Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı

Published: April 25, 2022 doi: 10.3791/63704
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

Summary

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Abstract

MikroRNA'lar (miRNA'lar) kanser ve metastazın önemli hücresel düzenleyicileri (tümör baskılayıcılar, pro-onkojenik faktörler) olarak ortaya çıkmıştır. Yayınlanan çalışmaların çoğu, küçük RNA'ların kanserdeki rolünü karakterize ederken tek bir miRNA'ya odaklanmaktadır. Bununla birlikte, insan miRNA genlerinin ~% 30'u, genellikle birlikte eksprese edilen kümelenmiş birimlerde düzenlenmiştir, bu da karmaşık ve koordineli bir kodlamayan RNA düzenleme sistemini gösterir. Kodlanmamış küçük RNA'ları kliniğe çevirmeden önce kümelenmiş miRNA ağlarının tümör büyümesini, kanser saldırganlığını ve ilaç direncini düzenlemek için işbirliği içinde nasıl çalıştığının daha net bir şekilde belirtilmesi gerekir.

Prostat kanseri bağlamında ~ 35.000 bp uzunluğunda bir lokus içinde bulunan yedi miRNA geninden oluşan genomik bir kümenin onkojenik rolünü incelemek için düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) aracılı gen düzenleme prosedürünün kullanılması, yüksek verimli bir kümelenmiş olarak kullanılmıştır. Bu yaklaşım için, insan kanseri hücre hatları, DOX içeren ortamda 48 saat boyunca yetiştirilen doksisiklin (DOX) ile indüklenebilir Cas9 nükleaz için bir lentivirüs vektörü ile enfekte edildi. Hücreler daha sonra, tüm miRNA kümesi delesyonunu ve bireysel veya kombinasyon miRNA gen kümesi delesyonlarını tek bir deneyde taşıyan kanser hücresi hatlarının hızlı bir şekilde üretilmesine izin vermek için genomik bölgeye özgü CRISPR RNA (crRNA) oligonükleotidleri ile komplekslenmiş sentetik trans-aktive edici CRISPR RNA (tracrRNA) ile birlikte transfekte edildi.

Bu yüksek verimli gen düzenleme sisteminin avantajları, zaman alıcı DNA vektör alt klonlamasından kaçınma yeteneği, 24 kuyucuklu bir formatta benzersiz kılavuz RNA kombinasyonları ile hücreleri transfekte etme esnekliği ve ham hücre lizatları kullanarak daha düşük maliyetli PCR genotiplemesidir. Bu kolaylaştırılmış yaklaşımı kullanan çalışmalar, insan hastalığında yer alan karmaşık küçük kodlamayan RNA ağlarının karakterize edilmesine yardımcı olacak ve gelecekteki terapötik tasarımı daha iyi bilgilendirecek olan miRNA kümesi üyeleri arasındaki fonksiyonel fazlalıkları ve sinerjik / antagonistik etkileşimleri ortaya çıkarmayı vaat etmektedir.

Introduction

Kodlamayan RNA'ların insan hastalığına katkısını araştırmak için daha iyi araştırma araçlarına ihtiyaç vardır. MiRNA disregülasyonu, kanser gibi insan bozukluklarında, kanser hastalarının dokularındaki ve vücut sıvılarındaki (örneğin, kan, idrar) bu küçük kodlamayan RNA'ların ekspresyon profillerini kanser olmayanlara, sağlıklı bireylere, mikrodizilerin kullanılmasına, kantitatif gerçek zamanlı PCR'ye (qRT-PCR) ve yeni nesil derin dizileme teknolojilerine karşı karşılaştırırken sıklıkla gözlenir 1,2 . Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu miRNA'ların büyük bir alt kümesini, tümör oluşumunu, hastalık progresyonunu ve ilaç direncini kontrol eden tümör baskılayıcı, onkojenik ve metastaz faktörleri olarak karakterize etmiştir. MiRNA'ların deneysel aşırı ekspresyonu ve / veya downregülasyon / kaybı, hücrede fonksiyonel ve pleiotropik sonuçlara neden olur ve bu kodlamayan RNA'ların koordine ettiği kanserle ilişkili çok çeşitli aktiviteleri yansıtır - büyüme, apoptoz, farklılaşma, kromatin yeniden şekillenmesi, anjiyogenez, mezenkimal epitel (EMT) ve MET geçişleri, metabolizma ve immün yanıt3.

MiRNA'lar tek genler olarak kodlanır veya çekirdekte transkribe edilen ve sitoplazmada lokalize olan biyolojik olarak olgunlaşmış, tek sarmallı ~ 22 nükleotid (nt) miRNA türlerini üretmeden önce kapsamlı bir şekilde işlenen genomik kümelerde bulunur4. Bu küçük RNA'lar etkilerini transkripsiyon sonrası uygularlar ve katalitik RNA kaynaklı susturma kompleksini (RISC) mRNA bölgesine getirmek için mesajcı RNA (mRNA) hedeflerine bağlanan negatif gen düzenleyicileri olarak hareket ederler, bu da mRNA bozulmasına ve / veya protein translasyonunda bir bloğa neden olur. MiRNA'lar, hayvan sistemlerinde kodlamayan RNA'ların son derece bol bir sınıfıdır ve insan genomunda 2.654 olgun miRNA bulunur (miRBaz salınımı 22.1)5. MiRNA'lar tipik olarak mRNA hedeflerine eksik tamamlayıcılık ile ilişkilidir4. Bu nedenle, tek bir miRNA onlarca ila yüzlerce farklı mRNA hedefini düzenleyebilir ve işlevsel olarak çok çeşitli biyolojik yolları etkileyebilir. MiRNA tabanlı mekanizmaların karmaşıklığına katkıda bulunmak için, tek bir mRNA çoklu, farklı miRNA'lar tarafından düzenlenebilir. Bu nedenle, miRNA disregülasyonunun vücudun homeostatik dengesini nasıl bozduğunu ve insan malignitesine nasıl yol açtığını araştırmak zordur.

Yayınlanan çalışmaların çoğu, hastalık olaylarındaki rollerini karakterize ederken tek bir miRNA'ya odaklanmıştır. Bununla birlikte, insan miRNA genlerinin ~% 30'u, genellikle aynı yönde transkripte edilen ve birlikte eksprese edilen, kodlanmamış RNA regülasyonunun koordineli ve karmaşık bir sistemini gösteren kümelenmiş birimler (tipik olarak ~ 10 kilobaz [kb]) halinde organize edilmiştir6. En büyük polisistronik insan miRNA kümesi, 54 miRNA öncülünden oluşan 14q32 kümesidir. İnsan kanserleri ile ilişkili en iyi çalışılmış kümelenmiş miRNA birimlerinden biri, kodlamayan RNA, c13orf25'in intron 3'ünde bulunan miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 ve miR-92-1'den oluşan miR-17-92 polisistronik kümesidir. MiR-17-92 kümesi hematopoetik malignitelerde sıklıkla çoğalır ve solid tümörlerde aşırı eksprese edilir ve hücre döngüsü progresyonunu, apoptozu ve anjiyogenezi teşvik etmede onkojenik roller oluşturmuştur7. Ek olarak, kodlamayan gen Leu2'nin intronunda bulunan tümör baskılayıcı miR-15a ve miR-16-1 kümesi genellikle lösemilerde silinir ve antiapoptotik gen BCL2'yi ve ek hücre döngüsü ilerleme genleri8'i hedefleyerek tümör büyümesini bloke etmek için işlev gören çok çeşitli kanserlerde aşağı regüle edilir. Yüksek dereceli prostat kanseri olan hastalarda miR-888 kümesi yükselir ve insan kromozomu Xq27.3 9,10 üzerinde bulunan yedi miRNA geninden (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b ve -891a) oluşur.

MiR-888 kümesi, HPCX1 lokusu (Kalıtsal Prostat Kanseri, X'e bağlı 1) içinde, kalıtsal prostat kanseri ailesi soyağacı 11,12,13,14,15,29'un bağlantı analizi ile tanımlanan Xq27-2'yi kapsayan haritalardır. Geleneksel miRNA yanlış ekspresyon araçları (miRNA taklitleri ve antisens inhibitörleri) kullanılarak bireysel miR-888 kümelenmiş üyelerinin fonksiyonel karakterizasyonu, bu miRNA'ların prostat tümörü büyümesini ve invazyonunu düzenlemede örtüşen roller oynadığını göstermiştir 9,10. Bununla birlikte, bu deneysel yöntemler, çoklu miR-888 kümelenmiş üyelerinin, doku homeostazını ve kanser ilerlemesini kontrol etmek için kodlamayan bir RNA ağında sinerjik veya antagonistik olarak nasıl hareket ettiğini incelemek için kendilerini kolayca ödünç vermez. Yüksek verimli CRISPR gen düzenleme teknolojisini kullanan bu tarif edilen kolaylaştırılmış protokol, bu bilgi boşluğunu kapatmak için insan kanserleriyle ilişkili miRNA kümelerini (örneğin, miR-888 kümesi) moleküler olarak diseke etmek için modifiye edilmiştir.

Bakteriyel CRISPR ve CRISPR ile ilişkili (cas) genler, bakteriyofajlara karşı adaptif bağışıklığa aracılık eder16. Bu eski prokaryotik gözetim sisteminin keşfi, istenen herhangi bir genomik lokusu kolayca hedeflemek ve hem in vitro hem de in vivo16,17 çok çeşitli hayvan sistemleri ve hücre tipleri içinde DNA dizisi değişiklikleri yapmak için etkili bir bilimsel araç olarak hızla uyarlandı. Bu teknik, insan hastalığı bağlamında miRNA ağlarını sorgulamak için etkili bir yöntem olarak büyük umut vaat ediyor. Bu amaçla, ölümsüzleştirilmiş insan prostat kanseri hücre hatlarında (LNCaP, PC3-ML) insan kromozomu X üzerinde ~ 35 kb'yi kapsayan miR-888 kümesini incelemek için bu yüksek verimli CRISPR gen düzenleme protokolü, küme üyelerinin kanser ilerleme yollarını nasıl koordine ettiğini sorgulamak için inşa edilmiştir. Bu yaklaşım, herhangi bir miRNA kümesini karakterize etmek için uygulanabilir ve araştırmacıların tüm miRNA kümesi delesyonunu ve bireysel ve kombinasyon miRNA gen kümesi delesyonlarını tek bir deneyde taşıyan insan hücre hatlarını hızla üretmelerini sağlar.

Bu prosedürde, araştırmacının Streptococcus pyogenes CRISPR ile ilişkili endonükleaz Cas9 (csn1) gen ekspresyonunu kurucu DOX ile indüklenebilir promotör TRE3G aracılığıyla kontrol etmesini sağlayan bir doksisiklin (DOX) ile indüklenebilir lentiviral ekspresyon sistemi taşıyan stabil hücre hatları kurulur. Tet-On 3G iki parçalı sistemi, hem Tet-On 3G geninin hem de blastistronic direnç geninin (BlastR) transkripsiyonunu sağlamak için kurucu bir insan uzama faktörü 1 alfa (hEF1alfa) promotörünü içerir. Tet-On 3G transaktivatör proteini sadece DOX varlığında TRE3G promotörüne bağlanır ve sağlam Cas9 transkripsiyonu ile sonuçlanır. DOX'un yokluğunda, bazal Cas9 ifadesi yoktur veya çok azdır. Bu nedenle, araştırmacı, CRISPR gen düzenleme adımları sırasında DOX ile desteklenmiş ortamda yetiştirilen hücrelerde yüksek Cas9 protein üretimini indükleyebilir ve DOX çekilmesi üzerine hızlı CAS9 protein klirensini kontrol edebilir.

Bu protokol aynı zamanda tüm miRNA kümesini çevreleyen bölgeleri, bireysel miRNA saç tokası (premiRNA) bölgelerini ve / veya küme içindeki miRNA genlerinin alt kümelerini hedefleyen sentetik CRISPR RNA (crRNA) oligonükleotidlerinin tasarımını da tanımlar. Tasarlanan her crRNA, benzersiz bir 5'-terminal 20 nt kılavuz dizisi (hedeflenecek genomik ilgi dizisinin tamamlayıcısı), ardından evrensel trans-aktive edici CRISPR RNA (tracrRNA) oligonükleotidleri18 ile baz eşleşmesini sağlayan değişmez bir 22 nt S. pyogenes tekrar dizisi (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') içerir. Birlikte, tavlanmış crRNA ve tracrRNA (karışık 1: 1 oranı) bu protokol için kılavuz RNA olarak işlev görür (Şekil 1A). Her deneyde, iki sentetik kılavuz RNA, bakteriyel Cas9 proteinini, çıkarılması hedeflenen miRNA küme bölgesini çevreleyen genomik DNA bölgelerine (5' ve 3') ilişkilendirmek ve eşlik etmek için DOX ile indüklenen hücrelere dönüştürülür (Şekil 1B).

Hücre genomunda bir protospacer bitişik motif (PAM) dizisi (vahşi tip S. pyogenes Cas9 için 5'-NGG-3') bulunmalı ve kılavuz RNA17 tarafından hedeflenen 20 nt DNA dizisinin hemen bitişiğinde bulunmalıdır. PAM dizisi bağlayıcı bir sinyal görevi görür ve endonükleaz Cas9 enziminin katalitik bölgesini hedeflenen genomik DNA bölgesine konumlandırır, daha sonra PAM'ın ~ 3 nt yukarı yönünde bulunan yönlendirilmiş, çift sarmallı (ds) DNA bölünmesine yol açar. Hücrenin DNA onarım makinesi, parçalanmış DNA uçlarını onarır, bu da mükemmel ligasyonla sonuçlanabilir, ancak genellikle homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) meydana gelir ve onarım bölgesinde küçük eklemelere veya silmelere (indels) neden olur. MiRNA'lar genellikle intergenik ve intronik bölgelerde bulunan kodlamayan genler olduğundan, bu indeller istenmeyen saçmalık / yanlış mutasyonlar yaratma riski düşüktür.

Bu deneylerde kılavuz RNA kompleksi için sentetik RNA oligonükleotidleri (tavlanmış crRNA ve tracrRNA, 1: 1 molar oran) kodlayarak, bu gen nakavt stratejisi, zaman alıcı DNA vektör alt klonlamasını önler ve benzersiz kılavuz RNA kombinasyonlarını hücrelere 24 kuyucuklu bir formatta transfekte etmede büyük esneklik sağlar. PCR genotip taraması için ham hücre lizatlarının hazırlanması, pahalı ve zaman alıcı DNA saflaştırma yöntemlerinden de kaçınırken, kolaylaştırılmış tek koloni hücre hattı üretimi ve fenotipik analize izin verir. Gerçekten de, bu yüksek verimli CRISPR gen düzenleme protokolü, kültürlenmiş prostat kanseri hücre hatlarını (LNCaP, PC3-ML) tek bir deneyde 32 benzersiz kılavuz RNA kombinasyonu ile transfekte etmek ve tüm ~ 35 kb miR-888 küme bölgesi için delesyon taşıyan nakavt hatları üretmek için başarıyla kullanılmıştır; miR-743 ve miR-891a ailelerine ait miR-888 küme üyeleri için daha küçük delesyon kombinasyonları; miR-888 kümesi içindeki bireysel miRNA üyeleri için delesyonların yanı sıra. Bunun gibi çalışmalar, kümelenmiş miRNA'ların, miRNA'ları kliniğe terapötik ve tanısal araçlar olarak çevirmeden önce tümör büyümesini, saldırganlığını ve ilaç direncini düzenlemek için işbirliği içinde nasıl işlev gördüğünün daha net bir şekilde belirtilmesini sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. CRISPR gen düzenlemesi için hazırlık ve miRNA kümesi nakavt hücre hatları oluşturmak için kılavuz RNA tasarımı

  1. Bir DNA dizisi ek açıklama yazılımı programı19 kullanarak, ilgilenilen miRNA küme bölgesinin (intergenik, intronik) ve çevredeki genomik bölgelerin en az 1 kB'sinin tam genomik dizisini içeren bir DNA dosyası oluşturun.
    1. Hedeflenen miRNA kümesi lokusunu (intergenik, intronik) ve miRNA kümesine ait her bir miRNA saç tokası dizisini işaretlemek ve ayrıca yakındaki diğer kodlama ve kodlamayan genleri ve / veya düzenleyici özellikleri belirtmek için oluşturulan DNA dosyasında bir özellik düzenleme aracı kullanın 5,20,21,22.
    2. Delesyon için hedeflenen miRNA bölgelerinin, yakındaki protein kodlayan genleri, kodlamayan genleri veya önemli düzenleyici DNA elementlerini yanlışlıkla bozmadığından emin olun.
      NOT: Bu protokolde kullanılan hücre hattının genomik karmaşıklığını (örneğin, kromozom duplikasyonları / füzyonları) göz önünde bulundurun.
  2. Tüm miRNA kümesini, bireysel miRNA saç tokası (pre-miRNA) bölgelerini ve / veya küme içindeki miRNA genlerinin alt kümelerini çevreleyen 20 nt genomik DNA dizisini hedefleyen sentetik crRNA'ları, biyoinformatik kılavuz RNA tasarım yazılımı aracını kullanarak tasarlayın (örneğin;23). Uygun Cas9 enziminin kılavuz RNA tasarım aracında belirtildiğinden emin olun (örneğin, S. pyogenes Cas9).
    NOT: Sentezlenen crRNA, bu benzersiz 5'-terminal 20 nt kılavuz dizisini (DNA hedefine tamamlayıcı) ve ardından bir değişmez 22 nt içerecektir. S. pyogenes sentezlenmiş evrensel tracrRNA oligonükleotid ile baz eşleşmesine izin vermek için tekrar sekansı. Birlikte tavlandıklarında, bu protokolde kılavuz RNA olarak işlev görecekler.
    1. Oluşturulan DNA dosyasına atıfta bulunarak (Adım 1.1.), biyoinformatik kılavuz RNA tasarım yazılımı aracı 23'e silinmek üzere hedeflenen miRNA saç tokası / küme lokusunun hemen yukarı akımında (5') veya aşağı akışında (3') bulunan ~ 150 nt DNA dizisini girin.
      NOT: Tasarım aracı, PAM dizisine (hedeflenmemiş DNA ipliği üzerinde) hemen bitişik olarak bulunan crRNA oligonükleotid tasarımı için benzersiz 20 nt'lik dizileri tanımlayacaktır (örneğin, S. pyogenes Cas9 PAM dizisi NGG). Aşağıda verilen bir crRNA tasarım örneği, mir-891a gen lokusunun hemen yukarı akışını (5') hedefleyen bir bölgeyi (özellikle temsili sonuçlar bölümünde ve Tablo 1'de tartışılan 5A (891a) 'dir.
      1. RNA tasarım yazılımı aracı23 kılavuzunu açın.
      2. Adı Gir penceresine 5A(891a) adını girin .
      3. Bir DNA dizisi girin penceresinde, mir-891a öncü geninin hemen yukarı akımında (5') bulunan 150 nt genomik dizi girin:5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
        TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTCTTTTTTTTTTTGTTTTTTTAGGTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. Program tarafından hesaplamalı olarak algılanan hedefleme dışı siteleri hariç tutmak için Özgüllük Denetimini Etkinleştir işaretli kutuyu işaretleyin. Uygun organizmayı seçin (yani, İnsan [Homo sapiens]).
      5. Çalışmalar için kullanılan doğru Cas9 enzimi PAM'ı belirtin, bu durumda, Streptococcus pyogenes Cas9-PAM: NGG, aşağıdaki varsayılan ayarları oluşturmak için: Hedefe göre PAM: Sonra; Tekrarlama Sekansı: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; Kılavuza göre: 3; Hedef dizi uzunluğu: 20; Hedef 5' başlangıcına göre kesinti: Sense 17 Anti-sense 17.
      6. Sentetik crRNA sentezi sonuçlarını görüntülemek için İleri düğmesine tıklayın.
        NOT: Bu örnekte, sentezlenecek önerilen crRNA, DNA hedefi ATACATGCTGATAGTTACAC'ı tanıyacak ve PAM:AGG'ye bitişik olarak yerleştirilecektir.
    2. Silinecek miRNA lokusuna en yakın bulunan ve amaçlanan genomik hedef için en yüksek özgüllüğe sahip en iyi aday crRNA 20 nt hedef dizilerini belirlemek için DNA dosyasına (Adım 1.1'de oluşturulan) başvurun.
      1. Aday crRNA spesifikliğini değerlendirmek ve hedeflenen miRNA kümesi bölgesi ile ilgisi olmayan genomik lokuslardaki potansiyel hedefleme dışı bölgeleri tahmin etmek için hesaplamalı hedefleme dışı analiz araçlarını kullanın (örneğin, 24,25,26,27).
      2. Tek kolonili CRISPR klonal hücre hatlarını PCR ile genotiplendirirken daha sonra başvurmak üzere potansiyel hedefleme dışı sonuçları kaydedin (Adım 4.2.6.).
        NOT: Tasarlanan crRNA oligonükleotid ile genomik hedef dizisi arasında paylaşılan dizi tamamlayıcılığının derecesi, Cas9 enziminin genomu bu lokusta ne kadar seçici bir şekilde böldüğünü belirleyecektir. Kılavuz RNA, genomik hedefe 3' ila 5' yönde tavlandığından, DNA hedef dizisinin 5' ucundaki uyumsuzluklar (ilk 8-10 baz) genellikle Cas9 aracılı bölünmeyi bloke edecektir. Genomik hedef dizi, DNA dizisinin ilk sekiz baz dışında, homolojiyi başka bir genomik lokusla paylaşıyorsa, bu kılavuz RNA'nın bu bölgede hedefleme dışı kalma şansının düşük olduğu tahmin edilmektedir.
      3. Hedeflenen her miRNA lokusu için dört benzersiz crRNA tasarlayın: miRNA saç tokası / kümesinin (5'A, 5'B) hemen 5' 'ini tamamlayıcı DNA dizilerini hedeflemek için iki tasarlanmış crRNA ve miRNA saç tokası / kümesinin (3'A, 3'B) hemen 3' 'ünü tamamlayıcı DNA dizilerini hedeflemek için iki tasarlanmış crRNA.
        NOT: CRISPR transfeksiyonları gerçekleştirilirken (Bölüm 3'te), tek bir deneyde başarılı miRNA lokus delesyonları üretme olasılığını artırmak için hedeflenen her miRNA lokusu için dört olası 5' ve 3' kılavuz RNA çifti kombinasyonu (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'B) test edilecektir.
      4. Sentezlenecek her bir crRNA için DNA hedef dizisini (bitişik PAM ile) işaretlemek için oluşturulan DNA dosyasında (Adım 1.1.) bir özellik düzenleme aracı kullanın.
  3. CRISPR hücre çizgilerini genotiplemek için hedeflenen miRNA küme bölgelerini çevreleyen PCR primerlerini (ileri, geri) tasarlayın ve sentezleyin (ve oluşturulan DNA dosyasındaki primerleri etiketleyin).
    1. Yakından kümelenmiş veya bireysel miRNA'lar için küçük genomik delesyonlar taşıyan genotipleme hücre hatları için, Cas9 bölünme bölgesi / nakavt bölgesinin her iki tarafında yaklaşık 150 bp bulunan PCR primerlerini (ileri, geri) tasarlayın, bu da jel elektroforezi yoluyla tek bir PCR reaksiyonunda hem vahşi tip (~ 600 bp) hem de nakavt (~ 300 bp) DNA fragmanlarının tespit edilmesini sağlayacaktır.
    2. MiRNA öncü kombinasyonları veya tüm miRNA kümesi için büyük genomik delesyonlar taşıyan genotipleme hücre hatları için, yine Cas9 bölünme / nakavt bölgesinin her iki tarafında yaklaşık 150 bp bulunan PCR primerlerini (ileri, geri) tasarlayın. Hedeflenen miRNA kümesi delesyonunun >4 kb uzunluğunda olması durumunda, PCR reaksiyonunun muhtemelen yalnızca daha küçük (~ 300 bp) nakavt DNA fragmanını tespit edeceğini, ancak vahşi tip DNA fragmanını tespit etmeyeceğini unutmayın. Bu nedenle, tarama sürecine yardımcı olmak ve homozigot nakavt hücre hatlarını doğrulamak için dahili miRNA küme genlerinin varlığını veya yokluğunu tespit edebilen ek PCR primerleri (ileri, geri) tasarlayın.

2. DOX ile indüklenebilir Cas9 ekspresyon kasetini taşıyan stabil lentiviral hücre hatlarının oluşturulması

NOT: Tüm hücre kültürü ve virüs çalışmalarını BSL2 prosedürleri ve aseptik tekniği kullanarak sertifikalı bir biyogüvenlik başlığında gerçekleştirin.

  1. CRISPR çalışmaları ve tercih edilen büyüme ortamları için uygun hücre hattı tipini belirleyin.
    NOT: Bu protokol, insan prostat kanseri hücre hatları LNCaP (tercih edilen ortam: RPMI,% 10 fetal sığır serumu [FBS]) ve PC3-ML (tercih edilen ortam: DMEM,% 10 FBS) için geliştirilmiştir.
  2. Blascidin direnç gen kasetini taşıyan lentivirüs ile enfekte olmuş hücreler için seçilecek en uygun ilaç konsantrasyonunu belirlemek için bir blasticidin "ölüm" eğrisi uygulayın (Adım 2.3.).
    1. Plaka hücreleri, 24 delikli bir plakanın 11 kuyucuğuna dönüşür ve 37 ° C'de, tercih edilen ortamda% 5 CO2'de yaklaşık% 75 birleşene kadar büyür.
    2. Blasticidin'i (çalışma stoğu 1 mg / mL) tercih edilen ortamda 0, 1, ila 10 μg / mL arasında değişen bir son konsantrasyonla seyreltin ve 1 μg / mL'lik artışlarla seyreltin.
    3. Tohumlanmış 24 kuyucuklu plakanın kuyularını 1'den 11'e kadar etiketleyin. Büyüme ortamını kuyucuklardan çıkarın ve uygun blastisidin konsantrasyonları ile değiştirin.
    4. Ortamı 7-10 gün boyunca her gün uygun blastisidin konsantrasyonları ile değiştirin.
    5. Zaman boyunca hücreleri günlük olarak inceleyin ve 5-7 gün içinde tüm hücreleri öldürmek için gereken minimum blastisidin konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: CRISPR gen düzenleme deneyleri için kullanılan her bir spesifik hücre hattı için bir blasticidin "öldürme" eğrisinin yapılması gerekecektir.
  3. DOX ile indüklenebilir Cas9 ekspresyon kasetini taşıyan hücreleri lentivirüs ile enfekte edin ve Adım 2.2'de belirlenen optimum konsantrasyonu kullanarak blastisidin seçimi yapın.
    1. 6 kuyucuklu bir plakanın üç kuyusunda, kuyu başına 5 × 104 hücre tohumu ve 37 ° C'de tercih edilen ortamda, gece boyunca% 5 CO2 (AÇIK) büyür.
    2. Ertesi gün, buz üzerinde DOX ile indüklenebilir Cas9 (Lenti-iCas9) için lentivirüs ekspresyon vektörünü çözün. Yavaşça karıştırın (virüs parçacıklarını vortekse etmeyin).
      NOT: Viral titreleri ve enfeksiyon verimliliğini azaltacak çoklu donma/çözülme döngülerinden kaçınmak için lentivirüsü -80 °C'de alikotlarda saklayın.
    3. Viral titre konsantrasyonuna bağlı olarak 5 × 104 hücreyi virüslü 0.3 (MOI = 0.3) enfeksiyon çokluğunda dönüştürmek için gereken hacmi hesaplayın.
    4. Pipet uygun virüs hacmini 250 μL'ye (kuyucuk başına) serumsuz ve antibiyotik içermeyen tercih edilen ortama 0.8 μg / mL hekzadimetrin bromür ile desteklenir. Yavaşça karıştırın.
      NOT: Hekzadimetrin bromür, viral adsorpsiyonu ve enfeksiyon etkinliğini arttırdığı tespit edilen katyonik bir polimerdir.
    5. Ortamı çıkarın. Lenti-iCas9 virüsü (MOI = 0.3) ile hazırlanan 250 μL'lik transdüksiyon ortamını hücrelere ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de AÇIK inkübe edin. (Hücreler virüsle ilişkili toksik etkiler gösteriyorsa kuluçka süresini 4-6 saate kadar kısaltın.)
    6. Ortamı taze tercih edilen ortamla değiştirin ve hücrelerin 1-2 gün boyunca iyileşmesine izin verin.
    7. Adım 2.2'de açıklanan "öldürme" eğrisinden türetilen optimal blastisidin konsantrasyonunu kullanarak enfekte olmuş hücreler üzerinde 10-14 gün boyunca blastisidin seçimi yapın.
      1. Paralel olarak, enfekte olmamış hücreleri, viral seleksiyon için pozitif bir kontrol olarak kullanılacak optimal blastisidin konsantrasyonu ile ortamda büyütün.
    8. Ölü hücreleri çıkarmak için seçim süresi boyunca her 3 günde bir optimal blasticidin konsantrasyonu ile desteklenen ortamı değiştirin.
      NOT: Sadece blastisidin seçiminden kurtulan hücreler lentiviral vektörü entegre etmiş olacaktır.
    9. Blastisidin tarafından seçilen Lenti-iCas9 hücre hatlarını genişletin.
      NOT: Her genişletme üzerine hücre geçiş numarasını kaydedin.
      1. Lenti-iCas9 hücrelerinin bir kısmını, uzun süreli kriyovyal depolama için% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş tercih edilen ortamda dondurun.
      2. En sağlam DOX ile indüklenebilen Cas9 protein seviyelerini sergileyen hücre hattını tanımlamak için Lenti-iCas9 hücrelerinin bir kısmını batı leke 9 ile analiz edin (bkz. Adım 2.3.).
  4. Cas9 protein indüksiyonu için en uygun koşulları belirlemek üzere yeni kurulan Lenti-iCas9 hücre hatları üzerinde bir doksisiklin konsantrasyon eğrisi gerçekleştirin.
    1. Bu DOX konsantrasyon süresi seyrini gerçekleştirmek için test edilen her hücre hattı için dört bağımsız 6 delikli plaka ayarlayın. Plaka 5, her 6 delikli plakanın kuyusu başına 104 hücre × ve 37 ° C'de,24 saat boyunca tercih edilen ortamda% 5 CO 2'de büyür.
    2. DOX (çalışma stoğu 1 mg/mL) tercih edilen ortamda, 0, 50, 100, 150, 250 ila 500 ng/mL arasında değişen son DOX konsantrasyon eğrisi ile seyreltin.
    3. Her tohumlanmış 6 kuyucuklu plakanın kuyularını 1'den 6'ya kadar etiketleyin. Ortamı çıkarın ve uygun DOX konsantrasyonlarıyla değiştirin. Aşağıdaki zaman noktalarına kadar plakaları 1-4 büyütün: 24 saat, 48 saat ve 72 saat DOX indüksiyonu; ve 120 saat DOX çekilmesinden sonra (başlangıçta 72 saat DOX kaynaklı).
    4. Plakanın kuyularını her zaman noktasında uygun yöntemler (örneğin, tripsinizasyon) kullanarak hasat edin. Hücre peletlerini -80 °C'de saklayın. Lizin izolasyonu ve Cas9 batı leke analizi için hücre peletlerini RIPA tamponunda işleyin.
      1. DOX-indüksiyon süresi kursunun her örneği için% 4-12 Bis-Tris jeli kullanarak 40 μg hücre lizatı çalıştırın ve proteinleri bir immünoblot membranına aktarın.
      2. 160 kDa proteinini tespit etmek için immünoblot membranını Cas9'a karşı birincil bir antikor ile hibridize edin. GAPDH (37 kDa) gibi bir temizlik geni kullanarak Cas9 seviyelerini normalleştirin.
    5. Batı lekesi sonuçlarına dayanarak, Lenti-iCas9 hücre hatlarında Cas9'u indüklemek için en uygun DOX konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: Bu seferki kurs, DOX çıkarıldıktan sonra 120 saat sonra Cas9 ifadesinin ne kadar sıkı bir şekilde düzenlendiğini de ortaya koyacaktır.
    6. CRISPR transfeksiyonlarını optimize etmek için sağlam Cas9 protein ekspresyonu gösteren Lenti-iCas9 hücre hatları için tek hücreli koloniler oluşturun (Bölüm 3'te).

3. Cas9 indüksiyonu ve yüksek verimli bir format kullanarak hücrelerin sentetik kılavuz RNA transfeksiyonu ile CRISPR reaksiyonlarının gerçekleştirilmesi

NOT: Bir iş akışı diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir.

  1. Kağıt üzerinde, tüm miRNA kümesini, çeşitli kümelenmiş miRNA gen kombinasyonlarını ve ayrıca bireysel miRNA kümesi üyelerini hedef alan 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarılacak crRNA çifti kombinasyonlarını haritalandırın.
    1. Haritada, hedeflenen miRNA lokusu başına dört kuyuyu etiketleyin. Her kuyunun bir transfeksiyon reaksiyonunu temsil etmesini sağlayın, istenen miRNA nakavt genomik lokusunun 5' ve 3' konumlandırılmış iki benzersiz crRNA'sı ve tracrRNA (tavlanmış 1: 1 molar oranı).
    2. Etiketlenmiş dört kuyucuğun her birinin transfeksiyon için benzersiz bir crRNA çiftini temsil ettiğinden emin olun (örneğin; 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      NOT: Her hedeflenen miRNA lokusunu çevreleyen iki adet 5' crRNA ve iki adet 3' crRNA'nın tasarımı (Bölüm 1), transfeksiyon reaksiyonunda dört olası 5' ve 3' kılavuz RNA çiftinin üretilmesini sağlar.
  2. Lenti-iCas9 hücre hattını, optimize edilmiş DOX konsantrasyonunu içeren tercih edilen ortamda24 delikli bir plakanın 5 x 10 4 hücre/kuyusunda plakalayın (Adım 2.4'te belirlenir). Cas9 protein ekspresyonunu indüklemek için hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2'de 24-48 saat büyütün.
  3. Lenti-iCas9 hücrelerini hazırlanan 5' ve 3' kılavuz RNA'larla transfekte edin.
    1. Sentezlenmiş crRNA ve tracrRNA oligonükleotidleri nükleaz içermeyen su ile 10 μM'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden oluşturun.
    2. Adım 3.1.'de tasarlanan deneysel haritaya dayanarak, hedeflenen miRNA lokusu başına dört adet 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin ve dört olası 5' ve 3' crRNA çifti kombinasyonunu (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'B) temsil edin.
    3. Her tüpte, aşağıdaki reaksiyonu (10 μL'lik son hacim) kullanarak 2 μM kılavuz RNA kompleksini oluşturmak için 1: 1 molar tracrRNA oranını ve benzersiz crRNA'ları (5' ve 3') karıştırın:
      1. 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 2,5 μL tracrRNA (10 μM stok), 5' konumlandırılmış crRNA'nın 1,25 μL'si (10 μM stok), 1,25 μL ve 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 μL'lik 5 μL ekleyin. Karıştırmak için 16.000 × g'da 30 s için mikrosantrifüj. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
    4. Her tüpe, 10 μL kılavuz RNA kompleks reaksiyonuna (toplam 50 μL hacim) 40 μL indirgenmiş serum ortamı (örneğin, Opti-MEM) ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetle çekerek hafifçe karıştırın.
    5. Temiz bir 1,5 mL'lik santrifüj tüpünde, 2 μL transfeksiyon reaktifi 28 (bakınız NOT 3.3.5.1.) ve48 μL indirgenmiş serum ortamı (örneğin, Opti-MEM, son hacim 50 μL) yukarı ve aşağı pipetleyerek, yavaşça karıştırın. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
      1. Reaktifi (2 μL) ve azaltılmış serum ortamı (örneğin, Opti-MEM, 48 μL) miktarlarını, transfekte edilecek kuyu sayısına ve ayrıca hafif pipetleme yanlışlıklarını hesaba katmak için %10 ekstra hacme çarparak transfeksiyon reaktifinin ana karışımını hazırlayın.
        NOT: Küçük RNA ve CRISPR RNA oligonükleotid transfeksiyonlarının yanı sıra hücre hattı tip28 için optimize edilmiş bir transfeksiyon reaktifi seçin.
    6. 50 μL kılavuz RNA karışımını içeren her tüpe (Adım 3.3.4.'ten), seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin 50 μL'sini ekleyin (Adım 3.3.5'ten). Pipet karışımı karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı bir kez. RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
    7. Kılavuz RNA / transfeksiyon karışımının 100 μL'sini içeren her tüpe DOX (optimal konsantrasyon) ile desteklenmiş 400 μL antibiyotiksiz ortam ekleyin. Pipet hafifçe karıştırmak için.
  4. Ortamı DOX kaynaklı Lenti-iCas9 hücrelerinden çıkarın (Adım 3.2.). 24 delikli plaka deney haritasına dayanarak 500 μL medya/DOX/kılavuz RNA/transfeksiyon karışımı ekleyin (Adım 3.1.). Transfekte hücreleri 37 ° C'de 48 saat boyunca,% 5 CO2 inkübe edin.
  5. Ortamı DOX içermeyen taze tercih edilen ortamla değiştirin (Cas9 proteinini hücrelerden temizlemek için). Hücrelerin 37 ° C'de 24-48 saat daha iyileşmesine izin verin,% 5 CO2.
  6. Transfekte hücreleri toplayın (tripsinizasyon) ve genotipleme ve tek hücreli seyreltmeler için hazırlanın.
    NOT: Hücreler, transfekte CRISPR geni düzenlenmiş ve transfekte edilmemiş vahşi tip hücreler içeren karışık bir popülasyonu temsil eder. Bu adım, tek hücreli koloni genişlemesine zaman / kaynak yatırmadan önce CRISPR düzenlemesinin verimliliğini belirleyecektir.
    1. Hücreleri 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1x yıkayın. Hücreleri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL tripsin içinde,% 5 CO2 inkübe edin ve hücreleri 1 mL ortam içeren temiz bir 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
    2. Hücreleri karıştırmak ve 20 ° C'de 200 × g'de 5 dakika boyunca mikrosantrifüj yapmak için ters çevirin. Ortamı çıkarın ve hücre peletini 1 mL PBS içinde yeniden askıya alın.
    3. Yıkanmış hücreleri 200 °C'de 5 dakika × g mikrosantrifüj edin. PBS'yi çıkarın ve hücre peletini tercih edilen ortamın 150 μL'sinde yeniden askıya alın.
  7. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayma cihazı kullanarak 150 μL yeniden askıya alınmış hücrelerin mikrolitresi başına hücre sayısını belirleyin.
  8. 150 μL yeniden askıya alınmış hücreleri üç parçaya ayırın.
    1. Transfekte hücrelerin 1/3'ünü (50 μL) orta düzeyde artı %10 DMSO'da (150 μL'lik son hacim) gelecekteki genişleme/uzun süreli depolama için kriyovyallerde dondurun.
    2. Transfekte hücrelerin 1/3'ünü (50 μL) genotipleme için temiz bir 0.2 mL PCR tüpüne aktarın.
      1. Hücreleri 4 ° C'de 200 × g'da 5 dakika boyunca mikrosantrifüj yapın ve ortamı çıkarın.
      2. Hücre peletini 100 μL PBS'de yeniden askıya alın.
      3. Hücreleri 4 ° C'de 200 × g'da 5 dakika boyunca mikrosantrifüj yapın ve PBS'yi çıkarın. Karışık popülasyonlu hücre peletlerini -80 °C'de uzun süreli depolayın.
      4. Bölüm 4'teki iş akışını kullanarak genotipleme için hücre peletini işleyin.
    3. Tek hücreli koloniler oluşturmak için hücrelerin son 1 / 3'ünü (50 μL) seyreltme ve kaplama için 96 delikli bir plaka formatında hazırlayın.
      1. Adım 3.7.'deki hücre sayısına dayanarak, 96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 100 μL ortamda 10, 5, 2 ve 1 hücre (ler) elde etmek için gereken seyreltmeleri hesaplayın.
      2. 12 kanallı çok kanallı bir pipettör ve steril bir reaktif rezervuarı kullanarak, her seyreltme için plakanın iki sırasına (toplam 24 kuyu) kuyu başına 100 μL seyreltilmiş hücre ekleyin (kuyu başına 10, 5, 2 veya 1 hücre). Hücrelerin tek hücreli koloni genişlemesi için akıcılığa büyümesi için 4-6 hafta bekleyin. Hücreleri haftalık olarak bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin ve kolonilerin tek veya çok hücreli kolonileri temsil edip etmediğini not edin.
      3. Genotipleme için ~ 10-15 tek hücreli koloni toplayın (Bölüm 4). Hedeflenen her miRNA lokusu için en az üç bağımsız, nakavt, tek hücreli koloni hattı tanımlayın. Vahşi tipteki tek hücreli satırları denetim olarak saklayın.
        NOT: Tarama sayısı, hücre hattı tipine ve miRNA nakavt fenotipinin hücre büyümesi / canlılığı üzerindeki etkisine bağlı olacaktır.

4. Ham hücre lizatları kullanılarak CRISPR hücre hatlarının PCR genotiplemesi

  1. 96 kuyucuklu bir plakanın neredeyse birleşimli kuyularından bireysel, tek hücreli kolonileri hasat edin.
    NOT: Bu adımlarda açıklanan ortam/PBS'nin uzaklaştırılması, biyogüvenlik kabinindeki bir vakum aspiratörü kullanılarak manuel olarak gerçekleştirilebilir, ancak çapraz kontaminasyonu önlemek için dikkatli olun. Aspirasyon sırasında 96 delikli plakanın her bir kuyucuğu için yeni bir steril "sarı" 200 μL pipetman ucu kullanın, burada değiştirilen her sarı uç, vakum aspiratörüne bağlı steril bir cam mera pipetinin sonuna sıkıca yerleştirilir.
    1. Kuyucukları 100 μL PBS ile 1x yıkayın. PBS'yi aspire edin.
    2. 50 μL tripsin ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO 2'de2-5 dakika inkübe edin.
    3. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin ve yeniden askıya alınan hücreleri 1 mL ortam içeren 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
    4. Hücreleri karıştırmak için ters çevirin ve 20 ° C'de 200 × g'de 5 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde hafifçe peletleyin.
    5. Ortamı çıkarın ve 1 mL PBS ekleyin. Pelet bozmak için tüpe hafifçe hafifçe vurun ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin.
    6. Hücreleri peletlemek için 200 × g'de 20 °C'de 5 dakika boyunca mikrosantrifüj yapın.
    7. PBS'yi çıkarın ve peleti 300 μL taze PBS içinde yeniden askıya alın.
    8. 300 μL numuneyi iki parçaya bölün.
      1. Hücrelerin 200 μL'sini (peletin 2 / 3'ü), tercih edilen ortamın 1 mL'sini içeren 24 delikli bir plakanın kuyucuğuna aktarın. Genotip doğrulandıktan sonra, fonksiyonel analiz için CRISPR aracılı nakavt hücre hatlarını genişletmek için bu hücreleri kullanın.
      2. Hücrelerin 100 μL'sini (peletin 1 / 3'ü) 0.2 mL'lik bir PCR tüpüne aktarın. 4 °C'de 3.000 x g'de 5 dakika boyunca mikrosantrifüj. PBS'yi kaldırın. Peleti -80 °C'de saklayın.
  2. Adım 1.3'te tasarlanan PCR primerlerini kullanarak genotipleme ve dizi analizi için ham hücre lizatları hazırlayın. Transfekte edilmemiş hücrelerden hazırlanan hücre lizatlarını, vahşi tip pozitif kontroller olarak kullanmak üzere bu deneylere dahil edin.
    1. Hücre peletini 4 μL 5x DNA polimeraz tamponunda ( Malzeme Tablosuna bakınız, son konsantrasyon 1x), 1 μL Proteinaz K (20 ng / mL stok), 1 μL RNaz A (10 ng / mL stok) ve toplam 20 μL hacme kadar nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alın.
    2. Bir PCR programı kullanarak bir termosikler içindeki hücreleri lize edin: 30 dakika boyunca 56 °C ve 5 dakika için 96 °C. Hücre lizatlarını -20 °C'de saklayın.
    3. Kılavuz RNA 5' ve 3' kılavuz RNA hedeflenen bölgeleri çevreleyen tasarlanmış PCR primerlerini (ileri, geri) kullanarak bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin (Tablo 1).
      NOT: DNA polimeraz tamponu ve termosikler koşulları, PCR reaksiyonu için kullanılan Taq DNA polimeraz enzimine bağlı olacaktır. Bu protokol Phusion HF DNA Polimeraz için optimize edilmiştir.
      1. PCR reaksiyon karışımını buz üzerinde kurun: 5 μL 5x DNA polimeraz tamponu, 0.5 μL ileri PCR primer (10 μM stok), 0.5 μL ters PCR primer (10 μM stok), 0.5 μL 10 mM dNTP, 0.25 μL DNA Polimeraz, 1-4 μL hücre lizatı ve toplam 25 μL hacme kadar nükleaz içermeyen su.
      2. PCR reaksiyonunu programı kullanarak bir termosikler içinde çalıştırın: 3 dakika boyunca 98 °C ve 10 s için 98 °C'lik 35 döngü, 15 s için 62 °C, 15 s için 72 °C ve daha sonra 10 dakika için 72 °C. 4 °C bekletin. Bkz. NOT 4.2.3. üstünde.
    4. PCR ürünlerini elektroforez analizi için% 1'lik bir agaroz jeli üzerine yükleyin.
    5. Nakavt (ve vahşi tip) genotipler için öngörülen moleküler boyutun izole PCR fragmanlarından DNA çıkarın. DNA dizilimi için örnekleri hazırlayın.
    6. CRISPR reaksiyonunun başarılı olduğunu doğrulayın ve Cas9 bölünme bölgesini tanımlamak ve miRNA lokus delesyonunu doğrulamak için izole PCR fragmanlarının DNA dizilimini gerçekleştirin.
      1. CRISPR tarafından hedeflenen her miRNA lokusu için en az üç bağımsız nakavt hücre hattını izole edin. Aşağı akış fonksiyonel etütlerinde kontrol olarak kullanmak için vahşi tip (ve heterozigot) hücre hatlarını koruyun.
      2. Nakavt hücre hatlarının silinen lokus için olgun miRNA'yı ifade etmediğini doğrulamak için qRT-PCR veya kuzey leke analizi yapın.
        NOT: Tüm genom dizilimi (WGS), CRISPR gen düzenlemesini ve hedef dışı hedeflemeyi doğrulamak için en kesin yöntemdir.
      3. Hesaplamalı olarak tahmin edilen PCR ile CRISPR hedefleme dışı etkileri test edin (Adım 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. Kapsamlı tek hücreli koloni taraması sadece heterozigot genotiplerle sonuçlanırsa, kılavuz RNA transfeksiyonunu tek hücreli heterozigot çizgilerde tekrarlayın.
        NOT: Homozigot nakavt hücre hatlarının elde edilememesi, miRNA kaybı veya ebeveyn hücre hattının daha fazla analiz gerektiren doğal genomik karmaşıklığı (örneğin, kromozom duplikasyonları / füzyonları) nedeniyle ölümcül etkilere işaret edebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yüksek verimli CRISPR delesyon protokolü, Cas9 ile indüklenebilir LNCaP ve PC3-ML insan kanseri hücre hatlarının, prostat kanseri bağlamında incelenen miR-888 kümesini hedef alan sentetik oligonükleotid kılavuz RNA'ları ile transfeksiyonu kullanılarak başarıyla kullanılmıştır. MiR-888 kümesi başlangıçta bir ekspresyon profilleme ekranında, düşük dereceli ve kanser dışı hastalara kıyasla yüksek dereceli hastalığı olan prostat kanseri hastalarında yüksek olarak tanımlanmıştır 9,10. 35.124 bp'yi kapsayan miR-888 kümesi, insan kromozomu Xq27.3 üzerinde yedi miRNA'dan (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b ve -891a) oluşur (Şekil 2A). Bu lokus, kalıtsal prostat kanseri 11,12,13,14,15,29 ile ilişkili HPCX1 (Kalıtsal Prostat Kanseri, X'e bağlı 1, Xq27-28) içinde yer almaktadır. miR-888, -890, -892a, -892b ve -892c, dizi homolojisini paylaşır ve memeli tarafından korunan miR-743 ailesine aittir. MiR-891a ve miR-891b küme üyeleri sadece sekans homolojisini birbirleriyle paylaşırlar ve primata özgü miR-891 ailesine aittirler. MiR-888 kümesinin genomik organizasyonu primatlar arasında korunur ve bu da önemli bir sinyal ağının işlevsel olarak korunduğunu ima eder30.

Bireysel miR-888 küme üyesi aktivitesini değerlendirmek için deneysel aşırı ekspresyon (miRNA taklitleri) ve inhibisyon (antisens oligonükleotidler) çalışmalarını kullanan önceki çalışmalar, Matrigel Boyden oda tahlilleri 9,10 kullanarak prostat kanseri hücre invazivliğini teşvik etmek için tüm miR-888 küme üyeleri için örtüşen bir rol ortaya koymuştur. En önemlisi, miR-888 ve miR-891a, prostat hücresi büyümesini (WST-1 tahlilleri) indüklemek, fare ksenogreftlerinde prostat tümörü yükünü hızlandırmak ve ortak hedefleri (örneğin, TIMP-2) 9,10 düzenlemek için benzer şekilde işlev gördü. Bununla birlikte, bu çalışma miR-888 küme üyeleri arasında daha karmaşık bir etkileşim olduğunu öne sürdü. Örneğin, miR-888 ve miR-891a, PC3-N prostat hücresi proliferasyonunu teşvik etmede sinerjik etkiler gösterirken, hem miR-890 hem de miR-892c, WST-1 tahlilleri9 kullanılarak inhibitör büyüme etkileri göstermiştir. Bu nedenle, bu yüksek verimli CRISPR protokolü, prostat kanseri bağlamında miR-888 küme ağını genetik olarak sorgulamak için kullanılmıştır.

CRISPR Cas9 gen düzenlemesi için açıklanan iş akışı (Şekil 1), 24 kuyucuklu bir format kullanılarak tek bir deneyde 32 benzersiz CRISPR kılavuzu RNA transfeksiyon reaksiyonunun test edilmesine izin verdi. Bu protokol, tüm miR-888 kümesi, spesifik miRNA kümesi üye kombinasyonları ve bireysel miRNA üyeleri için delesyonlar taşıyan bir insan prostat kanseri nakavt hücre hatları panelinin başarılı bir şekilde tanımlanmasıyla sonuçlandı. Kararlı indüklenebilir Cas9 hücre hatlarının oluşumu ilk olarak kuruldu. Kısaca, PC3-ML ve LNCaP insan prostat kanseri hücrelerine DOX ile indüklenebilen Streptococcus pyogenes Cas9 lentivirüs vektörü (Lenti-iCas9; EditR İndüklenebilir Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nükleaz Parçacıkları; MOI 0.3), virüs toksisitesi için doğal hücre hattı duyarlılığına bağlı olarak 6 saat (LNCaP) veya gece boyunca (PC3-ML).

Enfekte hücre hatları daha sonra blastisidin seleksiyonu (7.5 μg / mL) ve tek hücreli koloni genişlemesi geçirdi. Western blot çalışmaları, DOX-indüksiyon zaman seyrine dayanan en sağlam Cas9 ekspresyonunu sergileyen tek kolonili PC3-ML ve LNCaP Lenti-iCas9 hücre hatlarını seçmek için kullanıldı (Şekil 2A). Bu lentiviral Cas9 indüklenebilir sistem sıkı bir şekilde kontrol edildi ve 120 saat boyunca DOX çekilmesi üzerine, Cas9 proteininin çoğu hücrelerden temizlendi (Şekil 2A). Bir DOX konsantrasyon eğrisi, 250 ng / mL DOX'un bu Lenti-iCas9 prostat hücre hatlarında sağlam Cas9 protein ekspresyonunu indüklemek için en uygun doz olduğunu belirledi (Şekil 2B). Çevrimiçi bir crRNA tasarım aracı23 kullanılarak, ~ 35 kb miR-888 küme bölgesinin tamamını hedef alan benzersiz crRNA'lar (dört olası 5' ve 3' kılavuz RNA kombinasyonuna izin vermek için planlanan her bir miRNA nakavt lokusunu çevreleyen iki 5' ve iki 3' crRNA) tasarlanmıştır; miR-743 ailesi veya miR-891 ailesi içindeki daha küçük küme kombinasyonları; bireysel miRNA delesyonlarının yanı sıra (miR-888, -891a) (Şekil 3A). CRISPR deneylerini gerçekleştirirken, insan prostat kanseri Lenti-iCas9 hücre hatları, Cas9 ekspresyonunu indüklemek için 48 saat boyunca 250 ng / mL DOX ile desteklenmiş ortamda büyütüldü.

Hücreler daha sonra sentetik evrensel tracrRNA kompleksli (1: 1 molar oran) ve benzersiz bir 5' ve 3' genomik bölgeye özgü crRNA seti ile 24 kuyucuklu bir plaka formatında transfekte edildi (Tablo 2). DOX, Cas9 proteinini prostat kanseri hücrelerinden temizlemek için transfeksiyondan 48 saat sonra hücre kültürü ortamından çıkarıldı. Kuyular 48 saat sonra (transfeksiyon sonrası 96 saat) hasat edildi ve hasat edilen her hücre peletinin üçte biri ham hücre lizatları kullanılarak PCR genotiplemesi için hazırlandı (Tablo 3). PCR reaksiyonlarının jel elektroforez analizi, nakavt genotipini temsil eden öngörülen DNA fragman boyutunun her CRISPR transfeksiyonu için yükseltildiğini göstermiştir (Şekil 3B). Bu izole nakavt PCR fragmanlarının DNA dizilimi, transfekte edilmiş 5' ve 3' kılavuz RNA'ların, PAM bölgelerinin yukarı yönünde Cas9 bölünmesini / ligasyonunu ~ 3 nt yukarı yönettiğini ve hedeflenen miRNA lokusunun genomik kaybını doğruladığını doğruladı ( temsili örnek Şekil 4C'de gösterilmiştir). MiR-888 kümesi, kromozom X'in intergenik bir bölgesinde (herhangi bir protein kodlayan genden uzak) bulunduğundan, NHEJ nedeniyle Cas9 bölünme bölgesinde sıklıkla INDEL'lere sahip olan nakavt hücre hatlarının aşağı akış yapay etkilere neden olacağı beklenmiyordu.

CRISPR transfeksiyon reaksiyonları başarılı olmasına rağmen (Şekil 3B), transfekte hücreler transfekte (nakavt) ve transfekte edilmemiş (vahşi tip) hücrelerin karışık hücreli bir popülasyonunu temsil ediyordu. Bu popülasyon aynı zamanda hedeflenen miRNA lokusu için homozigot ve heterozigot delesyonlar taşıyan hücrelerin bir karışımını temsil ediyordu. LNCaP ve PC3 prostat kanseri hücre hatları, iki X kromozomu31,32 içeren anormal karyotiplere sahip erkeklerden türetilmiştir. Bu nedenle, her hücre transfeksiyon reaksiyonunun bir kısmı, tek hücreli koloni hatları elde etmek için 96 kuyucuklu bir plaka formatında seri olarak seyreltildi. Bu koloniler, hedeflenen miRNA lokusunun tüm kopyalarından yoksun homozigot hücre hatlarını seçmek için PCR tarafından tarandı.

Bu prosedürün zamanında takip edilmesi önemliydi, çünkü geçmiş veriler miR-888 kümesinin tümör hücresi büyümesini ve hastalık saldırganlığını teşvik etmede bir rol oynadığını göstermiştir. MiR-888 küme üyeleri için CRISPR delesyonları taşıyan kanser hücrelerinin vahşi tip hücrelerden daha yavaş büyüdüğü tahmin edilmektedir. Geçerli bir endişe, zamanla, karışık bir miRNA nakavt ve vahşi tip hücre popülasyonu içeren kılavuz RNA-transfekte kuyuların, vahşi tip hücrelerin kültürdeki tehlikeye atılmış mutant hücreleri hızla geride bırakmasına neden olacağıydı. Bunun meydana geldiği ve özellikle oldukça agresif PC3-ML hücre hatlarını kullanan deneylerde belirgin olduğu belirtildi. Bu nedenle, tek hücreli koloni hatları oluşturmak için seri seyreltmeleri veya kriyodepolama için hücre hazırlığını içeren adımlar, karışık popülasyon örneklerinde nakavt hücrelerini korumak için CRISPR transfeksiyon deneyleri yapıldıktan sonra 48-72 saat içinde gerçekleştirildi.

MiR-888 kümesi için CRISPR iş akışının en zahmetli kısmı, homozigot, tek hücreli koloni miRNA delesyonlarının üretilmesiydi. Bu süreçteki bir zorluk, kültürlenmiş LNCaP ve PC3-ML hücrelerinin tipik olarak tek hücreli yoğunluklarda kaplandığında iyi gelişmemesiydi. Ek olarak, hücre büyümesinin, miR-888 küme üyelerinin kombinatoryal kaybı üzerine fenotipik olarak tehlikeye girdiği görülmüştür (ve hücre hattının saldırganlığı ile ilişkilidir). Bu nedenle, belirli miRNA lokus kombinasyonlarını hedef alan bazı transfeksiyon reaksiyonları için, genotipleme için yeterli tek hücreli koloni hatları oluşturmak için ek hücre seyreltmeleri (96 kuyucuklu bir format kullanarak) gerekliydi. Tek hücreli kolonilerin genotiplerini elektroforez jel görüntüleme ile tararken, nakavt PCR fragmanlarına kıyasla wildtype'ın bant yoğunluğunu karşılaştırmak ve hücre hattının heterozigot (eşit bant yoğunluğu) olup olmadığını veya tek hücreli seyreltmelerin ek turlarından yararlanacak çok hücreli bir koloni (eşit olmayan bant yoğunluğu) temsil edip etmediğini belirlemek yararlı olmuştur. Hücre kolonilerinin anormal büyüklükte PCR fragmanlarına sahip olduğu ve vahşi tip veya nakavt genotipleriyle tutarsız olduğu belirtilirse, bu çizgiler çalışmadan çıkarıldı.

İzole PCR fragmanlarının vahşi tip ve nakavt genotipleri için tutarlı DNA dizilimi, kurulan her tek hücreli koloni için yeniden doğrulandı ve bağımsız yöntemler (yani, qRT-PCR, WGS) kullanılarak doğrulandı. Bu deneylerde homozigot null hücre hatları üretmenin tipik etkinliği açısından, bu hedeflenen miRNA lokusu ve kullanılan hücre tipi ile değişmiştir. Örneğin, LNCaP kullanarak tek kolonili mir-891a nakavt hatları elde etmedeki verimlilik% 30 idi, ancak PC3-ML hücrelerinde ~% 7'ye düştü. Bu fark, doğal hücre tipi farklılıklarından kaynaklanabilir (örneğin, PC3-ML hücreleri, LNCaP hücrelerinden daha yüksek bölünme oranlarına / metastatik potansiyele sahiptir). CRISPR verimlilik farklılıkları, miRNA kaybının fonksiyonel etkisini de yansıtabilir (örneğin, miR-891a, hücre büyümesini ve saldırganlığı teşvik eder 9,10) ve bu nedenle, nakavt fenotipleri PC3-ML gibi daha agresif hücre hatlarında büyütülebilir. MiR-888 kümesinin daha büyük miRNA lokus delesyonları için tek kolonili hatların elde edilmesi, verimliliğin azaldığını göstermiştir. Bunun DNA'nın daha büyük bölgelerini yok etmekten mi kaynaklandığını veya prostat kanseri hücrelerinde miR-888 üyelerinin temel ve örtüşen fonksiyonel rollerinin altını çizip çizmediğini belirleyemedik.

Bu iş akışından oluşturulan tek hücreli koloni genişletilmiş nakavt miR-888 küme hücre hatlarının ayrıntılı açıklaması ve fenotipik analizi devam etmektedir ve başka bir yerde yayınlanacaktır. Bu CRISPR gen düzenleme çalışmalarında üretilen miRNA delesyonlarının temsili bir sonucu olarak, bireysel bir mir-891a delesyonunu taşıyan LNCaP prostat kanseri hücreleri için bulgular gösterilmiştir. Tek hücreli koloniler PCR ile genotiplendi ve sekans doğrulandı (Şekil 4A-C). Anormal büyüklükte PCR fragmanları sergileyen hücre çizgileri analiz edilmedi (örneğin, Şekil 4D'de gösterilen klon L14 H7). Mir-891a lokusu için nakavt ve vahşi tip tek hücreli koloniler elde edildikten sonra, fonksiyonel çalışmalar yapıldı. Geçmiş çalışmalar, miR-891a'nın (miRNA mimik lentiviral vektör) aşırı ekspresyonunun prostat hücresibüyümesine neden olduğunu göstermiştir 9 ve bu nedenle miR-891a kaybının karşılıklı etkiler göstereceği tahmin edilmektedir. Mir-891a nakavt ve vahşi tip hücreleri karşılaştıran WST-1 proliferasyon testleri bu hipotezi doğruladı ve miR-891a kaybı büyümenin yavaşlamasına neden oldu (Şekil 4D, E).

Figure 1
Şekil 1: MiRNA kümesi delesyonları oluşturmak için CRISPR gen düzenleme iş akışı. (A) Kılavuz RNA, tavlanmış sentetik crRNA ve tracrRNA oligonükleotidlerden (karışık 1: 1 molar oran) oluşur. CrRNA oligonükleotid, hedeflenen genomik DNA bölgesini tamamlayan benzersiz bir 5'-terminal 20 nt kılavuz dizisi (sarı) içerecek şekilde tasarlanmıştır ve bunu tracrRNA oligonükleotid ile baz çifti olan değişmez bir 22 nt Streptococcus pyogenes tekrar dizisi (yeşil) izler. Kırmızı oklar, tipik olarak PAM'ın 3 nt yukarı yönünde bulunan Cas9 enzimi çift sarmallı DNA bölünme bölgelerini gösterir. (B) Bu deneysel iş akışı, 24 kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyusunu göstermektedir. DOX ile indüklenebilen Cas9 lentivirüs vektörü (Lenti-iCas9, MOI 0.3) ile enfekte olmuş hücreler, Cas9 protein ekspresyonunu indüklemek için 48 saat boyunca DOX ile orta derecede yetiştirilir. İki sentetik kılavuz RNA (crRNA::tracrRNA'nın karışık 1:1 molar oranı) Cas9 ile indüklenen hücrelere dönüştürülür. Kılavuz RNA'lar, Cas9'a, çıkarılması hedeflenen miRNA kümesi bölgesini çevreleyen genomik DNA bölgelerine (5' ve 3') eşlik eder. Hücreler, PCR genotiplemesi ve aşağı akış fenotipik analizleri için tek hücreli koloniler oluşturmak üzere 96 kuyucuklu bir format kullanılarak seyreltme için transfeksiyon sonrası 48 saat hazırlanır. Kısaltmalar: CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlar; miRNA = mikroRNA; crRNA = CRISPR RNA; tracrRNA = trans-aktive edici CRISPR RNA; nt = nükleotid; Cas9 = CRISPR ile ilişkili endonükleaz; PAM = protospacer bitişik motif; DOX = doksisiklin; MOI = enfeksiyon çokluğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Sıkı Cas9 protein regülasyonu sergileyen doksisiklin ile indüklenebilir Cas9 lentiviral kaset taşıyan kanser hücre hatları. (A) Western leke analizi, Lenti-iCas9 vektörü (EditR İndüklenebilir Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nükleaz Parçacıkları, MOI 0.3) ile enfekte olmuş ve 250 ng / mL DOX içeren ortamda 48 saat boyunca yetiştirilen insan prostat kanseri PC3-ML hücre hatlarının optimal Cas9 protein seviyelerini ifade ettiğini göstermiştir. Cas9 ifadesi GAPDH ifadesine normalleştirildi. (B) 48 saat ve 120 saat (+DOX) için 250 ng / mL DOX ile orta derecede yetiştirilen PC3-ML hücreleri sağlam Cas9 protein ekspresyonu gösterdi. 120 saat (120 saat sonra) için ortamdan DOX çıkarılması (-DOX), batı leke analizi ile ölçüldüğü gibi Cas9 protein klirensi ile sonuçlandı. LNCaP Lenti-iCas9 hücre hattını oluştururken de benzer sonuçlar elde edildi (gösterilmedi). Kısaltmalar: CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlar; Cas9 = CRISPR ile ilişkili endonükleaz; DOX = doksisiklin; MOI = enfeksiyon çokluğu; GAPDH = gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Tek bir deneyde birden fazla miR-888 küme silme kombinasyonu oluşturmak için yüksek verimli CRISPR deneysel tasarımı. (A) İnsan kromozomu Xq27.3 üzerinde bulunan miR-888 kümesinin diyagramı, memeli tarafından korunan miR-743 ailesi üyeleri mir-892c, -890, -888, -892a ve -892b (mavi kutular) ve primata özgü miR-891 aile üyeleri miR-891a ve -891b'yi (bordo kutuları) gösterir. MiR-888 küme nakavt kombinasyonlarını oluşturmak için benzersiz sentetik crRNA oligonükleotidler (yeşil oklar) kullanıldı. İleri ve geri PCR primerleri (küçük kırmızı dikdörtgenler), hücreleri genotiplemek ve nakavtları taramak için tasarlanmıştır. (B) Bu temsili sonuç, tek bir deneyde bir dizi miR-888 küme nakavt kombinasyonunu hedef alan transfekte PC3-ML hücrelerinde (Lenti-iCas9) 25 CRISPR reaksiyonunu göstermektedir. 24 kuyucuklu bir plakanın her transfekte edilmiş kuyusu, hedeflenen miRNA genomik lokusunun (Δ) 5' ve 3' taraflarını çevreleyen iki benzersiz gRNA içeriyordu (Tablo 2'de listelendiği gibi). Her CRISPR reaksiyonu için ham hücre lizatları hazırlandı ve PCR genotiplendirildi. Jel elektroforezi ile öngörülen nakavt boyutlarında göç eden izole PCR fragmanları DNA dizilimine tabi tutuldu ve hedeflenen Cas9 bölünmesi ve miRNA lokus çıkarılması için doğrulandı. Tahmin edilen WT PCR fragmanı bp boyutları parantez içinde gösterilir ve istenilen CRISPR KO PCR fragman boyutları jelin alt kısmında gösterilir. Kısaltmalar: CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlar; Cas9 = CRISPR ile ilişkili endonükleaz; gRNA = kılavuz RNA; DOX = doksisiklin; bp = baz çifti; WT = vahşi tip; KO = nakavt. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Prostat kanseri hücreleri, baskılanmış proliferasyon sergileyen CRISPR gen düzenlemesi kullanılarak mir-891a için silindi. (A) PCR primerlerinin tasarımı (mor) ve mir-891a genini (yeşil) çevreleyen genomik dizileri hedefleyen iki 5' ve iki 3' kılavuz RNA (turuncu). (B) Transfekte LNCaP hücrelerinin PCR genotiplemesi, belirtilen 5' ve 3' kılavuz RNA'larla, dört kılavuz RNA kombinasyonunun tümü için Δmir-891a delesyonlarının elde edildiğini doğruladı. Hücre lizatları, transfeksiyon sonrası 48 saat boyunca karışık hücreli popülasyonlardan yapıldı. (C) PCR fragmanları sıralandı ve doğrulandı. Temsili bir örnek, 5A (891a) ve 3B (891a) kılavuz RNA'ları ile tedavi edilen transfekte hücrelerin DNA dizisini gösterir, bu da tahmin edilen Cas9 bölünme bölgesi (PAM bölgesinin 3 nt yukarı akışı) ve CRISPR Δmir-891a delesyonuna neden olur. (D) Tek hücreli koloniler elde edildi ve PCR-genotiplendirildi. Klon L14 G9, bir KO olarak sekans olarak doğrulandı ve klon L14 G9, mir-891a geni için bir WT olarak doğrulandı. (E) miR-891a'nın daha önce prostat kanseri hücre büyümesini indüklediği gösterilmiştir ve bu nedenle miR-891a kaybının karşılıklı fenotipe sahip olduğu tahmin edilmektedir. Mir-891a (L14 G9 [KO], mavi) için silinen prostat kanseri hücrelerinin WST-1 testleri, WT hücrelerine (L14 G9 [WT], kırmızı) kıyasla baskılanmış proliferasyon gösterdi. Kısaltmalar: CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlar; Cas9 = CRISPR ile ilişkili endonükleaz; WT = vahşi tip; KO = nakavt; WST-1 = suda çözünür tetrazolium tuzu-1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

PCR reaksiyonu buz üzerinde kurulur.
Parça 25 μL Reaksiyon Son Konsantrasyon
5x DNA polimeraz tamponu 5 μL 1 adet
İleri PCR Astarı (10 μM) 0,5 μL 0,2 μM
Ters PCR Astarı (10 μM) 0,5 μL 0,2 μM
10 mM dNTP'ler 0,5 μL 200 μM
DNA Polimeraz (2 U/μL) 0,25 μL 0,125 U/ 25 μL
Ham hücreli lizat 1 - 4 μL değişken
Nükleaz içermeyen su 25 μL'ye kadar
PCR reaksiyonu için termosikler koşulları:
Adım Sıcaklık Saat
İlk denatürasyon 98 °C 3 dk
98 °C 10 Saniye
35 döngü 62 °C 15 Saniye
72 °C 15 Saniye
Son uzatma 72 °C 10 dk
Tutmak 4 °C

Tablo 1: Ham lizat genotiplemesi için PCR reaksiyon koşulları. Kısaltma: dNTP = deoksinükleotidler.

CRISPR Hedefli Silme Sitesi Kılavuz RNA Kombinasyonu Vahşi tip (bp) Nakavt (bp) PCR Astar Çiftleri
∆Tam Küme 5A (891a) + 3A (892c)
5B (891a) + 3A (892c)
5A(891a)+3B(892c)
5B (891a) + 3B (892c)		 35,664 389
496
378
485		 891a FWD
892c KARAVAN
∆892c/890/888 5A'(888)+3A(892c)
5B'(888)+3A(892c)
5A'(888)+3B(892c)
5B'(888)+3B(892c)		 2,739 478
487
467
476		 888 FWD
892c KARAVAN
∆892c/890 3A'(888)+3A(892c)
3B'(888)+3A(892c)
3A'(888)+3B(892c)
3B'(888)+3B(892c)		 2,739 710
754
699
743		 888 FWD
892c KARAVAN
∆892b/892a 5A'(888)+5A(892b)
5B'(888)+5A(892b)
5A'(888)+5B(892b)
5B'(888)+5B(892b)		 2,938 554
547
573
566		 892b FWD
888 KARAVAN
∆892b/892a/888 5A(892b)+3A'(888)
5A(892b)+3B'(888)
5B (892b ) + 3A '(888)		 2,938 322
278
341		 892b FWD
888 KARAVAN
∆743 Aile 5A(892b)+3A(892c)
5B (892b) + 3A (892c)
5A(892b)+3B(892c)
5B (892b) + 3B (892c)		 5,015 370
389
359
378		 892b FWD
892c KARAVAN
∆891 Aile 5A(891a)+3A(891b)
5B (891a) + 3A (891b)		 27,294 330
270		 891a FWD
891b YAŞAM
∆891a 5A(891a)+3A(891a)
5A(891a)+3B(891a)
5B (891a) + 3A (891a )
5B (891a) + 3B (891a )		 554 333
273
454
394		 891a FWD
891a KARAVAN

Tablo 2: miR-888 küme nakavt kombinasyonları oluşturmak için kullanılan CRISPR kılavuz RNA'ları. Kısaltmalar: CRISPR = kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlar; bp = baz çifti; FWD = ileri; REV = ters.

Astar Sıra Tm (°C)
888 FWD AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG 52.2
888 KARAVAN CTGGATGATGGCCAAGACAAG 55.9
891a FWD TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA 53.9
891a KARAVAN TTCATCTTGCTGCTACCTGTC 54.8
891b YAŞAM TCATCTTGCTGCTATACGTCCT 55.6
892b FWD GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA 53.5
892b KARAVAN CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC 53.5
892c FWD TGTGAGCACCTACAGGTTAG 53.9
892c KARAVAN CACTCTCACTTGGCTTCATG 53.5

Tablo 3: Genotipleme için kullanılan PCR primerleri. Kısaltmalar: FWD = forward; REV = ters; Tm = erime sıcaklığı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu CRISPR gen düzenleme prosedürü, araştırmacının benzersiz miRNA kümesi delesyon kombinasyonlarını taşıyan tüm hücre hatları panelini hızlı bir şekilde oluşturmasını sağlar. Bu protokolde sentetik tracrRNA (1: 1 molar oran) ile tavlanmış 5' ve 3' genomik bölgeye özgü crRNA'lardan oluşan sentetik kılavuz RNA'ların transfeksiyonu, zaman alıcı plazmid vektör alt klonlamasını önler ve 24 kuyucuklu bir format kullanarak daha esnek ve yüksek verimli bir deneysel tasarıma izin verir. DOX ile indüklenebilir Cas9 lentiviral kaset taşıyan hücre hatlarının oluşturulması, kılavuz RNA'ların hücre transfeksiyonu sırasında sıkı bir şekilde DOX tarafından düzenlenmiş ve sağlam Cas9 ekspresyonunu ve sonraki adımlarda DOX'un kültür ortamından çekilmesi üzerine bu bakteriyel proteinin hızlı bir şekilde temizlenmesini sağlar. Bu prosedür aynı zamanda PCR genotiplemesi için ham hücre lizatlarına dayanır, bu da analiz için minimum hücre materyali gerektirir ve pahalı ve emek yoğun silika sütun DNA saflaştırma yöntemlerinin kullanılmasını veya nükleik asit konsantrasyonlarını bir spektrofotometre kullanarak ölçme ihtiyacını önler ve araştırmacı için yöntemleri daha da kolaylaştırır.

Gerçekten de, burada paylaşılan temsili sonuçlar, bu yöntemin tek bir deneyde 32 benzersiz kılavuz RNA kombinasyonu ile insan prostat kanseri hücre hatlarını transfekte etmek ve tüm ~ 35 kb miR-888 küme bölgesi için delesyon taşıyan çoklu tek hücreli koloni nakavt hatları üretmek için başarılı bir şekilde uyarlandığını göstermiştir; miR-743 ve miR-891a ailelerine ait miR-888 küme üyeleri için daha küçük delesyon kombinasyonları; miR-888 kümesi içindeki bireysel miRNA üyeleri için delesyonların yanı sıra. Bu iş akışı, miR-888 küme ağını insan prostat hastalığı bağlamında moleküler olarak incelemeye başlamak ve miR-888 küme üyelerinin prostat tümörü büyümesini, kanser saldırganlığını ve ilaç direncini (başka bir yerde yayınlanacak) düzenlemek için birbirleriyle işlevsel olarak nasıl örtüştüğünü veya sinerjik / antagonistik olarak nasıl etkileşime girdiğini belirlemek için değerli bir hücre hattı kaynağı oluşturdu. Bu araştırmalar, prostat kanserinin ilerlemiş ve metastatik formları olan hastaların tedavisi için tanısal ve terapötik uygulamalara doğru ilerledikçe bu çalışmalar çok önemli olacaktır.

Bu yüksek verimli CRISPR gen düzenleme protokolünde, araştırmacıların bu yöntemi diğer hastalık bağlamlarında ek miRNA küme ağlarını incelemek için uyarlarken dikkatlice düşünmeleri gereken birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, bu süreçteki en önemli adım, CRISPR ilaçlı uzaklaştırma için miRNA kümesini çevreleyen kılavuz RNA'ların dikkatli bir şekilde tasarlanmasının yanı sıra, bireysel miRNA'ları veya miRNA kümesi üyelerinin kombinasyonlarını silmek için ek kılavuz RNA'lardır. Araştırmacı, özellikle miRNA kümesi bir gen intronun içinde bulunuyorsa veya başka bir genin antisensi varsa, çevredeki genleri veya düzenleyici unsurları bozmamak için dikkatli bir şekilde düşünmelidir. Sentezlenecek en ayırt edici crRNA oligonükleotidlerini seçerken araştırmacıya yardımcı olabilecek 24,25,26,27 CRISPR hedefleme dışı tahmin kaynakları mevcuttur. Bu iş akışı, hedeflenen miRNA lokusunun her birini çevreleyen iki adet 5' ve iki adet 3' crRNA'nın tasarımını açıklamakta olup, dört benzersiz kılavuz RNA kombinasyonunun CRISPR transfeksiyon adımında test edilmesine izin verir ve istenen nakavt hücre hattını üretme şansını arttırır. Bununla birlikte, araştırmacı, belirli bir miRNA gen lokusunu bozmak için başarılı bir şekilde çalışmak için bu kılavuz RNA kombinasyonlarından sadece birine ihtiyaç duyar.

İkincisi, araştırmacı Cas9'u CRISPR gen düzenlemesi için hücrelere iletmek için en uygun yönteme karar vermelidir. Bu prosedür DOX ile indüklenebilen Cas9 lentiviral ekspresyon sistemini kullandı, ancak Cas9 protein üretimi için alternatif yaklaşımlar (örneğin, Cas9 rekombinant proteini, Cas9 mRNA iletimi veya geleneksel Cas9 ekspresyon plazmid vektör sistemlerinin kullanımı) bu protokol için kolayca uyarlanabilir. Örneğin, deneysel düşünceler, Cas9 geçici ekspresyonunun kararlı lentiviral ekspresyon hücre hatları üretmeye karşı kullanılmasını, Cas9'u sürmek için kullanılan promotörün (her yerde bulunan, hücre tipine özgü, indüklenebilir) ve Cas9 ekspresyon vektörünün ilgili hücrelere (yani, antibiyotik direnci) verilmesini sağlamak için pozitif / negatif seçim sistemlerinin dahil edilmesini dikte edebilir.

Üçüncüsü, miRNA kümesinin kaybının hücrelerin yaşayabilirliğini / büyümesini olumsuz yönde etkilemesi durumunda, kılavuz RNA dağıtımından 48-72 saat sonra karışık popülasyonlu transfekte hücrelerin hızlı bir şekilde genotiplenmesi önemlidir. Örneğin, prostat kanseri hücre hatlarında miR-891a gibi tümörü teşvik eden faktörleri silerken, bu mir-891a nakavt hücrelerinin tedavi edilmemiş hücrelerden daha yavaş büyüdüğü ve daha sonra vahşi tip hücrelerin hücre popülasyonunu hızla geçtiği belirtildi. Son olarak, genotipik tarama işlemi sırasında, özellikle daha büyük genomik delesyonlar için miRNA lokusunun çıkarılmasını sağlamak için ek doğrulama yöntemlerini entegre etmek çok önemlidir. Bu önlemler, yalnızca vahşi tip alel mevcutsa tespit edilen dahili PCR genotipleme kontrollerinin kullanılmasını ve nakavt hücre hatlarının hedeflenen miRNA'ları ifade etmediğinden emin olmak için tek hücreli koloniler üzerinde qRT-PCR analizi yapılmasını içerir. Tüm bu hususlar, araştırmacı için başarılı sonuçlar sağlayacaktır.

Bu CRISPR tekniğini laboratuvara dahil ederken karşılaşılan bazı belirgin sınırlamalar vardı. Örneğin, çoklu miRNA kümesi delesyon kombinasyonlarını hızlı bir şekilde üretmek için bu protokolde açıklanan kılavuz RNA transfeksiyon adımlarının yüksek verimli doğasına rağmen, bu prosedürün hız sınırlayıcı adımı, her CRISPR aracılı miRNA delesyonu için genotip taraması ve tek kolonili hücre hatlarının genişletilmesiydi. Olumlu seçim stratejilerinin bu protokole dahil edilmesi bir avantaj olacaktır; Bununla birlikte, 96 kuyucuklu bir biçimde yetiştirilen tek hücreli bir koloniden bir çizgiyi genişletmek hala ~ 3-4 hafta sürecektir. Gerçekten de, miRNA lokus nakavtı başına en az üç bağımsız tek kolonili hücre hattının ve vahşi tip hücrelerin toplanması, test edilen fenotiplerin artefakt / hedefleme dışı etkilerden kaynaklanmadığından emin olmaya yardımcı olacaktır, ancak bu yine de bu prosedürün zaman alıcı doğasına katkıda bulunur. Araştırmacının ayrıca homozigot boş hücre hatları elde etmek için birden fazla CRISPR gen düzenleme turu yapması gerekebilir. Bu, özellikle, kromozomal yeniden düzenlemelerin ve anormal karyotiplerin karmaşık bir genomik manzarasına sahip olan yerleşik ölümsüzleştirilmiş kanser hücresi hatlarını kullanan çalışmalarda belirgindir.

Örneğin, bu temsili çalışma, miR-888 kümesi için delesyonlar üretmek için LNCaP ve PC3 türevi insan prostat kanseri hücre hatlarını kullandı ve X kromozomuna haritalandı. Bu erkek kaynaklı prostat kanseri hücre hatlarının anormal karyotiplere sahip olduğunu ve iki X kromozomuna sahip olduğunu (ve PC3 hücrelerinin diğer otozomlarda kısmi X kromozom translokasyonlarına da sahip olduğunu) bilmek önemliydi.31,32. Bu koşullara rağmen, CRISPR gen düzenlemesi, bu prostat hücresi hatlarını kullanarak homozigot nakavtlar üretecek kadar sağlamdı. Bununla birlikte, bir araştırmacının anormal bir karyotipe sahip hücre hattının (örneğin, eklemeler, silmeler, inversiyonlar, duplikasyonlar), tasarlanan PCR primerleri / kılavuz RNA'ları kullanılarak başarılı bir şekilde tespit edilmesi için gerekli olan eksik elemanlar nedeniyle hedeflenen gen lokusunun ikinci (veya daha fazla) kopyalarının tespitini engelleyecek "görünmez mutasyonlar" barındırabileceği durumlar olabilir. Bu, fonksiyonel tahliller yapmadan önce homozigot null CRISPR hücre hatlarının bağımsız yöntemler (yani qRT-PCR, northern blot, WGS) kullanılarak doğrulanmasının önemini vurgulamaktadır. Son olarak, bu protokol sadece birbirine bitişik olarak eşlenen miRNA kümesi kombinasyonlarını ortadan kaldırmak için tasarlanmıştır. Bir araştırmacı diğer miRNA genleri arasında ayrılmış miRNA'ları yok etmek isterse, dikkatli genotipleme ve doğrulama gerektiren çoklu CRISPR transfeksiyon turlarına ihtiyaç duyulacaktır.

Bu zorluklara rağmen, bu tarif edilen protokolü kullanarak herhangi bir miRNA kümesi için eksiksiz bir miRNA delesyon kombinasyonları panelini hızlı bir şekilde oluşturma yeteneği, miRNA araştırma araç kutusundaki mevcut yöntemlere göre büyük bir avantajdır. Kodlamayan RNA fonksiyonunu karakterize etmek için miRNA taklitlerini kullanan aşırı ekspresyon çalışmaları, kasıtsız artefaktlara veya hücre toksisitelerine yol açabilir. Benzer şekilde, fonksiyon kaybı fenotiplerini belirlemek için antisens antimir oligonükleotid inhibitörlerinin kullanılması zor olabilir, çünkü antimirler genellikle miRNA aktivitesinin tamamen ortadan kaldırılmasına değil, bir yıkıma neden olur. MiRNA küme ağı sinyallemesini aydınlatmak için miRNA taklitlerinin veya miRNA antimiklerinin kombinasyonlarını kullanmaya çalışmanın zahmetli ve yorumlanması zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, CRISPR gen düzenleme teknolojisinin miRNA üyelerinin belirli bir kodlamayan genomik küme içinde nasıl etkileşime girdiğini sorgulamaya yönelik olarak dahil edilmesi, araştırmacıların kodlamayan RNA'ların hastalık sinyal yollarını nasıl etkilediğine dair daha net bir anlayış kazanmalarını sağlayacak ve teşhis ve ilaç keşif alanlarında büyük etkileri olacağını vaat edecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

PC3-ML hücre hatları Mark Stearn (Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi) tarafından sağlanmıştır. Justin Toxey PCR genotiplemesine yardımcı oldu. Bu çalışma, AE-K'ya bir Breedan Adams Vakfı Hibesi, bir Ryan Translasyonel Araştırma Fonu ve bir Commonwealth Sağlık Araştırma Kurulu Hibesi (CHRB-274-11-20) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap Fisher 14-230-225 Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Seal-Rite 1615-5500 Plasticware
24-well tissue culture plate Corning Costar  09761146 Plasticware
5x Phusion HF Buffer Thermo Scientific F-518L PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate Fisher FB012927 Plasticware
96-well tissue culture plate Falcon 08-772-2C Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal AbCam ab191468 Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062 Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine National Center for Biotechnology Information NA Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes Calbiochem CAS 589205 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter Invitrogen A50298 Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes Thermo Scientific 50001012 Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool Horizon Discovery Ltd. NA Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 Dharmacon, Inc. T-2002-02 Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher  BP231100 Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10013CV Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution Sigma-Aldrich D3072-1ML CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed Dharmacon, Inc. U-002005-20 CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		 Dharmacon, Inc. crRNA-460XXX CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL Dharmacon, Inc. VCAS11227 CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer Ensembl NA Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal Santa Cruz Biotechnology sc25778 Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit IBI Scientific IB47010 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified Gibco 16000044 Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide MilliporeSigma H9268 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane MilliporeSigma IPFL10100 Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer LI-COR 927-60001 Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 926-68070 Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 926-32211 Western blot reagent
Microcentrifuge Eppendorf  5425 R Plasticware
miRBase microRNA viewer miRBase NA Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well Invitrogen NP0321BOX Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System LI-COR CLx Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System Owl D2-BP Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) Integrated DNA Technology NA PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Scientific F530S PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x MilliporeSigma 20-188 Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade Invitrogen 25530049 PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) Thermo Scientific EN0531 PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium Gibco MT10041CV Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer Snap Gene NA Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12563029 Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler ThermoFisher Scientific 4375305 Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System Invitrogen EI0001 Equipment; Protein gel electrophoresis system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com). , Available from: https://www.snapgene.com (2022).
  20. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI). , Available from: https://www.ensembl.org (2022).
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory). , Available from: https://www.mirbase.org (2022).
  23. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon). , Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022).
  24. Tools for Guide Design and Off-Target Prediction (MIT CRISPR Design Tool from the Zhang Lab). , Available from: http://crispr.mit.edu (2022).
  25. Sangsu Bae, J. P., Kim, J. -S. Cas-OFFinder (from Sangsu Bae, Jeongbin Park, Jin-Soo Kim). , Available from: http://www.rgenome.net/cas-offinder/ (2022).
  26. Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center). , Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022).
  27. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  28. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents. , Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022).
  29. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  30. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  31. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  32. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Tags

Biyoloji Sayı 182 CRISPR indüklenebilir Cas9 mikroRNA nakavtı miR-888 kümesi
MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, C., Quan, L., Yi, G.,… More

Chambers, C., Quan, L., Yi, G., Esquela-Kerscher, A. CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63704, doi:10.3791/63704 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter