og ned og overfør de resuspenderte cellene til et sentrifugerør på 1,5 ml som inneholder 1 ml medium.
    4. Inverter for å blande og forsiktig pelletere cellene i en mikrosentrifuge i 5 minutter ved 200 × g ved 20 °C.
    5. Fjern mediet og tilsett 1 ml PBS. Flikk forsiktig på røret for å forstyrre pelleten og inverter flere ganger for å blande.
    6. Mikrosentrifuge i 5 min ved 200 × g ved 20 °C for å pelletere cellene.
    7. Fjern PBS og resuspender pelleten i 300 μL fersk PBS.
    8. Del 300 μL-prøven i to deler.
      1. Overfør 200 μL av cellene (2/3 av pelleten) til en brønn av en 24-brønns plate som inneholder 1 ml av det foretrukne medium. Når genotypen er validert, bruk disse cellene til å utvide CRISPR-medierte knockoutcellelinjer for funksjonell analyse.
      2. Overfør 100 μL av cellene (1/3 av pelleten) til et 0,2 ml PCR-rør. Mikrosentrifuge i 5 minutter ved 3000 x g ved 4 °C. Fjern PBS. Oppbevar pelleten ved -80 °C.
  2. Klargjør råcellelysater for genotyping og sekvensanalyse ved hjelp av PCR-primerne designet i trinn 1.3. Inkluder cellelysatene fremstilt fra utransfiserte celler i disse forsøkene for å bruke som positive kontroller av vill type.
    1. Resuspender cellepelleten i 4 μL av 5x DNA-polymerasebuffer (se materialtabellen, sluttkonsentrasjon 1x), 1 μL proteinase K (20 ng / ml lager), 1 μL RNase A (10 ng / ml lager) og nukleasefritt vann opp til et totalt volum på 20 μL.
    2. Lyse cellene i en termosykler ved hjelp av et PCR-program: 56 °C i 30 min og 96 °C i 5 min. Oppbevar cellelysatene ved -20 °C.
    3. Utfør en PCR-reaksjon ved hjelp av de utformede PCR-primerne (fremover, bakover) som flankerer RNA 5' og 3' guide RNA-målrettede steder (tabell 1).
      MERK: DNA-polymerasebufferen og termosyklerforholdene vil avhenge av Taq DNA-polymeraseenzymet som brukes til PCR-reaksjonen. Denne protokollen ble optimalisert for en Phusion HF DNA Polymerase.
      1. Sett opp PCR-reaksjonsblandingen på is: 5 μL 5x DNA-polymerasebuffer, 0,5 μL fremre PCR-primer (10 μM-lager), 0,5 μL omvendt PCR-primer (10 μM-lager), 0,5 μL på 10 mM dNTPs, 0,25 μL DNA-polymerase, 1-4 μL cellelysat og nukleasefritt vann opp til et totalt volum på 25 μL.
      2. Kjør PCR-reaksjonen i en termosykler ved hjelp av programmet: 98 °C i 3 minutter og 35 sykluser på 98 °C i 10 s, 62 °C i 15 s, 72 °C i 15 s og deretter 72 °C i 10 minutter. Hold i 4 °C. Se NOTE 4.2.3. over.
    4. Last PCR-produktene på en 1% agarosegel for elektroforeseanalyse.
    5. Ekstraher DNA fra de isolerte PCR-fragmentene av den forutsagte molekylstørrelsen for knockout (og villtype) genotyper. Forbered prøvene for DNA-sekvensering.
    6. Valider at CRISPR-reaksjonen var vellykket og utfør DNA-sekvensering av de isolerte PCR-fragmentene for å identifisere Cas9-spaltningsstedet og bekrefte miRNA-lokus-sletting.
      1. Isoler minst tre uavhengige knockoutcellelinjer for hvert miRNA-lokus målrettet av CRISPR. Behold villtype (og heterozygote) cellelinjer som skal brukes som kontroller i nedstrøms funksjonelle studier.
      2. Utfør qRT-PCR- eller northern blot-analyse for å bekrefte at knockoutcellelinjene ikke uttrykker modent miRNA for det slettede lokuset.
        MERK: Helgenomsekvensering (WGS) er den mest definitive metoden for å validere CRISPR-genredigering og off-targeting.
      3. Test for CRISPR off-targeting-effekter ved PCR, som ble spådd beregningsmessig (trinn 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. Hvis omfattende enkeltcellekoloniscreening bare resulterer i heterozygote genotyper, gjenta veiledningen RNA-transfeksjon i encellede heterozygote linjer.
        MERK: Manglende evne til å oppnå homozygote knockoutcellelinjer kan indikere dødelige effekter på grunn av miRNA-tap eller iboende genomisk kompleksitet (f.eks. Kromosomdupliseringer / fusjoner) av foreldrecellelinjen som krever ytterligere analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne CRISPR-delesjonsprotokollen med høy gjennomstrømning ble vellykket brukt ved bruk av transfeksjon av Cas9-induserbare LNCaP og PC3-ML humane kreftcellelinjer med syntetisk oligonukleotidguide RNAer rettet mot miR-888-klyngen, som ble studert i sammenheng med prostatakreft. MiR-888-klyngen ble opprinnelig identifisert i en ekspresjonsprofileringsskjerm som forhøyet hos prostatakreftpasienter med høygradig sykdom sammenlignet med lavgradige og ikke-kreftpasienter 9,10. MiR-888-klyngen, som spenner over 35 124 bp, består av syv miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b og -891a) på humant kromosom Xq27.3 (figur 2A). Dette stedet ligger innenfor HPCX1 (arvelig prostatakreft, X-bundet 1, Xq27-28), som er assosiert med arvelig prostatakreft 11,12,13,14,15,29. miR-888, -890, -892a, -892b og -892c deler sekvens homologi og tilhører den pattedyrkonserverte miR-743-familien. Klyngemedlemmer miR-891a og miR-891b deler bare sekvens homologi med hverandre og tilhører den primatspesifikke miR-891-familien. Den genomiske organiseringen av miR-888-klyngen er bevart på tvers av primater, noe som innebærer funksjonell bevaring av et viktig signalnettverk30.

Tidligere arbeid med eksperimentell overekspresjon (miRNA-etterligninger) og inhibering (antisense oligonukleotider) studier for å evaluere individuell miR-888 klyngemedlemsaktivitet viste en overlappende rolle for alle miR-888-klyngemedlemmene for å fremme prostatakreftcelleinvasivitet ved bruk av Matrigel Boyden-kammeranalyser 9,10. Spesielt fungerte miR-888 og miR-891a på samme måte for å indusere prostatacellevekst (WST-1-analyser), akselerere prostata tumorbelastning i muse xenotransplantater og regulere vanlige mål (f.eks. TIMP-2) 9,10. Dette arbeidet antydet imidlertid et mer komplekst samspill mellom miR-888-klyngemedlemmene. For eksempel viste miR-888 og miR-891a synergistiske effekter for å fremme PC3-N prostatacelleproliferasjon, mens både miR-890 og miR-892c viste hemmende veksteffekter ved bruk av WST-1-analyser9. Derfor ble denne CRISPR-protokollen med høy gjennomstrømning brukt til å genetisk forhøre miR-888-klyngenettverket i sammenheng med prostatakreft.

Den beskrevne arbeidsflyten for CRISPR Cas9 genredigering (figur 1) tillot testing av 32 unike CRISPR-guide RNA-transfeksjonsreaksjoner i et enkelt eksperiment ved bruk av et 24-brønns format. Denne protokollen resulterte i vellykket identifisering av et panel av humane prostatakreft knockout cellelinjer som bærer slettinger for hele miR-888-klyngen, spesifikke miRNA-klyngemedlemskombinasjoner og individuelle miRNA-medlemmer. Genereringen av stabile induserbare Cas9-cellelinjer ble først etablert. Kort fortalt ble PC3-ML og LNCaP humane prostatakreftceller infisert med en DOX-induserbar Streptococcus pyogenes Cas9 lentivirusvektor (Lenti-iCas9; EditR Induserbare lentivirale hEF1aBlastCas9 Nukleasepartikler; MOI 0,3) i 6 timer (LNCaP) eller over natten (PC3-ML), avhengig av iboende cellelinjefølsomhet for virustoksisitet.

De infiserte cellelinjene gjennomgikk deretter blasticidinseleksjon (7,5 μg / ml) og encellet koloniutvidelse. Western blot-studier ble brukt til å velge enkeltkoloni PC3-ML og LNCaP Lenti-iCas9 cellelinjer som viser det mest robuste Cas9-uttrykket basert på et DOX-induksjonstidskurs (figur 2A). Dette lentivirale Cas9-induserbare systemet var tett kontrollert, og ved seponering av DOX i 120 timer ble det meste av Cas9-proteinet fjernet fra cellene (figur 2A). En DOX-konsentrasjonskurve fastslo at 250 ng/ml DOX var den optimale dosen for å indusere robust Cas9-proteinuttrykk i disse Lenti-iCas9 prostatacellelinjene (figur 2B). Ved hjelp av et online crRNA-designverktøy23 ble unike crRNA-er (to 5'- og to 3'-crRNA-crRNA-crRNA-knockout-lokus designet for å tillate fire mulige 5' og 3' guide RNA-kombinasjoner) designet som målrettet mot hele ~ 35 kb miR-888 klyngeregionen; mindre klyngekombinasjoner innenfor miR-743-familien eller miR-891-familien; samt individuelle miRNA-delesjoner (miR-888, -891a) (figur 3A). Ved utførelse av CRISPR-eksperimentene ble Lenti-iCas9-cellelinjer for prostatakreft dyrket i medium supplert med 250 ng / ml DOX i 48 timer for å indusere Cas9-uttrykk.

Cellene ble deretter transfisert i et 24-brønns plateformat med det syntetiske universelle tracrRNA-komplekset (1: 1 molarforhold) med et unikt sett med 5 'og 3' genomiske stedsspesifikke crRNAer (tabell 2). DOX ble fjernet fra cellekulturmediet 48 timer etter transfeksjon for å fjerne Cas9-protein fra prostatakreftcellene. Brønnene ble høstet 48 timer senere (96 timer etter transfeksjon) og en tredjedel av hver høstet cellepellets ble preparert for PCR-genotyping ved bruk av råcellelysater (tab 3). Gelelektroforeseanalyse av PCR-reaksjonene indikerte at den predikerte DNA-fragmentstørrelsen som representerte knockout-genotypen ble forsterket for hver CRISPR-transfeksjon (figur 3B). DNA-sekvensering av disse isolerte knockout PCR-fragmentene bekreftet at de transfiserte 5 'og 3' guide RNA-ene rettet Cas9-spaltning / ligering ~ 3 nt oppstrøms pam-stedene og validerte genomisk tap av det målrettede miRNA-lokuset (representativt eksempel vist i figur 4C). Siden miR-888-klyngen ligger i en intergen region av kromosom X (langt fra noen proteinkodende gener), var det ikke forventet at knockoutcellelinjer, som ofte hadde INDELs på Cas9-spaltningsstedet på grunn av NHEJ, ville forårsake nedstrøms artefakteffekter.

Selv om CRISPR-transfeksjonsreaksjonene var vellykkede (figur 3B), representerte de transfekterte cellene en blandet cellepopulasjon av transfiserte (knockout) og utransfiserte (villtype) celler. Denne populasjonen representerte også en blanding av celler som bærer homozygote og heterozygote delesjoner for det målrettede miRNA-lokuset. LNCaP og PC3 prostatakreft cellelinjer er avledet fra menn som har unormale karyotyper som inkluderer to X-kromosomer31,32. Derfor ble en del av hver celletransfeksjonsreaksjon serielt fortynnet i et 96-brønns plateformat for å oppnå enkeltcellekolonilinjer. Disse koloniene ble screenet av PCR for å velge for homozygote cellelinjer som manglet alle kopier av det målrettede miRNA-lokuset.

Denne prosedyren var viktig å følge i tide siden tidligere data har indikert en rolle for miR-888-klyngen for å fremme tumorcellevekst og sykdoms aggressivitet. Kreftceller som bærer CRISPR-delesjoner for miR-888-klyngemedlemmene ble spådd å vokse langsommere enn villtypeceller. En gyldig bekymring var at RNA-transfekterte brønner, som inneholdt en blandet populasjon av miRNA knockout og villtypeceller, over tid ville resultere i at villtypeceller raskt ville utkonkurrerte de kompromitterte mutantcellene i kultur. Dette ble notert å forekomme og ble spesielt uttalt i eksperimenter ved bruk av de svært aggressive PC3-ML-cellelinjene. Dermed ble trinn som involverte serielle fortynninger for å generere enkeltcellekolonilinjer eller cellepreparasjon for kryomassasje utført innen 48-72 timer etter å ha utført CRISPR-transfeksjonseksperimentene for å bevare knockoutcellene i de blandede populasjonsprøvene.

Den mest møysommelige delen av CRISPR-arbeidsflyten for miR-888-klyngen var genereringen av homozygote, encellede kolonimiRNA-slettinger. En utfordring i denne prosessen var at de dyrkede LNCaP- og PC3-ML-cellene vanligvis ikke trivdes godt når de ble belagt med encellede tettheter. I tillegg syntes cellevekst å være fenotypisk kompromittert ved kombinatorisk tap av miR-888-klyngemedlemmer (og korrelert med aggressivitet av cellelinjen). For noen av transfeksjonsreaksjonene rettet mot visse miRNA-lokuskombinasjoner var det derfor nødvendig med ytterligere cellefortynninger (ved bruk av et 96-brønnsformat) for å generere nok enkeltcellekolonilinjer for genotyping. Ved screening av genotypene til enkeltcellekoloniene ved elektroforesegelavbildning, var det nyttig å sammenligne båndintensiteten til villtypen sammenlignet med knockout PCR-fragmentene og avgjøre om cellelinjen var heterozygot (lik båndintensitet) eller representerte en flercellet koloni (ulik båndintensitet), som ville ha nytte av ytterligere runder med encellefortynninger. Hvis cellekolonier ble notert å ha PCR-fragmenter av unormal størrelse og inkonsekvent med villtype- eller knockout-genotyper, ble disse linjene eliminert fra studien.

DNA-sekvensering av isolerte PCR-fragmenter konsistente for villtype- og knockout-genotypene ble revalidert for hver etablerte enkeltcellekoloni og bekreftet ved hjelp av uavhengige metoder (dvs. qRT-PCR, WGS). Når det gjelder den typiske effektiviteten ved å generere homozygote nullcellelinjer i disse eksperimentene, varierte dette med det målrettede miRNA-lokuset og celletypen som ble brukt. For eksempel var effektiviteten i å skaffe enkeltkoloni mir-891a knockout-linjer ved bruk av LNCaP 30%, men falt til ~ 7% i PC3-ML-celler. Denne forskjellen kan skyldes iboende celletypeforskjeller (f.eks. PC3-ML-celler har høyere delingshastigheter / metastatisk potensial enn LNCaP-celler). CRISPR-effektivitetsforskjeller kan også gjenspeile den funksjonelle effekten av miRNA-tap (f.eks. fremmer miR-891a cellevekst og aggressivitet 9,10), og dermed kan knockoutfenotyper forstørres i mer aggressive cellelinjer som PC3-ML. Innhenting av enkeltkolonilinjer for større miRNA-lokus-delesjoner av miR-888-klyngen viste redusert effektivitet. Vi kunne ikke avgjøre om dette skyldtes å slå ut større regioner av DNA eller understreket de essensielle og overlappende funksjonelle rollene til miR-888-medlemmer i prostatakreftceller.

Detaljert beskrivelse og fenotypisk analyse av enkeltcellekoloni-ekspandert knockout miR-888 klyngecellelinjer generert fra denne arbeidsflyten pågår og vil bli publisert andre steder. Som et representativt resultat av miRNA-delesjoner generert i disse CRISPR-genredigeringsstudiene, vises funnene for LNCaP prostatakreftceller som bærer en individuell mir-891a-delesjon. Enkeltcellekolonier ble genotypet ved PCR og sekvensverifisert (figur 4A-C). Cellelinjer med unormalt store PCR-fragmenter ble ikke analysert (f.eks. klon L14 H7 vist i figur 4D). Når knockout og villtype enkeltcellekolonier ble oppnådd for mir-891a-locus, ble funksjonelle studier utført. Tidligere arbeid har vist at overekspresjon av miR-891a (miRNA etterligne lentiviral vektor) induserer prostatacellevekst9, og derfor ble det spådd at miR-891a-tap ville vise gjensidige effekter. WST-1 proliferasjonsanalyser som sammenlignet mir-891a knockout og villtypeceller bekreftet denne hypotesen, og miR-891a-tap resulterte i redusert vekst (figur 4D, E).

Figure 1
Figur 1: CRISPR-genredigeringsarbeidsflyt for å generere miRNA-klyngeslettinger. (A) Guide-RNA består av glødede syntetiske crRNA- og tracrRNA-oligonukleotider (blandet 1: 1 molarforhold). CrRNA oligonukleotid er designet for å inneholde en unik 5'-terminal 20 nt guidesekvens (gul) komplementær til det målrettede genomiske DNA-stedet og etterfølges av en invariant 22 nt Streptococcus pyogenes repetisjonssekvens (grønn) som baseparer med tracrRNA oligonukleotid. Røde piler indikerer Cas9-enzym dobbeltstrengede DNA-spaltningssteder som vanligvis ligger 3 nt oppstrøms for PAM. (B) Denne eksperimentelle arbeidsflyten viser en enkelt brønn på en 24-brønns plate. Celler infisert med en DOX-induserbar Cas9 lentivirusvektor (Lenti-iCas9, MOI 0.3) dyrkes i medium med DOX i 48 timer for å indusere Cas9-proteinuttrykk. To syntetiske guide RNA (blandet 1: 1 molar forhold mellom crRNA: : tracrRNA) transfekteres til Cas9-induserte celler. Guiden RNA eskorterer Cas9 til de genomiske DNA-stedene (5' og 3') som flankerer miRNA-klyngeregionen som er målrettet for fjerning. Celler fremstilles 48 timer etter transfeksjon for fortynning ved hjelp av et 96-brønns format for å generere enkeltcellekolonier for PCR-genotyping og nedstrøms fenotypiske analyser. Forkortelser: CRISPR = gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner; miRNA = mikroRNA; crRNA = CRISPR RNA; tracrRNA = transaktiverende CRISPR RNA; nt = nukleotid; Cas9 = CRISPR-assosiert endonuklease; PAM = protospacer tilstøtende motiv; DOX = doksycyklin; MOI = mangfold av infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kreftcellelinjer som bærer en doksycyklinininduserbar Cas9 lentiviral kassett som utviser tett Cas9-proteinregulering. (A) Western blot-analyse viste at human prostatakreft PC3-ML cellelinjer infisert med Lenti-iCas9-vektoren (EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, MOI 0.3) og dyrket i 48 timer i medium inneholdende 250 ng / ml DOX uttrykte optimale Cas9 proteinnivåer. Cas9-uttrykk ble normalisert til GAPDH-uttrykk. (B) PC3-ML-celler dyrket i medium med 250 ng / ml DOX i 48 timer og 120 timer (+ DOX) viste robust Cas9-proteinuttrykk. Fjerning av DOX fra media (-DOX) i 120 timer (120 timer etter) resulterte i Cas9 proteinclearance, målt ved western blot-analyse. Lignende resultater ble oppnådd ved generering av LNCaP Lenti-iCas9 cellelinje (ikke vist). Forkortelser: CRISPR = gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner; Cas9 = CRISPR-assosiert endonuklease; DOX = doksycyklin; MOI = mangfold av infeksjon; GAPDH = glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Crispr eksperimentell design med høy gjennomstrømning for å generere flere miR-888-klyngeslettingskombinasjoner i et enkelt eksperiment. (A) Diagram over miR-888-klyngen som ligger på humant kromosom Xq27.3, som indikerer pattedyrkonserverte miR-743 familiemedlemmer mir-892c, -890, -888, -892a og -892b (blå bokser) og de primatspesifikke miR-891-familiemedlemmene miR-891a og -891b (maroon bokser). Unike syntetiske crRNA oligonukleotider (grønne piler) ble brukt til å generere miR-888 cluster knockout kombinasjoner. Fremre og omvendte PCR-primere (små røde rektangler) ble designet for å genotype celler og skjerme for knockouts. (B) Dette representative resultatet viser 25 CRISPR-reaksjoner i transfiserte PC3-ML-celler (Lenti-iCas9) som målrettet mot en rekke miR-888 cluster knockout-kombinasjoner i et enkelt eksperiment. Hver transfiserte brønn av en 24-brønns plate inneholdt to unike gRNA som flankerte 5' og 3' sidene av det målrettede miRNA genomiske lokus (Δ) (som listet opp i tabell 2). Råcellelysater ble fremstilt for hver CRISPR-reaksjon og GENOTYPET PCR. Isolerte PCR-fragmenter som migrerer ved de forutsagte knockoutstørrelsene ved gelelektroforese ble DNA-sekvensert og validert for målrettet Cas9-spaltning og miRNA-lokusfjerning. Forventede WT PCR-fragment bp-størrelser er angitt i parentes, og de ønskede CRISPR KO PCR-fragmentstørrelsene vises nederst på gelen. Forkortelser: CRISPR = gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner; Cas9 = CRISPR-assosiert endonuklease; gRNA = guide RNA; DOX = doksycyklin; bp = basepar; WT = villtype; KO = knockout. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Prostatakreftceller slettet for mir-891a ved hjelp av CRISPR-genredigering som viser undertrykt proliferasjon. (A) Design av PCR-primere (lilla) og de to 5 'og to 3' guide RNA (oransje) rettet mot genomiske sekvenser som flankerer mir-891a-genet (grønt). (B) PCR-genotyping av transfiserte LNCaP-celler med indikerte 5 'og 3' guide RNA bekreftet at Δmir-891a-delesjoner ble oppnådd for alle fire guide RNA-kombinasjoner. Cellelysater ble laget av blandingscellepopulasjoner 48 timer etter transfeksjon. (C) PCR-fragmenter ble sekvensert og validert. Et representativt eksempel viser DNA-sekvensen av transfiserte celler behandlet med 5A (891a) og 3B (891a) guide RNA, noe som resulterer i det forutsagte Cas9-spaltningsstedet (3 nt oppstrømspam-området) og CRISPR Δ mir-891a-sletting. (D) Enkeltcellekolonier ble oppnådd og PCR-genotypet. KlonE L14 G9 ble sekvensvalidert som ko og klon L14 G9 som WT for mir-891a genet . (E) miR-891a ble tidligere vist å indusere cellevekst av prostatakreft, og derfor ble miR-891a-tap spådd å ha den gjensidige fenotypen. WST-1-analyser av prostatakreftceller slettet for mir-891a (L14 G9 [KO], blå) viste undertrykt proliferasjon sammenlignet med WT-celler (L14 G9 [WT], rød). Forkortelser: CRISPR = gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner; Cas9 = CRISPR-assosiert endonuklease; WT = villtype; KO = knockout; WST-1 = vannløselig tetrazoliumsalt-1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

PCR-reaksjon er satt opp på is.
Komponent 25 μL reaksjon Endelig konsentrasjon
5x DNA polymerase Buffer 5 μL 1x
Fremre PCR-primer (10 μM) 0,5 μL 0,2 μM
Omvendt PCR-primer (10 μM) 0,5 μL 0,2 μM
10 mM dNTPs 0,5 μL 200 μM
DNA-polymerase (2 U/μL) 0,25 μL 0,125 U/ 25 μL
Råcellelysat 1 - 4 μL variabel
Nukleasefritt vann opptil 25 μL
Termosyklerbetingelser for PCR-reaksjon:
Skritt Temperatur Tid
Innledende denaturering 98 °C 3 min
98 °C 10 s
35 sykluser 62 °C 15 s
72 °C 15 s
Endelig forlengelse 72 °C 10 min
Holde 4 °C

Tabell 1: PCR-reaksjonsbetingelser for rålysatgenotyping. Forkortelse: dNTP = deoksynukleotider.

CRISPR-målrettet slettingsside Guide RNA Kombinasjon Villtype (bp) Knockout (bp) PCR-primerpar
∆full klynge 5A(891a)+3A(892c)
5B(891a)+3A(892c)
5A(891a)+3B(892c)
5B(891a)+3B(892c)		 35,664 389
496
378
485		 891a FWD
892c REV
∆892c/890/888 5A'(888)+3A(892c)
5B'(888)+3A(892c)
5A'(888)+3B(892c)
5B'(888)+3B(892c)		 2,739 478
487
467
476		 888 FWD
892c REV
∆892c/890 3A'(888)+3A(892c)
3B'(888)+3A(892c)
3A'(888)+3B(892c)
3B'(888)+3B(892c)		 2,739 710
754
699
743		 888 FWD
892c REV
∆892b/892a 5A'(888)+5A(892b)
5B'(888)+5A(892b)
5A'(888)+5B(892b)
5B'(888)+5B(892b)		 2,938 554
547
573
566		 892b fallodd
888 REV
∆892b/892a/888 5A(892b)+3A'(888)
5A(892b)+3B'(888)
5B(892b)+3A'(888)		 2,938 322
278
341		 892b fallodd
888 REV
∆743 Familie 5A(892b)+3A(892c)
5B(892b)+3A(892c)
5A(892b)+3B(892c)
5B(892b)+3B(892c)		 5,015 370
389
359
378		 892b fallodd
892c REV
∆891 Familie 5A(891a)+3A(891b)
5B(891a)+3A(891b)		 27,294 330
270		 891a FWD
891b REV
∆891a 5A(891a)+3A(891a)
5A(891a)+3B(891a)
5B(891a)+3A(891a)
5B(891a)+3B(891a)		 554 333
273
454
394		 891a FWD
891a REV

Tabell 2: CRISPR guide RNA brukes til å generere miR-888 cluster knockout kombinasjoner. Forkortelser: CRISPR = gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner; bp = basepar; FWD = fremover; REV = omvendt.

Grunning Sekvens Tm (°C)
888 FWD AGGCATCCTCAAGATAAGAG 52.2
888 REV CTGGATGATGGCCAAGACAAG 55.9
891a FWD TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA 53.9
891a REV TTCATCTTGCTGCTACCTGTC 54.8
891b REV TCATCTTGCTGCTATACGTCCT 55.6
892b fallodd GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA 53.5
892b REV CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC 53.5
892c FWD TGTGAGCACCTACAGGTTAG 53.9
892c REV KAKKTAKTTGGCTTCATG 53.5

Tabell 3: PCR-primere brukt til genotyping. Forkortelser: FWD = fremover; REV = omvendt; Tm = smeltetemperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne CRISPR-genredigeringsprosedyren lar etterforskeren raskt generere et helt panel av cellelinjer som bærer unike miRNA-klyngeslettingskombinasjoner. Transfeksjonen av syntetiske guide-RNA-er sammensatt av 5'- og 3'-genomiske stedsspesifikke crRNA-er annealed med syntetisk tracrRNA (1: 1 molarforhold) i denne protokollen unngår tidkrevende plasmidvektorunderkloning og muliggjør en mer fleksibel og høy gjennomstrømnings eksperimentell design ved bruk av et 24-brønns format. Genereringen av cellelinjer som bærer en DOX-induserbar Cas9 lentiviral kassett muliggjør tett DOX-regulert og robust Cas9-ekspresjon under celletransfeksjonen av førings-RNA og rask clearance av dette bakterieproteinet ved DOX-uttak fra kulturmediet i påfølgende trinn. Denne prosedyren er også avhengig av råcellelysater for PCR-genotyping, noe som krever minimalt cellemateriale for analyse og unngår bruk av kostbare og arbeidsintensive DNA-rensingsmetoder for silikakolonner eller behovet for å måle nukleinsyrekonsentrasjoner ved hjelp av et spektrofotometer, noe som ytterligere effektiviserer metodene for etterforskeren.

Faktisk viste de representative resultatene som ble delt her vellykket tilpasning av denne metoden for å transfektere humane prostatakreftcellelinjer med 32 unike guide RNA-kombinasjoner i et enkelt eksperiment og generere flere enkeltcellekoloni knockout-linjer som bærer slettinger for hele ~ 35 kb miR-888 klyngeregionen; mindre slettingskombinasjoner for miR-888-klyngemedlemmer som tilhører familiene miR-743 og miR-891a; samt slettinger for individuelle miRNA-medlemmer i miR-888-klyngen. Denne arbeidsflyten genererte en verdifull cellelinjeressurs for å begynne å molekylært dissekere miR-888-klyngenettverket i sammenheng med menneskelig prostata sykdom og bestemme hvordan miR-888-klyngemedlemmer funksjonelt overlapper eller samhandler synergistisk / antagonistisk med hverandre for å regulere vekst av prostatatumor, kreft aggressivitet og stoffresistens (som skal publiseres andre steder). Disse studiene vil være avgjørende da denne forskningen beveger seg mot diagnostiske og terapeutiske applikasjoner for behandling av pasienter med avanserte og metastatiske former for prostatakreft.

Det er flere kritiske trinn i denne CRISPR-genredigeringsprotokollen med høy gjennomstrømning som etterforskere bør nøye vurdere når de tilpasser denne metoden for å studere flere miRNA-klyngenettverk i andre sykdomskontekster. For det første er det viktigste trinnet i denne prosessen den nøye utformingen av guide-RNA-ene som flankerer miRNA-klyngen for CRISPR-medisinert fjerning, samt tilleggsveilednings-RNA-er for å slette individuelle miRNA-klynger eller kombinasjoner av miRNA-klyngemedlemmer. Etterforskeren bør nøye vurdere å ikke forstyrre de omkringliggende gener eller regulatoriske elementer, spesielt hvis miRNA-klyngen ligger i et gen intron eller ligger antisense til et annet gen. Det er CRISPR off-targeting prediksjonsressurser 24,25,26,27 tilgjengelig som kan hjelpe forskeren når han velger de mest diskriminerende crRNA oligonukleotidene å syntetisere. Denne arbeidsflyten beskriver utformingen av to 5 'og to 3' crRNAer som flankerer hvert målrettet miRNA-lokus som gjør det mulig å teste fire unike guide-RNA-kombinasjoner i CRISPR-transfeksjonstrinnet og øke sjansene for å generere ønsket knockout-cellelinje. Imidlertid trenger etterforskeren bare en av disse guide RNA-kombinasjonene for å lykkes med å forstyrre et bestemt miRNA-genlokus.

For det andre bør etterforskeren bestemme den mest hensiktsmessige metoden for å levere Cas9 til cellene for CRISPR-genredigering. Denne prosedyren brukte det DOX-induserbare Cas9 lentivirale ekspresjonssystemet, men alternative tilnærminger for Cas9-proteinproduksjon (f.eks. Cas9 rekombinant protein, Cas9 mRNA-levering eller bruk av konvensjonelle Cas9-ekspresjonsplasmidvektorsystemer) kan enkelt tilpasses for denne protokollen. For eksempel kan eksperimentelle hensyn diktere bruken av Cas9 forbigående uttrykk versus å generere stabile lentivirale uttrykkscellelinjer, promotoren som brukes til å drive Cas9 (allestedsnærværende, celletypespesifikk, induserbar) og inkorporering av positive / negative seleksjonssystemer for å sikre Cas9-ekspresjonsvektorlevering til cellene av interesse (dvs. antibiotikaresistens).

For det tredje er det viktig å raskt genotype blandede populasjonstransfiserte celler innen 48-72 timer etter guide RNA-levering i tilfelle tap av miRNA-klyngen kan påvirke cellens levedyktighet / vekst negativt. For eksempel, når man slettet tumorfremmende faktorer som miR-891a i prostatakreftcellelinjer, ble det bemerket at disse mir-891a knockout-cellene vokste langsommere enn ubehandlede celler, og deretter overtok villtypecellene raskt cellepopulasjonen. Til slutt er det avgjørende å integrere ytterligere valideringsmetoder for å sikre fjerning av miRNA-lokus under genotypisk screeningsprosess, spesielt for større genomiske delesjoner. Disse tiltakene inkluderer bruk av interne PCR-genotypingskontroller som bare oppdages hvis villtypeallelen er tilstede og utfører qRT-PCR-analyse på enkeltcellekolonier for å sikre at knockoutcellelinjer ikke uttrykker de målrettede miRNA-ene. Alle disse hensynene vil sikre vellykkede resultater for etterforskeren.

Det var noen åpenbare begrensninger som oppstod ved inkorporering av denne CRISPR-teknikken i laboratoriet. For eksempel, til tross for den høye gjennomstrømningen av guide RNA-transfeksjonstrinnene beskrevet i denne protokollen for raskt å generere flere miRNA-klyngeslettingskombinasjoner, var det hastighetsbegrensende trinnet i denne prosedyren genotypescreening og utvidelse av enkeltkolonicellelinjer for hver CRISPR-mediert miRNA-sletting. Inkorporering av positive seleksjonsstrategier i denne protokollen vil være en fordel; Det vil imidlertid fortsatt ta ~ 3-4 uker å utvide en linje fra en enkeltcellekoloni dyrket i et 96-brønns format. Faktisk vil samlingen av minst tre uavhengige enkeltkolonicellelinjer per miRNA-locus knockout pluss villtypeceller bidra til å sikre at fenotypene som analyseres ikke skyldes artefakt / off-targeting-effekter, men dette legger igjen til den tidkrevende naturen til denne prosedyren. Etterforskeren kan også trenge å utføre flere runder med CRISPR-genredigering for å oppnå homozygote nullcellelinjer. Dette er spesielt uttalt i studier som bruker etablerte immortaliserte kreftcellelinjer som ofte har et komplekst genomisk landskap av kromosomale omorganiseringer og unormale karyotyper.

For eksempel brukte denne representative studien LNCaP og PC3-avledede humane prostatakreftcellelinjer for å generere delesjoner for miR-888-klyngen, kartlegging på X-kromosomet. Det var viktig å erkjenne at disse mannlige avledede prostatakreftcellelinjene har unormale karyotyper og hadde to X-kromosomer (og PC3-celler har også delvise X-kromosomtranslokasjoner på andre autosomer)31,32. Til tross for disse forholdene var CRISPR-genredigering robust nok til å generere homozygote knockouts ved hjelp av disse prostatacellelinjene. Imidlertid kan det være tilfeller der en etterforskers cellelinje med en unormal karyotype (f.eks. Innsettinger, slettinger, inversjoner, dupliseringer) kan ha "usynlige mutasjoner" som vil skjule deteksjonen av andre (eller flere) kopier av det målrettede genlokuset på grunn av manglende elementer som kreves for vellykket deteksjon ved hjelp av de utformede PCR-primerne / guide-RNAene. Dette understreker viktigheten av å verifisere de homozygote null CRISPR-cellelinjene ved hjelp av uavhengige metoder (dvs. qRT-PCR, northern blot, WGS) før du utfører funksjonelle analyser. Til slutt er denne protokollen designet for å bare slå ut miRNA-klyngekombinasjoner som kartlegger ved siden av hverandre. Hvis en etterforsker ønsker å slå ut miRNA som er skilt mellom andre miRNA-gener, vil det være behov for flere runder med CRISPR-transfeksjoner, noe som krever forsiktig genotyping og validering.

Til tross for disse utfordringene er muligheten til raskt å generere et komplett panel av miRNA-slettingskombinasjoner for en gitt miRNA-klynge ved hjelp av denne beskrevne protokollen en stor fordel i forhold til de eksisterende metodene i miRNA-forskningsverktøykassen. Overekspresjonsstudier ved bruk av miRNA-etterligninger for å karakterisere ikke-kodende RNA-funksjon kan føre til utilsiktede artefakter eller celletoksisiteter. På samme måte kan bruk av antisense antimir oligonukleotidhemmere for å bestemme funksjonstapsfenotyper være vanskelig siden antimir vanligvis resulterer i en knockdown og ikke en fullstendig eliminering av miRNA-aktivitet. Forsøk på å bruke kombinasjoner av miRNA-etterligninger eller miRNA-antimirer for å belyse miRNA-klyngenettverkssignalering har vist seg arbeidskrevende og vanskelig å tolke. Derfor vil inkorporeringen av CRISPR-genredigeringsteknologi mot å undersøke hvordan miRNA-medlemmer samhandler innenfor en gitt ikke-kodende genomisk klynge, gjøre det mulig for forskere å få en klarere forståelse av hvordan ikke-kodende RNA påvirker sykdomssignalveier og lover å ha store implikasjoner i diagnostiske og narkotikaoppdagelsesfelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

PC3-ML cellelinjer ble vennlig levert av Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey hjalp til med PCR-genotyping. Dette arbeidet ble støttet av et Breedan Adams Foundation Grant, et Ryan Translational Research Fund og et Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20) til AE-K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap Fisher 14-230-225 Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Seal-Rite 1615-5500 Plasticware
24-well tissue culture plate Corning Costar  09761146 Plasticware
5x Phusion HF Buffer Thermo Scientific F-518L PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate Fisher FB012927 Plasticware
96-well tissue culture plate Falcon 08-772-2C Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal AbCam ab191468 Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062 Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine National Center for Biotechnology Information NA Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes Calbiochem CAS 589205 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter Invitrogen A50298 Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes Thermo Scientific 50001012 Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool Horizon Discovery Ltd. NA Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 Dharmacon, Inc. T-2002-02 Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher  BP231100 Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10013CV Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution Sigma-Aldrich D3072-1ML CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed Dharmacon, Inc. U-002005-20 CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		 Dharmacon, Inc. crRNA-460XXX CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL Dharmacon, Inc. VCAS11227 CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer Ensembl NA Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal Santa Cruz Biotechnology sc25778 Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit IBI Scientific IB47010 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified Gibco 16000044 Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide MilliporeSigma H9268 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane MilliporeSigma IPFL10100 Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer LI-COR 927-60001 Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 926-68070 Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 926-32211 Western blot reagent
Microcentrifuge Eppendorf  5425 R Plasticware
miRBase microRNA viewer miRBase NA Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well Invitrogen NP0321BOX Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System LI-COR CLx Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System Owl D2-BP Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) Integrated DNA Technology NA PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Scientific F530S PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x MilliporeSigma 20-188 Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade Invitrogen 25530049 PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) Thermo Scientific EN0531 PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium Gibco MT10041CV Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer Snap Gene NA Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12563029 Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler ThermoFisher Scientific 4375305 Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System Invitrogen EI0001 Equipment; Protein gel electrophoresis system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com). , Available from: https://www.snapgene.com (2022).
  20. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI). , Available from: https://www.ensembl.org (2022).
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory). , Available from: https://www.mirbase.org (2022).
  23. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon). , Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022).
  24. Tools for Guide Design and Off-Target Prediction (MIT CRISPR Design Tool from the Zhang Lab). , Available from: http://crispr.mit.edu (2022).
  25. Sangsu Bae, J. P., Kim, J. -S. Cas-OFFinder (from Sangsu Bae, Jeongbin Park, Jin-Soo Kim). , Available from: http://www.rgenome.net/cas-offinder/ (2022).
  26. Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center). , Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022).
  27. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  28. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents. , Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022).
  29. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  30. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  31. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  32. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Tags

Biologi utgave 182 CRISPR induserbar Cas9 microRNA knockout miR-888 cluster
CRISPR-genredigeringsverktøy for analyse av mikroRNA-klyngenettverk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, C., Quan, L., Yi, G.,… More

Chambers, C., Quan, L., Yi, G., Esquela-Kerscher, A. CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63704, doi:10.3791/63704 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter