Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

أداة تحرير الجينات كريسبر لتحليل الشبكة العنقودية MicroRNA

Published: April 25, 2022 doi: 10.3791/63704
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

Summary

يصف هذا البروتوكول سير عمل التحرير الجيني للتحرير الجيني للتكرار الباليندرومي القصير (CRISPR) عالي الإنتاجية المتجمع بانتظام لتحليل شبكة مجموعة microRNA التي تسمح بالتوليد السريع للوحة من خطوط الخلايا المعدلة وراثيا التي تحمل مجموعات فريدة من نوعها لحذف أعضاء مجموعة miRNA بحجم 35 كيلو بايت في تجربة واحدة.

Abstract

ظهرت MicroRNAs (miRNAs) كمنظمات خلوية مهمة (مثبطات الورم ، العوامل المؤيدة للأورام) للسرطان والانبثاث. تركز معظم الدراسات المنشورة على الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNA) واحد عند توصيف دور الحمض النووي الريبي الصغير في السرطان. ومع ذلك ، يتم تنظيم حوالي 30٪ من جينات miRNA البشرية في وحدات مجمعة غالبا ما يتم التعبير عنها بشكل مشترك ، مما يشير إلى نظام معقد ومنسق لتنظيم الحمض النووي الريبي غير المشفر. هناك حاجة إلى توضيح أكثر وضوحا لكيفية عمل شبكات الحمض النووي الريبوزي المرسال المتجمعة بشكل تعاوني لتنظيم نمو الورم وعدوانية السرطان ومقاومة الأدوية قبل ترجمة الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر إلى العيادة.

تم استخدام إجراء تحرير الجينات بوساطة التكرار الجيني بوساطة (كريسبر) عالي الإنتاجية المتجمع بانتظام لدراسة الدور الورمي لمجموعة جينومية من سبعة جينات miRNA تقع داخل موضع يمتد طوله ~ 35000 نقطة أساس في سياق سرطان البروستاتا. ومن أجل هذا النهج، أصيبت خطوط الخلايا السرطانية البشرية بناقل فيروس لينتي لنواكيز كاس9 المستحثة بالدوكسيسيكلين (DOX) المزروع في وسط يحتوي على DOX لمدة 48 ساعة. تم نقل الخلايا لاحقا مع الحمض النووي الريبي (tracrRNA) المنشط اصطناعيا (tracrRNA) المعقد مع أوليغونوكليوتيدات كريسبر RNA (crRNA) الخاصة بالموقع الجيني للسماح بالتوليد السريع لخطوط الخلايا السرطانية التي تحمل الحذف الكامل لمجموعة miRNA وحذف مجموعة جين miRNA الفردية أو المركبة في تجربة واحدة.

تتمثل مزايا نظام تحرير الجينات عالي الإنتاجية هذا في القدرة على تجنب الاستنساخ الفرعي لناقلات الحمض النووي الذي يستغرق وقتا طويلا ، والمرونة في نقل الخلايا باستخدام مجموعات RNA الإرشادية الفريدة بتنسيق 24 بئرا ، والتنميط الجيني PCR منخفض التكلفة باستخدام lysates الخلايا الخام. تعد الدراسات التي تستخدم هذا النهج المبسط بالكشف عن التكرار الوظيفي والتفاعلات التآزرية / العدائية بين أعضاء مجموعة miRNA ، مما سيساعد في توصيف شبكات الحمض النووي الريبي الصغيرة المعقدة غير المشفرة المشاركة في الأمراض البشرية وإبلاغ التصميم العلاجي المستقبلي بشكل أفضل.

Introduction

هناك حاجة إلى أدوات بحث أفضل للتحقيق في مساهمة الحمض النووي الريبي غير المشفر في الأمراض البشرية. غالبا ما يلاحظ خلل تنظيم الحمض النووي الريبوزي المرسال في الاضطرابات البشرية مثل السرطان عند مقارنة ملامح التعبير عن هذه الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة في الأنسجة وسوائل الجسم (مثل الدم والبول) لمرضى السرطان مقابل غير السرطان ، والأفراد الأصحاء ، واستخدام المصفوفات الدقيقة ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) ، والجيل التالي من تقنيات التسلسل العميق 1,2 . وقد ميزت الأبحاث الحديثة مجموعة فرعية كبيرة من هذه الحمض النووي الريبوزي المرسال كمثبطات للورم والأورام وعوامل الانبثاث التي تتحكم في تكوين الورم وتطور المرض ومقاومة الأدوية. يؤدي الإفراط التجريبي في التعبير و / أو انخفاض / فقدان الحمض النووي الريبوزي المرسال إلى عواقب وظيفية وتعدد الأضلاع في الخلية ، مما يعكس مجموعة واسعة من الأنشطة المرتبطة بالسرطان التي تنسقها هذه الحمض النووي الريبي غير المشفر - النمو ، موت الخلايا المبرمج ، التمايز ، إعادة تشكيل الكروماتين ، تكوين الأوعية الدموية ، الظهارية إلى الوسيطة (EMT) وتحولات MET ، التمثيل الغذائي ، والاستجابة المناعية3.

يتم ترميز MiRNAs كجينات مفردة أو موجودة في مجموعات جينومية ، والتي يتم نسخها في النواة ومعالجتها على نطاق واسع قبل توليد أنواع miRNA الناضجة بيولوجيا ، أحادية الخيط ~ 22 miRNA (nt) المترجمة في السيتوبلازم4. تمارس هذه الحمض النووي الريبي الصغيرة آثارها بعد النسخ وتعمل كمنظمات جينية سلبية ترتبط بأهداف الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) بطريقة محددة التسلسل لجلب مجمع إسكات الحمض النووي الريبي الحفاز الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) إلى موقع mRNA ، مما يؤدي إلى تدهور mRNA و / أو كتلة في ترجمة البروتين. MiRNAs هي فئة وفيرة للغاية من الحمض النووي الريبي غير المشفر في الأنظمة الحيوانية ، ويوجد 2,654 miRNAs ناضجة في الجينوم البشري (miRBase release 22.1)5. ترتبط MiRNAs عادة بالتكامل غير الكامل مع أهداف الحمض النووي الريبوزي المرسال4. لذلك ، يمكن ل miRNA واحد تنظيم عشرات إلى مئات من أهداف mRNA المتميزة والتأثير وظيفيا على مجموعة كبيرة من المسارات البيولوجية. ولزيادة تعقيد الآليات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال، يمكن تنظيم الحمض النووي الريبوزي المرسال الواحد بواسطة الحمض النووي الريبوزي المرسال المتعدد والمتميز. وبالتالي ، من الصعب التحقيق في كيفية تعطيل خلل تنظيم miRNA للتوازن الاستتبابي في الجسم ويؤدي إلى ورم خبيث بشري.

ركزت غالبية الدراسات المنشورة على الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNA) واحد عند توصيف دورها في أحداث المرض. ومع ذلك ، يتم تنظيم ~ 30٪ من جينات miRNA البشرية في وحدات مجمعة (عادة ~ 10 كيلوقاعدة [kb]) والتي غالبا ما يتم نسخها في نفس الاتجاه والتعبير المشترك عنها ، مما يشير إلى نظام منسق ومعقد من تنظيم الحمض النووي الريبي غير المشفر6. أكبر مجموعة miRNA البشرية متعددة الرؤوس هي مجموعة 14q32 التي تضم 54 سلائف miRNA. واحدة من وحدات الحمض النووي الريبوزي المرسال العنقودي الأكثر دراسة المرتبطة بالسرطانات البشرية هي مجموعة miR-17-92 polycistronic التي تتكون من miR-17 و miR-18a و miR-19a و miR-20a و miR-19b-1 و miR-92-1 المقيمة داخل intron 3 من الحمض النووي الريبي غير المشفر ، c13orf25. غالبا ما يتم تضخيم مجموعة miR-17-92 في الأورام الخبيثة المكونة للدم والإفراط في التعبير عنها في الأورام الصلبة وقد أنشأت أدوارا ورمية المنشأ في تعزيز تطور دورة الخلية ، موت الخلايا المبرمج ، وتكوين الأوعيةالدموية 7. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتم حذف مجموعة miR-15a و miR-16-1 القمعية للورم الموجودة داخل مقدمة الجين غير المشفر Leu2 في سرطان الدم وتقليل تنظيمها في مجموعة كبيرة من السرطانات ، وتعمل على منع نمو الورم من خلال استهداف الجين المضاد للاستماتة BCL2 وجينات تطور دورة الخلية الإضافية8. مجموعة miR-888 مرتفعة في المرضى الذين يعانون من سرطان البروستاتا عالي الجودة وتتكون من سبعة جينات miRNA (miR-892c و -890 و -888 و -892a و -892b و -891b و -891a) تقع على الكروموسوم البشري Xq27.3 9,10.

الخرائط العنقودية miR-888 داخل موضع HPCX1 (سرطان البروستاتا الوراثي ، X-linked 1) التي تمتد عبر Xq27-2 ، والتي تم تحديدها من خلال تحليل الارتباط لنسب عائلة سرطان البروستاتا الوراثية11،12،13،14،15،29. أشار التوصيف الوظيفي للأعضاء الفرديين المتجمعين في miR-888 باستخدام أدوات التعبير الخاطئ التقليدية miRNA - miRNA يحاكي ومثبطات antisense - إلى أن هذه miRNAs تلعب أدوارا متداخلة في تنظيم نمو ورم البروستاتا وغزوه 9,10. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق التجريبية لا تصلح بسهولة لدراسة كيفية تصرف العديد من أعضاء miR-888 المتجمعين بشكل تآزري أو عدائي في شبكة RNA غير المشفرة للتحكم في توازن الأنسجة وتطور السرطان. تم تعديل هذا البروتوكول المبسط الموصوف باستخدام تقنية تحرير الجينات كريسبر عالية الإنتاجية لتشريح مجموعات الحمض النووي الريبوزي المرسال المرتبطة بالسرطانات البشرية (على سبيل المثال، مجموعة miR-888) لسد هذه الفجوة المعرفية.

تتوسط جينات كريسبر البكتيرية وجينات كريسبر المرتبطة (كاس) المناعة التكيفية ضد العاثيات البكتيرية16. تم تكييف اكتشاف نظام المراقبة البدائية القديم هذا بسرعة كأداة علمية فعالة لاستهداف أي موضع جينومي مرغوب فيه بسهولة وإجراء تعديلات في تسلسل الحمض النووي داخل مجموعة كبيرة من الأنظمة الحيوانية وأنواع الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي16,17. هذه التقنية تبشر بخير كبير كوسيلة فعالة لاستجواب شبكات الحمض النووي الريبوزي المرسال في سياق الأمراض البشرية. تحقيقا لهذه الغاية ، تم بناء بروتوكول تحرير الجينات CRISPR عالي الإنتاجية لدراسة مجموعة miR-888 التي تمتد إلى ~ 35 كيلو بايت على الكروموسوم البشري X في خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية المخلدة (LNCaP ، PC3-ML) لاستجواب كيفية تنسيق أعضاء المجموعة لمسارات تطور السرطان. يمكن تطبيق هذا النهج لتوصيف أي مجموعة miRNA ويسمح للباحثين بتوليد خطوط خلايا بشرية بسرعة تحمل حذف مجموعة miRNA بالكامل وحذف مجموعة جين miRNA الفردية والمركبة في تجربة واحدة.

في هذا الإجراء ، يتم إنشاء خطوط خلوية مستقرة تحمل نظام تعبير فيروسي مضاد للدوكسيسيكلين (DOX) يمكن الباحث من التحكم في المكورات العقدية المقيحة المرتبطة ب CRISPR endonuclease Cas9 (csn1) من خلال المروج التأسيسي المستحث DOX TRE3G. يتضمن نظام Tet-On 3G ثنائي الأطراف عامل استطالة بشري تأسيسي 1 ألفا (hEF1alpha) مروج لدفع نسخ كل من جين Tet-On 3G وجين مقاومة البلاستيسيدين (BlastR) كنسخة ثنائية الشكل. يرتبط بروتين Tet-On 3G transactivator فقط بمروج TRE3G في وجود DOX ، مما يؤدي إلى نسخ Cas9 قوي. في غياب DOX ، لا يوجد تعبير Cas9 قاعدي أو الحد الأدنى جدا. لذلك ، يمكن للباحث تحفيز إنتاج بروتين Cas9 العالي في الخلايا المزروعة في الوسائط المكملة ب DOX خلال خطوات تحرير الجينات CRISPR والتحكم في إزالة بروتين CAS9 السريع عند انسحاب DOX.

يصف هذا البروتوكول أيضا تصميم أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الاصطناعية كريسبر (crRNA) التي تستهدف المناطق المحيطة بمجموعة miRNA بأكملها ، ومناطق دبوس شعر miRNA الفردية (premiRNA) ، و / أو مجموعات فرعية من جينات miRNA داخل المجموعة. يحتوي كل CRRNA مصمم على تسلسل إرشادي فريد من نوعه 5'-terminal 20 nt (مكمل للتسلسل الجينومي الذي يجب استهدافه) ، متبوعا بتسلسل تكرار ثابت 22 nt S. pyogenes (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') الذي يتيح الاقتران الأساسي مع أوليغونوكليوتيدات CRISPR RNA (tracrRNA) العالمية المنشطة18. معا ، يعمل crRNA الملدن و tracrRNA (نسبة مختلطة 1: 1) كدليل الحمض النووي الريبي لهذا البروتوكول (الشكل 1A). في كل تجربة، يتم نقل اثنين من الحمض النووي الريبي المرشد الاصطناعي إلى الخلايا التي يسببها DOX لربط ومرافقة بروتين Cas9 البكتيري إلى مواقع الحمض النووي الجينومي (5 و 3 بوصة) المحيطة بمنطقة عنقود miRNA المستهدفة للإزالة (الشكل 1B).

يجب أن يكون تسلسل الزخارف المتجاور (PAM) (5'-NGG-3' للنوع البري S. pyogenes Cas9) موجودا في جينوم الخلية ويقع مباشرة بجوار تسلسل الحمض النووي 20 nt المستهدف بواسطة RNA17 الدليلي. يعمل تسلسل PAM كإشارة ربط ويضع المنطقة الحفازة لإنزيم endonuclease Cas9 على موقع الحمض النووي الجيني المستهدف ، مما يؤدي لاحقا إلى انقسام الحمض النووي الموجه والمزدوج (ds) الموجود ~ 3 nt في المنبع من PAM. تقوم آلية إصلاح الحمض النووي للخلية بإصلاح نهايات الحمض النووي المشقوق ، مما قد يؤدي إلى ربط مثالي ، ولكن غالبا ما يحدث انضمام نهاية غير متماثل (NHEJ) ، مما يتسبب في عمليات إدخال أو حذف صغيرة (indels) في موقع الإصلاح. نظرا لأن miRNAs هي جينات غير مشفرة غالبا ما تقع داخل المناطق الداخلية والداخلية ، فإن هذه الإندلات تحمل مخاطر منخفضة من خلق طفرات غير مرغوب فيها من الهراء / سوء الفهم.

من خلال استخدام أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الاصطناعية (crRNA الملدن و tracrRNA ، نسبة مولية 1: 1) لمجمع الحمض النووي الريبي الموجه في هذه التجارب ، تتجنب استراتيجية الضربة القاضية الجينية هذه الاستنساخ الفرعي لناقلات الحمض النووي التي تستغرق وقتا طويلا وتسمح بمرونة كبيرة في نقل مجموعات الحمض النووي الريبي الإرشادية الفريدة إلى الخلايا بتنسيق 24 بئرا. كما أن تحضير محللات الخلايا الخام لفحص النمط الوراثي ل PCR يتجنب أيضا طرق تنقية الحمض النووي المكلفة والمستهلكة للوقت ، مع السماح بتوليد خط خلية مستعمرة واحدة مبسط وتحليل النمط الظاهري. في الواقع ، تم استخدام بروتوكول تحرير الجينات CRISPR عالي الإنتاجية هذا بنجاح لنقل خطوط خلايا سرطان البروستاتا المستزرعة (LNCaP ، PC3-ML) مع 32 تركيبة RNA إرشادية فريدة في تجربة واحدة وإنشاء خطوط خروج المغلوب تحمل عمليات حذف لكامل منطقة الكتلة miR-888 ~ 35 كيلو بايت ؛ مجموعات حذف أصغر لأعضاء مجموعة miR-888 الذين ينتمون إلى عائلتي miR-743 و miR-891a ؛ بالإضافة إلى عمليات الحذف لأعضاء miRNA الفرديين داخل مجموعة miR-888. ستوفر مثل هذه الدراسات توضيحا أوضح لكيفية عمل الحمض النووي الريبوزي المرسال المتجمع بشكل تعاوني لتنظيم نمو الورم والعدوانية ومقاومة الأدوية قبل ترجمة الحمض النووي الريبوزي المرسال إلى العيادة كأدوات علاجية وتشخيصية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التحضير لتحرير الجينات كريسبر وتوجيه تصميم الحمض النووي الريبي لتوليد خطوط الخلايا القاضية العنقودية miRNA

  1. قم بإنشاء ملف DNA يحتوي على التسلسل الجينومي الكامل لمنطقة مجموعة miRNA ذات الأهمية (intergenic ، intronic) وما لا يقل عن 1 كيلو بايت من المناطق الجينومية المحيطة باستخدام برنامج التعليق التوضيحي لتسلسل الحمض النووي19.
    1. استخدم أداة تحرير المعالم في ملف الحمض النووي الذي تم إنشاؤه لوضع علامة على موضع مجموعة miRNA المستهدفة (intergenic ، intronic) وكل تسلسل فردي من دبوس شعر miRNA ينتمي إلى مجموعة miRNA ، بالإضافة إلى تدوين الجينات المشفرة وغير المشفرة القريبة الأخرى و / أو الميزات التنظيمية 5,20,21,22.
    2. تأكد من أن مناطق miRNA المستهدفة للحذف لا تعطل عن غير قصد جينات ترميز البروتين القريبة أو الجينات غير المشفرة أو عناصر الحمض النووي التنظيمية المهمة.
      ملاحظة: ضع في اعتبارك التعقيد الجينومي (على سبيل المثال، ازدواجية/اندماجات الكروموسومات) لخط الخلية المستخدم في هذا البروتوكول.
  2. تصميم الحمض النووي الريبوزي المرسال الاصطناعي الذي يستهدف 20 نانوت من تسلسل الحمض النووي الجيني المحيط بمجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNA) بأكملها، ومناطق دبوس شعر الحمض النووي الريبي الريبي (ما قبل الحمض النووي الريبوزي المرسال) الفردية، و/أو مجموعات فرعية من جينات الحمض النووي الريبي المرسال داخل المجموعة باستخدام أداة برمجية لتصميم الحمض النووي الريبي المرسال (دليل المعلوماتية الحيوية) (على سبيل المثال،23). تأكد من تدوين إنزيم Cas9 المناسب في أداة تصميم الحمض النووي الريبي الإرشادية (أي S. pyogenes كاس 9).
    ملاحظة: سيحتوي crRNA المركب على تسلسل دليل 5'-terminal 20 nt الفريد (مكمل لهدف الحمض النووي) متبوعا بثابت 22 nt S. pyogenes كرر التسلسل للسماح بالاقتران القاعدي مع أوليغونوكليوتيد tracrRNA العالمي المركب. بعد صلبها معا ، ستعمل كدليل الحمض النووي الريبي في هذا البروتوكول.
    1. بالرجوع إلى ملف الحمض النووي الذي تم إنشاؤه (الخطوة 1.1) ، أدخل ~ 150 nt من تسلسل الحمض النووي الموجود على الفور في المنبع (5') أو المصب (3') من موقع miRNA hairpin/cluster المستهدف للحذف في أداة برنامج تصميم الحمض النووي الريبي للدليل المعلوماتي الحيوي23.
      ملاحظة: ستحدد أداة التصميم تسلسلات 20 nt الفريدة لتصميم crRNA oligonucleotide التي تقع مباشرة بجوار تسلسل PAM (على شريط الحمض النووي غير المستهدف) (على سبيل المثال ، S. pyogenes Cas9 PAM تسلسل NGG). فيما يلي مثال على تصميم crRNA الذي يستهدف موقعا فوريا في المنبع (5 أقدام) من موضع جين mir-891a (على وجه التحديد 5A ( 891a ) الذي تمت مناقشته في قسم النتائج التمثيلية والجدول 1).
      1. افتح أداة برنامج تصميم الحمض النووي الريبي الإرشادية23.
      2. أدخل الاسم 5A(891a) في النافذة أدخل الاسم .
      3. في النافذة أدخل تسلسل الحمض النووي، أدخل 150 نانوت من التسلسل الجينومي الموجود مباشرة في المنبع (5 أقدام) من جين السلائف mir-891a : 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
        TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTCTTTGTTTTTTTTTTTCTAGGTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. حدد المربع الذي يحمل علامة تمكين التحقق من الخصوصية لاستبعاد المواقع غير المستهدفة التي تم اكتشافها حسابيا بواسطة البرنامج. اختر الكائن الحي المناسب (أي الإنسان [الإنسان العاقل]).
      5. حدد إنزيم Cas9 الصحيح PAM المستخدم في الدراسات ، في هذه الحالة ، العقدية المقيحة Cas9-PAM:NGG ، لإنشاء الإعدادات الافتراضية التالية: PAM بالنسبة إلى الهدف: بعد ؛ تكرار التسلسل: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; نسبة إلى الدليل: 3; طول التسلسل المستهدف: 20; قطع بالنسبة للهدف 5' بداية: Sense 17 Anti-sense 17.
      6. انقر فوق الزر التالي لعرض نتائج تخليق crRNA الاصطناعي.
        ملاحظة: في هذا المثال، سيتعرف الحمض النووي الريبوزي المرسال المقترح تصنيعه على هدف الحمض النووي ATACATGCTGATAGTTACAC وسيكون موجودا بجوار PAM:AGG.
    2. قم بالرجوع إلى ملف الحمض النووي (الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1.1.) لتحديد أفضل تسلسلات هدف crRNA 20 nt المرشحة التي تقع بالقرب من موضع miRNA المراد حذفها وتمتلك أعلى مواصفات للهدف الجينومي المقصود.
      1. استخدام أدوات التحليل الحسابي خارج الاستهداف لتقييم خصوصية الحمض النووي الريبوزي المرسال المرشح والتنبؤ بالمواقع المحتملة خارج الاستهداف في المواقع الجينومية التي لا علاقة لها بمنطقة مجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدفة ذات الأهمية (على سبيل المثال، 24،25،26،27).
      2. سجل النتائج المحتملة خارج الاستهداف للرجوع إليها لاحقا عند التنميط الجيني لخطوط الخلايا النسيلة CRISPR أحادية المستعمرة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (الخطوة 4.2.6).
        ملاحظة: إن مدى تكامل التسلسل المشترك بين أوليغونوكليوتيد crRNA المصمم والتسلسل المستهدف الجينومي سوف يملي كيف يشق إنزيم Cas9 الجينوم بشكل انتقائي في ذلك الموضع. نظرا لأن الحمض النووي الريبي الموجه يتجه إلى الهدف الجيني في اتجاه 3 إلى 5 أقدام ، فإن عدم التطابق في نهاية 5 أقدام من تسلسل هدف الحمض النووي (أول 8-10 قواعد) غالبا ما يمنع الانقسام بوساطة Cas9. إذا كان التسلسل المستهدف الجينومي يشترك في التماثل مع موضع جينومي آخر ، باستثناء القواعد الثماني الأولى لتسلسل الحمض النووي ، فمن المتوقع أن يكون لهذا الحمض النووي الريبي الدليل فرصة منخفضة لعدم الاستهداف في هذا الموقع.
      3. صمم أربعة كرنا RNAs فريدة لكل موضع miRNA مستهدف: اثنان من crRNAs المصممة لاستهداف تسلسلات الحمض النووي التكميلية على الفور 5 'من دبوس الشعر / الكتلة miRNA (5'A ، 5'B) واثنين من crRNAs المصممة لاستهداف تسلسلات الحمض النووي التكميلية على الفور 3' من دبوس الشعر / الكتلة miRNA (3'A ، 3'B).
        ملاحظة: عند إجراء عمليات نقل كريسبر (في القسم 3)، سيتم اختبار أربع مجموعات ممكنة من أزواج الحمض النووي الريبي (5 أقدام و3 بوصات (5 أقدام و3 أ و3 أ و5 أ + 3 ب ب و5 ب + 3 ب ب 5 ب + 3 ب) لكل موضع ميرنا مستهدف لزيادة احتمال توليد عمليات حذف ناجحة لموضع الحمض النووي الريبوزي المرسال في تجربة واحدة.
      4. استخدم أداة تحرير المعالم في ملف الحمض النووي الذي تم إنشاؤه (الخطوة 1.1.) لوضع علامة على تسلسل هدف الحمض النووي (مع PAM المجاور) لكل crRNA مصمم ليتم توليفه.
  3. تصميم وتوليف الاشعال PCR (إلى الأمام والعكس) التي تحيط بمناطق مجموعة miRNA المستهدفة للتنميط الجيني لخطوط خلايا كريسبر (وتسمية الاشعال في ملف الحمض النووي الذي تم إنشاؤه).
    1. بالنسبة لخطوط خلايا التنميط الجيني التي تحمل عمليات حذف جينومية صغيرة ل miRNAs المتجمعة أو الفردية بشكل وثيق ، قم بتصميم الاشعال PCR (إلى الأمام ، العكس) التي تعيش حوالي 150 نقطة أساس على كل جانب من جوانب موقع الانقسام Cas9 / منطقة الضربة القاضية التي ستمكن من اكتشاف كل من النوع البري (~ 600 نقطة أساس) والضربة القاضية (~ 300 نقطة أساس) في تفاعل PCR واحد عبر الرحلان الكهربائي الهلامي.
    2. بالنسبة لخطوط خلايا التنميط الجيني التي تحمل عمليات حذف جينومية كبيرة لمجموعات سلائف miRNA أو مجموعة miRNA بأكملها ، قم مرة أخرى بتصميم التمهيدي PCR (إلى الأمام ، العكس) الذي يقيم حوالي 150 نقطة أساس على كل جانب من جوانب موقع الانقسام / الضربة القاضية Cas9. لاحظ أنه إذا كان حذف مجموعة miRNA المستهدفة يمتد >4 كيلو بايت في الطول ، فمن المحتمل أن يكتشف تفاعل PCR فقط جزء الحمض النووي الأصغر (~ 300 نقطة أساس) ولكن ليس جزء الحمض النووي من النوع البري. لذلك ، قم بتصميم اشعال PCR إضافية (أمامية ، عكسية) يمكنها اكتشاف وجود أو عدم وجود جينات عنقودية miRNA داخلية للمساعدة في عملية الفحص والتحقق من صحة خطوط الخلايا القاضية المتجانسة الزيجوت.

2. توليد خطوط الخلايا المستقرة التي تحمل كاسيت تعبير Cas9 المستحث DOX

ملاحظة: إجراء جميع أعمال زراعة الخلايا والفيروسات في غطاء معتمد للسلامة الأحيائية باستخدام إجراءات BSL2 وتقنية التعقيم.

  1. حدد نوع خط الخلية المناسب لدراسات كريسبر ووسائط النمو المفضلة.
    ملاحظة: تم تطوير هذا البروتوكول لخطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية LNCaP (الوسط المفضل: RPMI، 10٪ مصل البقر الجنيني [FBS]) و PC3-ML (الوسط المفضل: DMEM، 10٪ FBS).
  2. قم بإجراء منحنى "موت" البلاستيسيدين لتحديد تركيز الدواء الأمثل لاختيار الخلايا المصابة بفيروس lentivirus التي تحمل كاسيت جين مقاومة البلاستيسيدين (الخطوة 2.3).
    1. خلايا الصفائح في 11 بئرا من صفيحة 24 بئرا وتنمو عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 في الوسط المفضل حتى تلتقي حوالي 75٪.
    2. تمييع البلاستيسيدين (مخزون العمل 1 ملغم/مل) في الوسط المفضل بتركيز نهائي يتراوح من 0، 1، إلى 10 ميكروغرام/مل ويخفف بزيادات قدرها 1 ميكروغرام/مل.
    3. قم بتسمية آبار لوحة 24 بئرا البذرية من 1 إلى 11. إزالة وسط النمو من الآبار واستبداله بتركيزات البلاستيسيدين المناسبة.
    4. تغيير الوسط مع تركيزات البلاستيسيدين المناسبة كل يوم لمدة 7-10 أيام.
    5. فحص الخلايا يوميا خلال الدورة الزمنية وتحديد الحد الأدنى لتركيز البلاستيسيدين المطلوب لقتل جميع الخلايا في غضون 5-7 أيام.
      ملاحظة: يجب إجراء منحنى "قتل" البلاستيسيدين لكل خط خلية محدد يستخدم في تجارب تحرير الجينات كريسبر.
  3. إصابة الخلايا بفيروس lentivirus الذي يحمل كاسيت تعبير Cas9 المستحث DOX وإجراء اختيار blasticidin باستخدام التركيز الأمثل المحدد في الخطوة 2.2.
    1. في ثلاثة آبار من صفيحة من 6 آبار ، البذور 5 × 104 خلايا لكل بئر وتنمو في الوسط المفضل عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 بين عشية وضحاها (ON).
    2. في اليوم التالي ، قم بإذابة ناقل تعبير lentivirus ل Cas9 المستحث DOX (Lenti-iCas9) على الجليد. اخلط بلطف (لا تخلط جزيئات الفيروس).
      ملاحظة: قم بتخزين الفيروس في الأليكوتات عند -80 درجة مئوية لتجنب دورات التجميد / الذوبان المتعددة ، مما يقلل من العيار الفيروسي وكفاءة العدوى.
    3. احسب الحجم اللازم لنقل 5 × 104 خلايا مصابة بالفيروس عند تعدد العدوى 0.3 (MOI = 0.3) بناء على تركيز عيار الفيروس.
    4. ويتحول حجم الفيروس المناسب إلى 250 ميكرولتر (لكل بئر) من الوسط المفضل الخالي من المصل والمضادات الحيوية المكمل ببروميد سداسي أديميثرين 0.8 ميكروغرام/مل. اخلطي بلطف.
      ملاحظة: بروميد هيكساديميثرين هو بوليمر كاتيوني وجد أنه يزيد من الامتزاز الفيروسي وكفاءة العدوى.
    5. قم بإزالة الوسيط. أضف 250 ميكرولتر من وسط النقل المحضر مع فيروس Lenti-iCas9 (MOI = 0.3) إلى الخلايا واحتضن ON عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. (تقصير وقت الحضانة إلى 4-6 ساعات إذا أظهرت الخلايا تأثيرات سامة مرتبطة بالفيروس.)
    6. استبدل الوسط بوسط مفضل طازج واسمح للخلايا بالتعافي لمدة 1-2 أيام.
    7. قم بإجراء اختيار البلاستيسيدين على الخلايا المصابة لمدة 10-14 يوما باستخدام تركيز البلاستسيدين الأمثل المشتق من منحنى "القتل" الموضح في الخطوة 2.2.
      1. في موازاة ذلك ، تنمو الخلايا غير المصابة في وسط مع تركيز البلاستسيدين الأمثل لاستخدامها كعنصر تحكم إيجابي للانتقاء الفيروسي.
    8. تغيير الوسط المكمل بتركيز البلاستيسيدين الأمثل كل 3 أيام خلال دورة وقت الاختيار لإزالة الخلايا الميتة.
      ملاحظة: فقط الخلايا التي تنجو من اختيار البلاستيسيدين ستكون قد دمجت الناقل الفيروسي اللئيم.
    9. قم بتوسيع خطوط خلايا Lenti-iCas9 المحددة من قبل البلاستيسيدين.
      ملاحظة: قم بتسجيل رقم مرور الخلية عند كل توسيع.
      1. قم بتجميد جزء من خلايا Lenti-iCas9 في الوسط المفضل المكمل بنسبة 10٪ من ثاني أكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) للتخزين المبرد على المدى الطويل.
      2. قم بتحليل جزء من خلايا Lenti-iCas9 بواسطة اللطخة الغربية9 لتحديد خط الخلية الذي يعرض أقوى مستويات بروتين Cas9 المستحث ل DOX (انظر الخطوة 2.3).
  4. قم بإجراء منحنى تركيز الدوكسيسيكلين على خطوط خلايا Lenti-iCas9 المنشأة حديثا لتحديد الظروف المثلى لتحريض بروتين Cas9.
    1. قم بإعداد أربعة ألواح مستقلة من 6 آبار لكل خط خلية تم اختباره لتنفيذ دورة وقت تركيز DOX هذه. لوحة 5 × 104 خلايا لكل بئر من كل لوحة 6 آبار وتنمو عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 في الوسط المفضل لمدة 24 ساعة.
    2. تمييع DOX (مخزون عامل 1 ملغم / مل) في الوسط المفضل مع منحنى تركيز DOX نهائي يتراوح من 0 و 50 و 100 و 150 و 250 إلى 500 نانوغرام / مل.
    3. قم بتسمية آبار كل طبق من 6 آبار مبذرة من 1 إلى 6. قم بإزالة الوسط واستبدله بتركيزات DOX المناسبة. تنمو الألواح 1-4 حتى النقاط الزمنية التالية: 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة DOX الحث ؛ و 120 ساعة بعد انسحاب DOX (في البداية 72 ساعة DOX المستحثة).
    4. حصاد آبار الصفيحة في كل نقطة زمنية باستخدام الطرق المناسبة (على سبيل المثال ، التربسين). تخزين كريات الخلايا في -80 درجة مئوية. قم بمعالجة كريات الخلايا في مخزن RIPA المؤقت لعزل الليزات وتحليل اللطخة الغربية Cas9.
      1. قم بتشغيل 40 ميكروغرام من محللات الخلايا لكل عينة من دورة DOX-induction الزمنية باستخدام جل Bis-Tris الذي يعمل على تغيير الطبيعة بنسبة 4٪ -12٪ ونقل البروتينات إلى غشاء اللطخة المناعية.
      2. قم بتهجين غشاء اللطخة المناعية بجسم مضاد أساسي ضد Cas9 للكشف عن بروتين 160 kDa. تطبيع مستويات Cas9 باستخدام جين التدبير المنزلي مثل GAPDH (37 kDa).
    5. استنادا إلى نتائج اللطخة الغربية، حدد تركيز DOX الأمثل لتحفيز Cas9 في خطوط خلايا Lenti-iCas9.
      ملاحظة: ستكشف هذه الدورة التدريبية أيضا عن مدى إحكام تنظيم تعبير Cas9 عند إزالة DOX بعد 120 ساعة.
    6. أنشئ مستعمرات أحادية الخلية لخطوط خلايا Lenti-iCas9 التي تظهر تعبيرا قويا عن بروتين Cas9 لتحسين تحويلات CRISPR (في القسم 3).

3. إجراء تفاعلات كريسبر عن طريق تحريض Cas9 ونقل الحمض النووي الريبي الموجه الاصطناعي للخلايا باستخدام تنسيق عالي الإنتاجية

ملاحظة: يظهر رسم تخطيطي لسير العمل في الشكل 1.

  1. على الورق ، قم برسم مجموعات زوج crRNA التي سيتم نقلها إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا تستهدف مجموعة miRNA بأكملها ، ومجموعات جينات miRNA المجمعة المختلفة ، بالإضافة إلى أعضاء مجموعة miRNA الفردية.
    1. على الخريطة ، قم بتسمية أربعة آبار لكل موضع miRNA مستهدف. اجعل كل بئر يمثل تفاعل نقل ، مع اثنين من الحمض النووي الريبوزي المرسال الفريد من نوعه في وضع 5 و 3 بوصة من الموضع الجينومي الضربة القاضية miRNA المطلوب و tracrRNA (نسبة مولية ملدنة 1: 1).
    2. تأكد من أن كل بئر من الآبار الأربعة المصنفة تمثل زوجا فريدا من CRRNA للنقل (على سبيل المثال ، 5'A + 3'A ؛ 5'A + 3'B ؛ 5'B + 3'A ؛ 5'B + 3'B).
      ملاحظة: يتيح تصميم اثنين من الحمض النووي الريبوزي المرسال 5 أقدام واثنين من الحمض النووي الريبوزي المرسال 3 أقدام يحيط بكل موضع مستهدف من الحمض النووي الريبوزي المرسال (القسم 1) توليد أربعة أزواج ممكنة من الحمض النووي الريبي الإرشادي 5 و 3 أقدام في تفاعل النقل.
  2. قم بلوحة خط خلية Lenti-iCas9 عند 5 × 10 4 خلايا/بئر من صفيحة ذات 24 بئرا في الوسط المفضل الذي يحتوي على تركيز DOX الأمثل (المحدد في الخطوة2.4 ). تنمو الخلايا لمدة 24-48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 للحث على التعبير عن بروتين Cas9.
  3. قم بنقل خلايا Lenti-iCas9 باستخدام الحمض النووي الريبي الإرشادي 5 و 3 بوصة.
    1. إعادة تشكيل crRNA المركب و tracrRNA oligonucleotides مع الماء الخالي من النوكليز إلى تركيز مخزون قدره 10 ميكرومتر.
    2. قم بتسمية أربعة أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لكل موضع miRNA مستهدف استنادا إلى الخريطة التجريبية المصممة في الخطوة 3.1 ، والتي تمثل مجموعات أزواج crRNA الأربعة المحتملة 5 و 3 بوصات (5 'A + 3'A ؛ 5'A + 3'B ؛ 5'B + 3'A ؛ 5'B + 3'B).
    3. في كل أنبوب، امزج نسبة مولية 1:1 من tracrRNA و crRNAs الفريدة (5 أقدام و 3 بوصات) معا لتشكيل مركب الحمض النووي الريبي الموجه 2 ميكرومتر باستخدام التفاعل التالي (الحجم النهائي 10 ميكرولتر):
      1. أضف 2.5 ميكرولتر من tracrRNA (مخزون 10 ميكرومتر) ، و 1.25 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المرسال 5 '(10 ميكرومتر) ، و 1.25 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المرسال 3 ' (10 ميكرومتر من المخزون) ، و 5 ميكرولتر من 10 mM tris-HCL الرقم الهيدروجيني 7.5 إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 مل. جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 30 ثانية عند 16000 × غرام للخلط. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
    4. يضاف إلى كل أنبوب، 40 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض (على سبيل المثال، Opti-MEM) إلى 10 ميكرولتر من تفاعل الحمض النووي الريبي المعقد الموجه (الحجم الإجمالي 50 ميكرولتر). اخلطي بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
    5. في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 مل، امزج 2 ميكرولتر من كاشف النقل28 (انظر الملاحظة 3.3.5.1) و48 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض (على سبيل المثال، Opti-MEM، الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولتر) بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
      1. قم بإعداد مزيج رئيسي من كاشف النقل عن طريق ضرب الكاشف (2 ميكرولتر) وتقليل وسط المصل (على سبيل المثال ، Opti-MEM ، 48 ميكرولتر) بعدد الآبار المراد نقلها ، بالإضافة إلى حجم إضافي بنسبة 10٪ لحساب عدم دقة السحب الطفيفة.
        ملاحظة: حدد كاشف نقل تم تحسينه لعمليات نقل الحمض النووي الريبي الصغيرة والحمض النووي الريبي CRISPR oligonucleotide، وكذلك لنوع خط الخلية28.
    6. إلى كل أنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي الريبي الموجه (من الخطوة 3.3.4) ، أضف 50 ميكرولتر من كاشف النقل المخفف (من الخطوة 3.3.5). ضع الخليط ببطء لأعلى ولأسفل مرة واحدة للخلط. احتضان في RT لمدة 20 دقيقة.
    7. أضف 400 ميكرولتر من الوسط الخالي من المضادات الحيوية المكمل ب DOX (التركيز الأمثل) إلى كل أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي الريبي / النقل التوجيهي. Pipet بلطف للخلط.
  4. قم بإزالة الوسط من خلايا Lenti-iCas9 المستحثة ب DOX (الخطوة 3.2). أضف 500 ميكرولتر من مزيج الوسائط / DOX / دليل الحمض النووي الريبي / النقل استنادا إلى الخريطة التجريبية للوحة المكونة من 24 بئرا (الخطوة 3.1). احتضن الخلايا المنقولة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  5. استبدل الوسط بالوسيط المفضل الطازج بدون DOX (لإزالة بروتين Cas9 من الخلايا). اسمح للخلايا بالتعافي لمدة 24-48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  6. حصاد الخلايا المنقولة (التربسينات) والاستعداد للتنميط الجيني وتخفيف الخلية الواحدة.
    ملاحظة: تمثل الخلايا مجموعة مختلطة تحتوي على خلايا من النوع البري منقولة جينيا من كريسبر وغير منقولة. ستحدد هذه الخطوة كفاءة تحرير كريسبر قبل استثمار الوقت/الموارد في توسيع مستعمرة الخلية الواحدة.
    1. اغسل الخلايا 1x ب 1 مل من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS). احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من التربسين لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي نظيف 1.5 مل يحتوي على 1 مل من الوسط.
    2. قم بعكس الخلايا لمزجها وطردها المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة الوسط وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من PBS.
    3. الطرد المركزي الدقيق الخلايا المغسولة لمدة 5 دقائق عند 200 × غرام عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة PBS وإعادة تعليق بيليه الخلية في 150 ميكرولتر من الوسط المفضل.
  7. حدد عدد الخلايا لكل ميكرولتر من 150 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها باستخدام مقياس الدم أو أداة عد الخلايا الآلية.
  8. افصل 150 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها إلى ثلاثة أجزاء.
    1. قم بتجميد 1/3 من الخلايا المنقولة (50 ميكرولتر) في متوسطة بالإضافة إلى 10٪ DMSO (الحجم النهائي 150 ميكرولتر) في cryovials للتوسع المستقبلي / التخزين طويل الأجل.
    2. نقل 1/3 من الخلايا المنقولة (50 ميكرولتر) إلى أنبوب PCR نظيف 0.2 مل للتنميط الجيني.
      1. الطرد المركزي الدقيق للخلايا لمدة 5 دقائق في 200 × غرام عند 4 درجات مئوية وإزالة الوسط.
      2. أعد تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من PBS.
      3. الطرد المركزي الدقيق للخلايا لمدة 5 دقائق في 200 × غرام عند 4 درجات مئوية وإزالة PBS. تخزين كريات الخلايا المختلطة على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية.
      4. معالجة بيليه الخلية للتنميط الجيني باستخدام سير العمل في القسم 4.
    3. قم بإعداد 1/3 النهائي من الخلايا (50 ميكرولتر) للتخفيف والطلاء في شكل لوحة 96 بئرا لتوليد مستعمرات أحادية الخلية.
      1. استنادا إلى عدد الخلايا في الخطوة 3.7.، احسب التخفيفات المطلوبة لتحقيق 10 و 5 و 2 و 1 خلية (خلايا) في 100 ميكرولتر من الوسط لكل بئر من صفيحة 96 بئرا.
      2. باستخدام ماصة متعددة القنوات من 12 قناة وخزان كاشف معقم ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة لكل بئر إلى صفيفين من الصفيحة (إجمالي 24 بئرا) لكل تخفيف (10 أو 5 أو 2 أو خلية واحدة لكل بئر). اسمح ب 4-6 أسابيع حتى تنمو الخلايا إلى التقاء لتوسيع مستعمرة الخلية الواحدة. راقب الخلايا أسبوعيا تحت المجهر الضوئي ولاحظ ما إذا كانت المستعمرات تمثل مستعمرات أحادية أو متعددة الخلايا.
      3. جمع ~ 10-15 مستعمرات أحادية الخلية للتنميط الجيني (القسم 4). حدد على الأقل ثلاثة خطوط مستعمرة مستقلة أحادية الخلية لكل موضع miRNA مستهدف. احتفظ بخطوط أحادية الخلية من النوع البري كعناصر تحكم.
        ملاحظة: يعتمد رقم الفحص على نوع خط الخلية وتأثير النمط الظاهري للضربة القاضية miRNA على نمو الخلية / قابليتها للحياة.

4. التنميط الجيني PCR لخطوط خلايا كريسبر باستخدام محللات الخلايا الخام

  1. حصاد مستعمرات فردية أحادية الخلية من آبار شبه ملتحقة بلوحة من 96 بئرا.
    ملاحظة: يمكن إجراء إزالة الوسيط/PBS الموصوف في هذه الخطوات يدويا باستخدام شفاط فراغي في خزانة السلامة الأحيائية، ولكن كن حذرا لتجنب التلوث المتبادل. استخدم طرف ماصة "أصفر" معقم جديد سعة 200 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة 96 بئرا عند الشفط ، حيث يتم وضع كل طرف أصفر متبادل بإحكام في نهاية ماصة مراعي زجاجية معقمة متصلة بشفاط التفريغ.
    1. اغسل الآبار 1x ب 100 ميكرولتر من PBS. شفط PBS.
    2. أضف 50 ميكرولتر من التربسين واحتضنها لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
    3. قم بسحب الماصة بلطف لأعلى ولأسفل ونقل الخلايا المعاد تعليقها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من الوسط.
    4. قم بعكس ذلك لخلط الخلايا وتحريكها بلطف في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20 درجة مئوية.
    5. قم بإزالة الوسط وإضافة 1 مل من PBS. قم بتحريك الأنبوب بلطف لتعطيل الكريات وقلبها عدة مرات للخلط.
    6. جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20 درجة مئوية لتكوير الخلايا.
    7. قم بإزالة PBS وإعادة تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من PBS الطازجة.
    8. قسم عينة 300 ميكرولتر إلى قسمين.
      1. نقل 200 ميكرولتر من الخلايا (2/3 من الكرية) إلى بئر من صفيحة 24 بئر تحتوي على 1 مل من الوسط المفضل. بمجرد التحقق من صحة النمط الوراثي ، استخدم هذه الخلايا لتوسيع خطوط الخلايا القاضية بوساطة كريسبر للتحليل الوظيفي.
      2. نقل 100 ميكرولتر من الخلايا (1/3 من الكرية) إلى أنبوب PCR 0.2 مل. جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية. إزالة PBS. تخزين الكريات في -80 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد محللات الخلايا الخام للتنميط الجيني وتحليل التسلسل باستخدام الاشعال PCR المصممة في الخطوة 1.3. قم بتضمين محللات الخلايا المحضرة من الخلايا غير المنقولة في هذه التجارب لاستخدامها كعناصر تحكم إيجابية من النوع البري.
    1. أعد تعليق حبيبات الخلية في 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت لبوليميراز الحمض النووي 5x (انظر جدول المواد ، التركيز النهائي 1x) ، و 1 ميكرولتر من Proteinase K (20 نانوغرام / مل من مخزون) ، و 1 ميكرولتر من RNase A (مخزون 10 نانوغرام / مل) ، والماء الخالي من النوكليز حتى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر.
    2. قم بتحليل الخلايا في جهاز تدوير حراري باستخدام برنامج PCR: 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 96 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تخزين الليزات الخلوية في -20 درجة مئوية.
    3. قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الاشعال PCR المصمم (إلى الأمام والخلف) الذي يحيط بالمواقع المستهدفة للحمض النووي الريبي المرشد RNA 5 و 3 (الجدول 1).
      ملاحظة: تعتمد ظروف المخزن المؤقت لبوليميراز الحمض النووي والدورة الحرارية على إنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq المستخدم في تفاعل PCR. تم تحسين هذا البروتوكول لبوليميراز الحمض النووي Phusion HF.
      1. قم بإعداد مزيج تفاعل PCR على الجليد: 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لبوليميراز الحمض النووي 5x ، و 0.5 ميكرولتر من التمهيدي PCR الأمامي (مخزون 10 ميكرومتر) ، و 0.5 ميكرولتر من التمهيدي PCR العكسي (مخزون 10 ميكرومتر) ، و 0.5 ميكرولتر من 10 mM dNTPs ، و 0.25 μL من DNA Polymerase ، و 1-4 ميكرولتر من تحلل الخلايا ، والماء الخالي من النوكليز حتى حجم إجمالي قدره 25 ميكرولتر.
      2. قم بتشغيل تفاعل PCR في دورة حرارية باستخدام البرنامج: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، و 35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 62 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، ثم 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. عقد لمدة 4 درجات مئوية. انظر الملاحظة 3.2.4. فوق.
    4. قم بتحميل منتجات PCR على هلام أغاروز بنسبة 1٪ لتحليل الرحلان الكهربائي.
    5. استخراج الحمض النووي من شظايا PCR المعزولة من الحجم الجزيئي المتوقع للأنماط الجينية بالضربة القاضية (والنوع البري). إعداد العينات لتسلسل الحمض النووي.
    6. تحقق من نجاح تفاعل كريسبر وقم بإجراء تسلسل الحمض النووي لشظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل المعزولة لتحديد موقع الانقسام Cas9 وتأكيد حذف موضع الحمض النووي الريبوزي المرسال.
      1. اعزل ما لا يقل عن ثلاثة خطوط خلايا خروج المغلوب المستقلة لكل موضع miRNA مستهدف بواسطة CRISPR. الاحتفاظ بخطوط الخلايا البرية (وغير المتجانسة) لاستخدامها كعناصر تحكم في الدراسات الوظيفية النهائية.
      2. قم بإجراء qRT-PCR أو تحليل اللطخة الشمالية للتأكد من أن خطوط الخلايا القاضية لا تعبر عن miRNA الناضج للموضع المحذوف.
        ملاحظة: تسلسل الجينوم الكامل (WGS) هو الطريقة الأكثر تحديدا للتحقق من صحة تحرير جينات كريسبر وخارج الاستهداف.
      3. اختبار تأثيرات كريسبر خارج الاستهداف بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل، والتي تم التنبؤ بها حسابيا (الخطوة 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. إذا كان الفحص الشامل لمستعمرة الخلية الواحدة يؤدي فقط إلى أنماط وراثية غير متجانسة الزيجوت ، فكرر توجيه نقل الحمض النووي الريبي في خطوط الخلية الواحدة غير المتجانسة.
        ملاحظة: عدم القدرة على الحصول على خطوط الخلايا القاضية متماثلة الزيجوت يمكن أن تشير إلى آثار قاتلة بسبب فقدان miRNA أو التعقيد الجينومي المتأصل (على سبيل المثال ، الازدواجية / الانصهار الكروموسومي) لخط الخلية الأبوية التي تتطلب مزيدا من التحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام بروتوكول حذف كريسبر عالي الإنتاجية هذا بنجاح باستخدام نقل خطوط الخلايا السرطانية البشرية LNCaP و PC3-ML المستحثة Cas9 مع الحمض النووي الريبي الموجه لأوليغونوكليوتيد الاصطناعي الذي يستهدف مجموعة miR-888 ، والتي تمت دراستها في سياق سرطان البروستاتا. تم تحديد مجموعة miR-888 في البداية في شاشة تنميط التعبير على أنها مرتفعة في مرضى سرطان البروستاتا الذين يعانون من مرض عالي الجودة مقارنة بالمرضى ذوي الدرجة المنخفضة وغير السرطانية 9,10. تتكون مجموعة miR-888 ، التي تمتد على 35,124 نقطة أساس ، من سبعة miRNAs (miR-892c و -890 و -888 و -892a و -892b و -891b و -891a) على الكروموسوم البشري Xq27.3 (الشكل 2A). يقع هذا الموضع داخل HPCX1 (سرطان البروستاتا الوراثي ، X-linked 1 ، Xq27-28) ، والذي يرتبط بسرطان البروستاتا الوراثي11،12،13،14،15،29. تشترك miR-888 و -890 و -892a و -892b و -892c في تماثل التسلسل وتنتمي إلى عائلة miR-743 المحفوظة من الثدييات. أعضاء المجموعة miR-891a و miR-891b يشتركون فقط في تماثل التسلسل مع بعضهم البعض وينتمون إلى عائلة miR-891 الخاصة بالرئيسيات. يتم الحفاظ على التنظيم الجينومي لمجموعة miR-888 عبر الرئيسيات ، مما يعني الحفظ الوظيفي لشبكة إشارات مهمة30.

كشفت الأعمال السابقة باستخدام الإفراط في التعبير التجريبي (miRNA يحاكي المحاكاة) وتثبيط (oligonucleotides المضادة للإحساس) لتقييم نشاط عضو الكتلة miR-888 الفردي عن دور متداخل لجميع أعضاء مجموعة miR-888 لتعزيز غزو خلايا سرطان البروستاتا باستخدام مقايسات غرفة Matrigel Boyden 9,10. وعلى الأخص ، عملت miR-888 و miR-891a بشكل مماثل للحث على نمو خلايا البروستاتا (اختبارات WST-1) ، وتسريع حمل ورم البروستاتا في xenografts الماوس ، وتنظيم الأهداف المشتركة (على سبيل المثال ، TIMP-2) 9،10. ومع ذلك، اقترح هذا العمل تفاعلا أكثر تعقيدا بين أعضاء مجموعة miR-888. على سبيل المثال ، أظهر miR-888 و miR-891a تأثيرات تآزرية في تعزيز انتشار خلايا البروستاتا PC3-N ، في حين أظهر كل من miR-890 و miR-892c تأثيرات نمو مثبطة باستخدام اختبارات WST-19. لذلك ، تم استخدام بروتوكول CRISPR عالي الإنتاجية هذا لاستجواب الشبكة العنقودية miR-888 وراثيا في سياق سرطان البروستاتا.

سمح سير العمل الموصوف لتحرير الجينات CRISPR Cas9 (الشكل 1) باختبار 32 تفاعلا فريدا لنقل الحمض النووي الريبي في دليل كريسبر في تجربة واحدة باستخدام تنسيق 24 بئرا. أدى هذا البروتوكول إلى التحديد الناجح لمجموعة من خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية التي تحمل عمليات حذف لمجموعة miR-888 بأكملها ، ومجموعات محددة من أعضاء مجموعة miRNA ، وأعضاء miRNA الفرديين. تم إنشاء جيل من خطوط خلايا Cas9 المستقرة القابلة للحث لأول مرة. باختصار ، أصيبت خلايا سرطان البروستاتا البشرية PC3-ML و LNCaP بناقل فيروس العقدية المقيحة Cas9 lentivirus القابل للتحريض DOX (Lenti-iCas9; EditR تحريض Lentiviral hEF1aBlastCas9 الجسيمات النوكليز ؛ MOI 0.3) لمدة 6 ساعات (LNCaP) أو بين عشية وضحاها (PC3-ML) ، اعتمادا على قابلية خط الخلية المتأصلة لسمية الفيروس.

خضعت خطوط الخلايا المصابة لاحقا لاختيار البلاستيسيدين (7.5 ميكروغرام / مل) وتوسع مستعمرة الخلية الواحدة. تم استخدام دراسات اللطخة الغربية لاختيار خطوط الخلايا PC3-ML و LNCaP Lenti-iCas9 أحادية المستعمرة التي تعرض أقوى تعبير Cas9 استنادا إلى دورة زمنية DOX-induction (الشكل 2A). تم التحكم في هذا النظام المستحث Cas9 الفيروسي بإحكام ، وعند سحب DOX لمدة 120 ساعة ، تم مسح معظم بروتين Cas9 من الخلايا (الشكل 2A). حدد منحنى تركيز DOX أن 250 نانوغرام / مل DOX كانت الجرعة المثلى للحث على تعبير بروتين Cas9 القوي في خطوط خلايا البروستاتا Lenti-iCas9 هذه (الشكل 2B). باستخدام أداة تصميم crRNA عبر الإنترنت23 ، تم تصميم crRNAs فريدة من نوعها (اثنان من 5 'و 3' crRNAs تحيط بكل موضع خروج المغلوب miRNA المخطط للسماح بأربع مجموعات RNA إرشادية محتملة 5 ' و 3') التي استهدفت منطقة الكتلة miR-888 ~ ~ 35 كيلو بايت ؛ مجموعات عنقودية أصغر داخل عائلة miR-743 أو عائلة miR-891 ؛ بالإضافة إلى عمليات حذف الحمض النووي الريبوزي المرسال الفردية (miR-888، -891a) (الشكل 3A). عند إجراء تجارب كريسبر، نمت خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشري Lenti-iCas9 في وسط مكمل ب 250 نانوغرام/مل DOX لمدة 48 ساعة للحث على التعبير عن Cas9.

ثم تم نقل الخلايا في شكل صفيحة من 24 بئرا مع الحمض النووي الريبوزي المرسال العالمي الاصطناعي المعقد (نسبة مولية 1: 1) مع مجموعة فريدة من 5 و 3 'crRNAs الجينومية الخاصة بالموقع (الجدول 2). تمت إزالة DOX من وسط زراعة الخلايا 48 ساعة بعد النقل لإزالة بروتين Cas9 من خلايا سرطان البروستاتا. تم حصاد الآبار بعد 48 ساعة (96 ساعة بعد النقل) وتم إعداد ثلث كل حبيبة خلية تم حصادها للتنميط الجيني PCR باستخدام محللات الخلايا الخام (الجدول 3). أشار تحليل الرحلان الكهربائي الهلامي لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أن حجم جزء الحمض النووي المتوقع الذي يمثل النمط الوراثي بالضربة القاضية قد تم تضخيمه لكل عملية نقل كريسبر (الشكل 3B). أكد تسلسل الحمض النووي لهذه الشظايا المعزولة من PCR بالضربة القاضية أن الحمض النووي الريبي المنقول 5 و 3 أقدام و 3 نجوم وجهوا انقسام / ربط Cas9 ~ 3 nt في المنبع من مواقع PAM والتحقق من صحة الفقدان الجينومي لموضع miRNA المستهدف (مثال تمثيلي موضح في الشكل 4C). نظرا لأن مجموعة miR-888 موجودة في منطقة بين الجينات من الكروموسوم X (بعيدا عن أي جينات مشفرة للبروتين) ، لم يكن من المتوقع أن تسبب خطوط الخلايا القاضية ، التي غالبا ما تمتلك INDELs في موقع الانقسام Cas9 بسبب NHEJ ، تأثيرات مصطنعة في المصب.

على الرغم من أن تفاعلات نقل كريسبر كانت ناجحة (الشكل 3B) ، إلا أن الخلايا المنقولة مثلت مجموعة مختلطة من الخلايا المنقولة (بالضربة القاضية) وغير المنقولة (النوع البري). وتمثل هذه المجموعة أيضا خليطا من الخلايا التي تحمل عمليات حذف متماثلة الزيجوت وغير متجانسة الزيجوت لموضع الحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدف. تستمد خطوط خلايا سرطان البروستاتا LNCaP و PC3 من الذكور الذين يمتلكون أنماطا نووية غير طبيعية تتضمن اثنين من الكروموسومات X31,32. لذلك ، تم تخفيف جزء من كل تفاعل نقل خلية بشكل متسلسل في شكل لوحة 96 بئرا للحصول على خطوط مستعمرة أحادية الخلية. تم فحص هذه المستعمرات بواسطة PCR لاختيار خطوط الخلايا متماثلة الزيجوت التي تفتقر إلى جميع نسخ موضع miRNA المستهدف.

كان من المهم اتباع هذا الإجراء في الوقت المناسب لأن البيانات السابقة أشارت إلى دور لمجموعة miR-888 في تعزيز نمو الخلايا السرطانية وعدوانية المرض. ومن المتوقع أن تنمو الخلايا السرطانية التي تحمل عمليات حذف كريسبر لأعضاء مجموعة miR-888 بشكل أبطأ من الخلايا البرية. وكان هناك قلق وجيه يتمثل في أنه مع مرور الوقت، فإن الآبار الموجهة المنقولة بالحمض النووي الريبي، والتي تحتوي على مجموعة مختلطة من الخلايا القاضية للحمض النووي الريبوزي المرسال والخلايا البرية، ستؤدي إلى تفوق الخلايا البرية بسرعة على الخلايا الطافرة المعرضة للخطر في الزراعة. وقد لوحظ حدوث ذلك وكان واضحا بشكل خاص في التجارب التي تستخدم خطوط خلايا PC3-ML شديدة العدوانية. وهكذا، تم تنفيذ الخطوات التي تنطوي على تخفيفات تسلسلية لتوليد خطوط مستعمرة أحادية الخلية أو إعداد الخلايا للتخزين المبرد في غضون 48-72 ساعة بعد إجراء تجارب نقل كريسبر للحفاظ على الخلايا القاضية في عينات السكان المختلطة.

كان الجزء الأكثر صعوبة في سير عمل كريسبر لمجموعة miR-888 هو توليد عمليات حذف miRNA متماثلة الزيجوت وأحادية الخلية. كان أحد التحديات في هذه العملية هو أن خلايا LNCaP و PC3-ML المستزرعة عادة لا تزدهر بشكل جيد عند طلائها بكثافات خلية واحدة. بالإضافة إلى ذلك، بدا أن نمو الخلايا يتعرض للخطر ظاهريا عند الفقدان التوافقي لأعضاء مجموعة miR-888 (ويرتبط بعدوانية خط الخلية). لذلك ، بالنسبة لبعض تفاعلات النقل التي تستهدف مجموعات معينة من مواقع miRNA ، كانت هناك حاجة إلى تخفيفات خلوية إضافية (باستخدام تنسيق 96 بئرا) لتوليد خطوط مستعمرة أحادية الخلية كافية للتنميط الجيني. عند فحص الأنماط الجينية لمستعمرات الخلية الواحدة عن طريق التصوير الهلامي الكهربائي ، كان من المفيد مقارنة شدة النطاق للنوع البري مقارنة بشظايا PCR بالضربة القاضية وتحديد ما إذا كان خط الخلية غير متجانس الزيجوت (كثافة نطاق متساوية) أو يمثل مستعمرة متعددة الخلايا (كثافة نطاق غير متساوية) ، والتي ستستفيد من جولات إضافية من تخفيفات الخلية الواحدة. إذا لوحظ أن مستعمرات الخلايا تمتلك شظايا PCR ذات حجم غير طبيعي وغير متسقة مع الأنماط الجينية من النوع البري أو الضربة القاضية ، فقد تم القضاء على هذه الخطوط من الدراسة.

تم إعادة التحقق من تسلسل الحمض النووي لشظايا PCR المعزولة المتسقة مع الأنماط الجينية من النوع البري والضربة القاضية لكل مستعمرة أحادية الخلية تم إنشاؤها وتأكيدها باستخدام طرق مستقلة (أي QRT-PCR و WGS). من حيث الكفاءة النموذجية لتوليد خطوط خلية فارغة متماثلة الزيجوت في هذه التجارب ، اختلف هذا مع موضع miRNA المستهدف ونوع الخلية المستخدمة. على سبيل المثال ، كانت الكفاءة في الحصول على خطوط خروج المغلوب mir-891a أحادية المستعمرة باستخدام LNCaP 30٪ ولكنها انخفضت إلى ~ 7٪ في خلايا PC3-ML. يمكن أن يكون هذا الاختلاف بسبب الاختلافات المتأصلة في نوع الخلية (على سبيل المثال ، تمتلك خلايا PC3-ML معدلات انقسام أعلى / إمكانات نقلية أعلى من خلايا LNCaP). يمكن أن تعكس الاختلافات في كفاءة كريسبر أيضا التأثير الوظيفي لفقدان الحمض النووي الريبوزي المرسال (على سبيل المثال ، يعزز miR-891a نمو الخلايا وعدوانيتها 9,10) ، وبالتالي ، يمكن تضخيم الأنماط الظاهرية بالضربة القاضية في خطوط الخلايا الأكثر عدوانية مثل PC3-ML. أظهر الحصول على خطوط أحادية المستعمرة لحذف موضع miRNA الأكبر من مجموعة miR-888 كفاءة أقل. لم نتمكن من تحديد ما إذا كان هذا بسبب ضرب مناطق أكبر من الحمض النووي أو التأكيد على الأدوار الوظيفية الأساسية والمتداخلة لأعضاء miR-888 في خلايا سرطان البروستاتا.

ولا يزال الوصف التفصيلي والتحليل الظاهري لخطوط الخلايا العنقودية miR-888 الموسعة لمستعمرة الخلية الواحدة التي تم إنشاؤها من سير العمل هذا جاريين وسيتم نشرهما في مكان آخر. كنتيجة تمثيلية لحذف الحمض النووي الريبوزي المرسال الذي تم إنشاؤه في دراسات تحرير الجينات كريسبر هذه ، يتم عرض نتائج خلايا سرطان البروستاتا LNCaP التي تحمل حذف mir-891a فردي. تم تحديد النمط الجيني لمستعمرات الخلية الواحدة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل والتحقق من التسلسل (الشكل 4A-C). لم يتم تحليل خطوط الخلايا التي تظهر شظايا PCR بحجم غير طبيعي (على سبيل المثال ، استنساخ L14 H7 كما هو موضح في الشكل 4D). بمجرد الحصول على الضربة القاضية والمستعمرات أحادية الخلية البرية لموضع mir-891a ، تم إجراء دراسات وظيفية. أظهرت الأبحاث السابقة أن الإفراط في التعبير عن miR-891a (miRNA يحاكي ناقل الفيروس اللئيم) يحفز نمو خلايا البروستاتا9 ، وبالتالي ، كان من المتوقع أن يظهر فقدان miR-891a تأثيرات متبادلة. أكدت اختبارات انتشار WST-1 التي تقارن بين الضربة القاضية mir-891a والخلايا البرية هذه الفرضية ، وأدت خسارة miR-891a إلى تباطؤ النمو (الشكل 4D ، E).

Figure 1
الشكل 1: سير عمل تحرير الجينات CRISPR لإنشاء عمليات حذف عنقودية miRNA. (أ) يتكون الحمض النووي الريبي الدليل من الحمض النووي الريبي الريبي الاصطناعي الملدن وأوليغونوكليوتيدات النتوكليوتيدات التراكرنا (نسبة مولية مختلطة 1: 1). تم تصميم oligonucleotide crRNA ليحتوي على تسلسل دليل 20 nt (أصفر) فريد من نوعه 5'-terminal (أصفر) مكمل لموقع الحمض النووي الجيني المستهدف ويتبعه تسلسل متكرر ثابت للمكورات العقدية المقيحة 22 nt (أخضر) يقترن بقاعدة مع tracrRNA oligonucleotide. تشير الأسهم الحمراء إلى مواقع انقسام الحمض النووي المزدوجة لإنزيم Cas9 التي تقع عادة على بعد 3 دقائق من المنبع من PAM. (B) يصور سير العمل التجريبي هذا بئرا واحدا من صفيحة 24 بئرا. تزرع الخلايا المصابة بناقل فيروس Cas9 lentivirus المستحث DOX (Lenti-iCas9 ، MOI 0.3) في الوسط مع DOX لمدة 48 ساعة للحث على التعبير عن بروتين Cas9. يتم نقل اثنين من الحمض النووي الريبي الموجه الاصطناعي (نسبة مولية مختلطة 1: 1 من crRNA::tracrRNA) إلى خلايا مستحثة ب Cas9. يرافق الحمض النووي الريبي الإرشادي Cas9 إلى مواقع الحمض النووي الجينومي (5 و 3 بوصة) المحيطة بمنطقة مجموعة miRNA المستهدفة للإزالة. يتم إعداد الخلايا بعد 48 ساعة من النقل للتخفيف باستخدام تنسيق 96 بئرا لتوليد مستعمرات أحادية الخلية للتنميط الجيني PCR وتحليلات النمط الظاهري في المصب. الاختصارات: كريسبر = التكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام بين المتباعد. miRNA = microRNA; crRNA = الحمض النووي الريبي كريسبر; tracrRNA = الحمض النووي الريبي كريسبر عبر التنشيط; nt = النيوكليوتيدات; Cas9 = إندونوكلياز المرتبطة كريسبر; PAM = زخارف متجاورة protospacer ؛ DOX = الدوكسيسيكلين; MOI = تعدد العدوى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: خطوط الخلايا السرطانية التي تحمل كاسيت Cas9 lentiviral قابل للتحريض بالدوكسيسيكلين يظهر تنظيما ضيقا لبروتين Cas9. (أ) أظهر تحليل اللطخة الغربية أن سرطان البروستاتا البشري PC3-ML خطوط الخلايا المصابة بناقل Lenti-iCas9 (EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, MOI 0.3) ونمت لمدة 48 ساعة في وسط يحتوي على 250 نانوغرام / مل DOX عبرت عن مستويات البروتين Cas9 المثلى. تم تطبيع تعبير Cas9 إلى تعبير GAPDH. (ب) أظهرت خلايا PC3-ML المزروعة في الوسط مع 250 نانوغرام / مل DOX لمدة 48 ساعة و 120 ساعة (+DOX) تعبيرا قويا عن بروتين Cas9. أدت إزالة DOX من الوسائط (-DOX) لمدة 120 ساعة (120 ساعة بعد ذلك) إلى إزالة بروتين Cas9 ، كما تم قياسه بواسطة تحليل اللطخة الغربية. تم الحصول على نتائج مماثلة عند إنشاء خط خلية LNCaP Lenti-iCas9 (غير معروض). الاختصارات: كريسبر = التكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام بين المتباعد. Cas9 = إندونوكلياز المرتبطة كريسبر; DOX = الدوكسيسيكلين; MOI = تعدد العدوى; GAPDH = نازعة هيدروجيناز الجلسرالدهيد 3-فوسفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تصميم تجريبي عالي الإنتاجية لكريسبر لتوليد مجموعات متعددة من حذف مجموعات الحذف العنقودي miR-888 في تجربة واحدة. (أ) رسم تخطيطي لمجموعة miR-888 الموجودة على الكروموسوم البشري Xq27.3 ، مع الإشارة إلى أفراد عائلة miR-743 المحفوظة من الثدييات mir-892c و -890 و -888 و -892a و -892b (الصناديق الزرقاء) وأفراد عائلة miR-891 الخاصة بالرئيسيات miR-891a و -891b (صناديق المارون). تم استخدام أوليغونوكليوتيدات crRNA الاصطناعية الفريدة (الأسهم الخضراء) لتوليد مجموعات الضربة القاضية العنقودية miR-888. تم تصميم الاشعال PCR الأمامي والعكسي (مستطيلات حمراء صغيرة) لخلايا النمط الوراثي وشاشة للضربات القاضية. (ب) تظهر هذه النتيجة التمثيلية 25 تفاعلا من تفاعلات كريسبر في خلايا PC3-ML المنقولة (Lenti-iCas9) التي استهدفت مجموعة من مجموعات الضربة القاضية العنقودية miR-888 في تجربة واحدة. احتوى كل بئر منقولة من صفيحة مكونة من 24 بئرا على اثنين من الحمض النووي الريبوزي المرسال الفريد الذي يحيط بالجانبين 5 و 3 من الموضع الجيني المستهدف للحمض النووي الريبوزي المرسال (Δ) (كما هو مبين في الجدول 2). تم تحضير محللات الخلايا الخام لكل تفاعل كريسبر والنمط الجيني لتفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تسلسل شظايا PCR المعزولة التي تهاجر بأحجام الضربة القاضية المتوقعة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي وتم التحقق من صحتها من أجل انقسام Cas9 المستهدف وإزالة موضع miRNA. يشار إلى أحجام BP المتوقعة لجزء WT PCR بين قوسين ، وتظهر أحجام أجزاء CRISPR KO PCR المطلوبة في الجزء السفلي من الهلام. الاختصارات: كريسبر = التكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام بين المتباعد. Cas9 = إندونوكلياز المرتبطة كريسبر; gRNA = دليل الحمض النووي الريبي. DOX = الدوكسيسيكلين; bp = زوج القاعدة; WT = نوع البرية; KO = خروج المغلوب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: خلايا سرطان البروستاتا المحذوفة ل mir-891a باستخدام تحرير الجينات كريسبر الذي يظهر الانتشار المكبوت. (أ) تصميم الاشعال PCR (الأرجواني) واثنين من الحمض النووي الريبي 5 'واثنين من 3' دليل الحمض النووي الريبي (البرتقالي) التي تستهدف التسلسلات الجينومية المحيطة بجين mir-891a (الأخضر). (ب) أكد التنميط الجيني لتفاعل البوليميراز المتسلسل لخلايا LNCaP المنقولة مع الحمض النووي الريبي الإرشادي المشار إليه 5 و 3 أقدام أنه تم الحصول على حذف Δmir-891a لجميع مجموعات الحمض النووي الريبي الإرشادية الأربعة. تم تصنيع محللات الخلايا من مجموعات الخلايا المختلطة بعد 48 ساعة من النقل. (ج) تم تسلسل شظايا PCR والتحقق من صحتها. يوضح مثال تمثيلي تسلسل الحمض النووي للخلايا المنقولة المعالجة بالحمض النووي الريبي الإرشادي 5A (891a) و 3B (891a) ، مما أدى إلى موقع الانقسام Cas9 المتوقع (3 nt في المنبع من موقع PAM) وحذف CRISPR Δ mir-891a. (د) تم الحصول على مستعمرات أحادية الخلية والنمط الجيني لتفاعل البوليميراز المتسلسل. تم التحقق من صحة تسلسل استنساخ L14 G9 كKO واستنساخ L14 G9 ك WT لجين mir-891a. (E) تبين سابقا أن miR-891a يحفز نمو خلايا سرطان البروستاتا ، وبالتالي ، كان من المتوقع أن يكون لفقدان miR-891a النمط الظاهري المتبادل. أظهرت اختبارات WST-1 لخلايا سرطان البروستاتا المحذوفة ل mir-891a (L14 G9 [KO] ، أزرق) انتشارا مكبوتا مقارنة بخلايا WT (L14 G9 [WT] ، أحمر). الاختصارات: كريسبر = التكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام بين المتباعد. Cas9 = إندونوكلياز المرتبطة كريسبر; WT = نوع البرية; KO = خروج المغلوب; WST-1 = ملح تيترازوليوم القابل للذوبان في الماء -1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يتم إعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل على الجليد.
مكون تفاعل 25 ميكرولتر التركيز النهائي
5x الحمض النووي بوليميراز المخزن المؤقت 5 ميكرولتر 1x
التمهيدي PCR الأمامي (10 ميكرومتر) 0.5 ميكرولتر 0.2 ميكرومتر
عكس PCR التمهيدي (10 ميكرومتر) 0.5 ميكرولتر 0.2 ميكرومتر
10 mM dNTPs 0.5 ميكرولتر 200 ميكرومتر
بوليميراز الحمض النووي (2 U / ميكرولتر) 0.25 ميكرولتر 0.125 U / 25 ميكرولتر
تحلل الخلايا الخام 1 - 4 ميكرولتر متغير
مياه خالية من النوكليز حتى 25 ميكرولتر
شروط الدورة الحرارية لتفاعل البوليميراز المتسلسل:
درج درجة الحرارة الوقت
تمسخ أولي 98 درجة مئوية 3 دقائق
98 درجة مئوية 10 ثانية
35 دورة 62 درجة مئوية 15 ثانية
72 درجة مئوية 15 ثانية
التمديد النهائي 72 درجة مئوية 10 دقائق
مسك 4 درجات مئوية

الجدول 1: ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للتنميط الجيني للليزات الخام. اختصار: dNTP = ديوكسي نيوكليوتيدات.

موقع الحذف المستهدف من كريسبر دليل الحمض النووي الريبي الجمع بين النوع البري (BP) خروج المغلوب (BP) أزواج PCR التمهيدي
∆مجموعة كاملة 5A(891a)+3A(892c)
5B(891a)+3A(892c)
5A(891a)+3B(892c)
5B(891a)+3B(892c)		 35,664 389
496
378
485		 891a دفع أمامي
892c REV
∆892c/890/888 5A'(888)+3A(892c)
5B'(888)+3A(892c)
5A'(888)+3B(892c)
5B'(888)+3B(892c)		 2,739 478
487
467
476		 888 دفع أمامي
892c REV
∆892c/890 3A'(888)+3A(892c)
3B'(888)+3A(892c)
3A'(888)+3B(892c)
3B'(888)+3B(892c)		 2,739 710
754
699
743		 888 دفع أمامي
892c REV
∆892b/892a 5A'(888)+5A(892b)
5B'(888)+5A(892b)
5A'(888)+5B(892b)
5B'(888)+5B(892b)		 2,938 554
547
573
566		 892b دفع أمامي
888 لفة
∆892b/892a/888 5A(892b)+3A'(888)
5A(892b)+3B'(888)
5B(892b)+3A'(888)		 2,938 322
278
341		 892b دفع أمامي
888 لفة
∆743 عائلة 5A(892b)+3A(892c)
5B(892b)+3A(892c)
5A(892b)+3B(892c)
5B(892b)+3B(892c)		 5,015 370
389
359
378		 892b دفع أمامي
892c REV
∆891 عائلة 5A(891a)+3A(891b)
5B(891a)+3A(891b)		 27,294 330
270		 891a دفع أمامي
891b REV
∆891أ 5A(891a)+3A(891a)
5A(891a)+3B(891a)
5B(891a)+3A(891a)
5B(891a)+3B(891a)		 554 333
273
454
394		 891a دفع أمامي
891a REV

الجدول 2: الحمض النووي الريبي الإرشادي CRISPR المستخدم لإنشاء مجموعات الضربة القاضية العنقودية miR-888. الاختصارات: كريسبر = التكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام بين المتباعد. bp = زوج القاعدة; دفع أمامي = إلى الأمام; REV = عكس.

التمهيدي تسلسل Tm (درجة مئوية)
888 دفع أمامي AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG 52.2
888 لفة CTGGATGATGGCCAAGACAAG 55.9
891a دفع أمامي TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA 53.9
891a REV TTCATCTTGCTGCTACCTGTC 54.8
891b REV TCATCTTGCTGCTATACGTCCT 55.6
892b دفع أمامي GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA 53.5
892b REV CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC 53.5
892c دفع أمامي TGTGAGCACCTACAGGTTAG 53.9
892c REV CACTCTCACTTGGCTTCATG 53.5

الجدول 3: الاشعال PCR المستخدمة في التنميط الجيني. الاختصارات: FWD = إلى الأمام ؛ REV = عكس; Tm = درجة حرارة الانصهار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يسمح إجراء تحرير الجينات CRISPR هذا للباحث بإنشاء لوحة كاملة من خطوط الخلايا بسرعة تحمل مجموعات فريدة من نوعها لحذف مجموعات miRNA. إن نقل الحمض النووي الريبي الموجه الاصطناعي المكون من 5 و 3 أقدام و 3 من الحمض النووي الريبوزي المرسال الخاص بالموقع الجينومي الملدن مع الحمض النووي الريبي الثلاثي المرسال الاصطناعي (نسبة 1: 1 المولية) في هذا البروتوكول يتجنب الاستنساخ الفرعي لناقلات البلازميد التي تستغرق وقتا طويلا ويسمح بتصميم تجريبي أكثر مرونة وعالي الإنتاجية باستخدام تنسيق 24 بئرا. يتيح توليد خطوط الخلايا التي تحمل كاسيت Cas9 lentiviral القابل للحث DOX التعبير عن Cas9 القوي والمنظم بإحكام أثناء نقل الخلايا للحمض النووي الريبي الموجه والتخليص السريع لهذا البروتين البكتيري عند انسحاب DOX من وسط المزرعة في الخطوات اللاحقة. يعتمد هذا الإجراء أيضا على محللات الخلايا الخام للتنميط الجيني PCR ، والذي يتطلب الحد الأدنى من المواد الخلوية للتحليل ويتجنب استخدام طرق تنقية الحمض النووي لعمود السيليكا المكلفة والكثيفة العمالة أو الحاجة إلى قياس تركيزات الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، مما يزيد من تبسيط الطرق للباحث.

في الواقع ، أظهرت النتائج التمثيلية المشتركة هنا تكيفا ناجحا لهذه الطريقة لنقل خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية مع 32 تركيبة فريدة من الحمض النووي الريبي الإرشادي في تجربة واحدة وتوليد خطوط خروج مغلوب متعددة من مستعمرة أحادية الخلية تحمل عمليات حذف لكامل المنطقة العنقودية miR-888 ~ 35 كيلو بايت ؛ مجموعات حذف أصغر لأعضاء مجموعة miR-888 الذين ينتمون إلى عائلتي miR-743 و miR-891a ؛ بالإضافة إلى عمليات الحذف لأعضاء miRNA الفرديين داخل مجموعة miR-888. ولد سير العمل هذا موردا قيما لخط الخلية للبدء في تشريح شبكة عنقود miR-888 جزيئيا في سياق مرض البروستاتا البشري وتحديد كيفية تداخل أعضاء مجموعة miR-888 وظيفيا أو تفاعلهم بشكل تآزري / عدائي مع بعضهم البعض لتنظيم نمو ورم البروستاتا ، وعدوانية السرطان ، ومقاومة الأدوية (سيتم نشرها في مكان آخر). ستكون هذه الدراسات حاسمة حيث يتحرك هذا البحث نحو التطبيقات التشخيصية والعلاجية لعلاج المرضى الذين يعانون من أشكال متقدمة ومنتشرة من سرطان البروستاتا.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في بروتوكول تحرير الجينات كريسبر عالي الإنتاجية هذا الذي يجب على الباحثين مراعاته بعناية عند تكييف هذه الطريقة لدراسة شبكات عنقودية إضافية من الحمض النووي الريبوزي المرسال في سياقات مرضية أخرى. أولا، الخطوة الأكثر أهمية في هذه العملية هي التصميم الدقيق للحمض النووي الريبي المرشد الذي يحيط بمجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال لإزالة الحمض النووي الريبوزي المرسال المعالج بتقنية كريسبر، بالإضافة إلى الحمض النووي الريبي المرسال الإرشادي الإضافي لحذف الحمض النووي الريبي المرسال الفردي أو مجموعات من أعضاء مجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال. يجب على الباحث أن يضع دراسة متأنية لعدم تعطيل الجينات المحيطة أو العناصر التنظيمية ، خاصة إذا كانت مجموعة miRNA موجودة داخل إنترون الجين أو تقع في مكان مضاد لجين آخر. هناك موارد تنبؤ كريسبر خارج الاستهداف24،25،26،27 المتاحة التي يمكن أن تساعد الباحث عند اختيار أوليغونوكليوتيدات crRNA الأكثر تمييزا لتوليفها. يصف سير العمل هذا تصميم اثنين من الحمض النووي الريبوزي المرسال 5 و 3 بوصات يحيطان بكل موضع من مواقع الحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدفة التي تسمح باختبار أربع مجموعات فريدة من الحمض النووي الريبي الإرشادي في خطوة نقل كريسبر وتزيد من فرص توليد خط الخلايا الضربة القاضية المطلوب. ومع ذلك ، يحتاج الباحث فقط إلى واحدة من مجموعات الحمض النووي الريبي الإرشادية هذه للعمل بنجاح على تعطيل موضع جين miRNA معين.

ثانيا، يجب على الباحث أن يقرر الطريقة الأنسب لتوصيل Cas9 إلى الخلايا لتحرير جينات كريسبر. استخدم هذا الإجراء نظام التعبير الفيروسي Cas9 lentiviral القابل للتحريض DOX ، ولكن يمكن بسهولة تكييف النهج البديلة لإنتاج بروتين Cas9 (على سبيل المثال ، البروتين المؤتلف Cas9 ، أو تسليم Cas9 mRNA ، أو استخدام أنظمة ناقلات البلازميد التقليدية لتعبير Cas9) لهذا البروتوكول. على سبيل المثال، يمكن أن تملي الاعتبارات التجريبية استخدام التعبير العابر Cas9 مقابل توليد خطوط خلايا تعبير فيروسي مستقرة، والمروج المستخدم لدفع Cas9 (في كل مكان، ونوع الخلية، والمستحث)، ودمج أنظمة الانتقاء الإيجابية/السلبية لضمان توصيل متجه تعبير Cas9 إلى الخلايا ذات الأهمية (أي مقاومة المضادات الحيوية).

ثالثا ، من المهم أن يتم بسرعة النمط الجيني للخلايا المنقولة المختلطة السكان في غضون 48-72 ساعة بعد توجيه تسليم الحمض النووي الريبي في حالة أن فقدان مجموعة miRNA قد يؤثر سلبا على بقاء / نمو الخلايا. على سبيل المثال ، عند حذف العوامل المعززة للورم مثل miR-891a في خطوط خلايا سرطان البروستاتا ، لوحظ أن هذه الخلايا القاضية mir-891a نمت بشكل أبطأ من الخلايا غير المعالجة ، وبعد ذلك ، تجاوزت الخلايا من النوع البري بسرعة عدد الخلايا. وأخيرا، من الأهمية بمكان دمج طرق التحقق الإضافية لضمان إزالة موضع الحمض النووي الريبوزي المرسال أثناء عملية الفحص الوراثي، خاصة بالنسبة لعمليات الحذف الجينومي الأكبر. وتشمل هذه التدابير استخدام ضوابط التنميط الجيني PCR الداخلية التي يتم اكتشافها فقط إذا كان الأليل من النوع البري موجودا وإجراء تحليل qRT-PCR على مستعمرات الخلية الواحدة للتأكد من أن خطوط الخلايا القاضية لا تعبر عن الحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدف. كل هذه الاعتبارات ستضمن نتائج ناجحة للمحقق.

كانت هناك بعض القيود الواضحة التي تمت مواجهتها عند دمج تقنية كريسبر هذه في المختبر. على سبيل المثال، على الرغم من الطبيعة عالية الإنتاجية لخطوات نقل الحمض النووي الريبي الإرشادي الموصوفة في هذا البروتوكول لإنشاء مجموعات متعددة من مجموعات حذف الحمض النووي الريبوزي المرسال بسرعة ، كانت الخطوة المحددة للمعدل لهذا الإجراء هي فحص النمط الجيني وتوسيع خطوط الخلايا أحادية المستعمرة لكل حذف للحمض النووي الريبوزي المرسال بوساطة كريسبر. وسيكون من المفيد إدراج استراتيجيات الاختيار الإيجابي في هذا البروتوكول؛ ومع ذلك ، لا يزال الأمر يستغرق حوالي 3-4 أسابيع لتوسيع خط من مستعمرة أحادية الخلية نمت في شكل 96 بئرا. في الواقع ، فإن جمع ما لا يقل عن ثلاثة خطوط خلايا مستقلة أحادية المستعمرة لكل موضع miRNA بالضربة القاضية بالإضافة إلى الخلايا من النوع البري سيساعد على ضمان أن الأنماط الظاهرية التي تم فحصها ليست بسبب تأثيرات القطع الأثرية / خارج الاستهداف ، ولكن هذا يضيف مرة أخرى إلى الطبيعة المستهلكة للوقت لهذا الإجراء. قد يحتاج الباحث أيضا إلى إجراء جولات متعددة من تحرير الجينات كريسبر للحصول على خطوط خلية فارغة متماثلة الزيجوت. هذا واضح بشكل خاص في الدراسات التي تستخدم خطوط الخلايا السرطانية المخلدة التي غالبا ما تمتلك مشهدا جينيا معقدا لإعادة ترتيب الكروموسومات والأنماط النووية غير الطبيعية.

على سبيل المثال ، استخدمت هذه الدراسة التمثيلية خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية المشتقة من LNCaP و PC3 لتوليد عمليات حذف لمجموعة miR-888 ، ورسم الخرائط على كروموسوم X. كان من المهم أن ندرك أن خطوط خلايا سرطان البروستاتا المشتقة من الذكور هذه لها أنماط نووية غير طبيعية وتمتلك اثنين من الكروموسومات X (وخلايا PC3 لديها أيضا عمليات نقل جزئية للكروموسومات X على autosomes أخرى)31,32. على الرغم من هذه الظروف، كان تحرير الجينات كريسبر قويا بما يكفي لتوليد ضربات قاضية متماثلة الزيجوت باستخدام خطوط خلايا البروستاتا هذه. ومع ذلك ، قد تكون هناك حالات يمكن أن يحتوي فيها خط خلية المحقق مع نمط نووي غير طبيعي (على سبيل المثال ، عمليات الإدراج والحذف والانعكاسات والازدواجية) على "طفرات غير مرئية" من شأنها أن تحجب الكشف عن النسخ الثانية (أو أكثر) من موضع الجين المستهدف بسبب العناصر المفقودة المطلوبة للكشف الناجح باستخدام التمهيدي PCR / الحمض النووي الريبي الإرشادي المصمم. وهذا يؤكد أهمية التحقق من خطوط خلايا كريسبر الخالية متماثلة الزيجوت باستخدام طرق مستقلة (مثل qRT-PCR واللطخة الشمالية وWGS) قبل إجراء الفحوصات الوظيفية. أخيرا ، تم تصميم هذا البروتوكول لضرب مجموعات مجموعات miRNA التي ترسم خرائط متجاورة مع بعضها البعض فقط. إذا رغب الباحث في التخلص من الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNAs) التي يتم فصلها بين جينات الحمض النووي الريبوزي المرسال الأخرى، فستكون هناك حاجة إلى جولات متعددة من عمليات نقل كريسبر، مما يتطلب تنميطا جينيا دقيقا والتحقق من صحته.

على الرغم من هذه التحديات ، فإن القدرة على إنشاء لوحة كاملة من مجموعات حذف miRNA بسرعة لأي مجموعة miRNA معينة باستخدام هذا البروتوكول الموصوف هي ميزة كبيرة على الطرق الحالية في صندوق أدوات بحث miRNA. يمكن أن تؤدي دراسات التعبير الزائد باستخدام miRNA لتقليد توصيف وظيفة الحمض النووي الريبي غير المشفرة إلى قطع أثرية غير مقصودة أو سميات خلوية. وبالمثل ، قد يكون من الصعب استخدام مثبطات oligonucleotide antisense antimir لتحديد الأنماط الظاهرية لفقدان الوظيفة لأن antimirs عادة ما تؤدي إلى ضربة قاضية وليس القضاء التام على نشاط miRNA. وقد أثبتت محاولة استخدام مجموعات من miRNA يحاكي أو miRNA antimirs لتوضيح إشارات شبكة miRNA العنقودية أنها شاقة ويصعب تفسيرها. لذلك، فإن دمج تقنية كريسبر لتحرير الجينات نحو استجواب كيفية تفاعل أعضاء الحمض النووي الريبوزي المرسال داخل مجموعة جينومية معينة غير مشفرة سيمكن الباحثين من اكتساب فهم أوضح لكيفية تأثير الحمض النووي الريبي غير المشفر على مسارات إشارات المرض ويعد بأن يكون له آثار ضخمة في مجالات التشخيص واكتشاف الأدوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

تم توفير خطوط خلايا PC3-ML من قبل مارك ستيرن (كلية الطب بجامعة دريكسل). ساعد جاستن توكسي في التنميط الجيني PCR. تم دعم هذا العمل من خلال منحة مؤسسة بريدان آدامز ، وصندوق ريان للبحوث الانتقالية ، ومنحة مجلس الكومنولث للبحوث الصحية (CHRB-274-11-20) إلى AE-K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap Fisher 14-230-225 Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Seal-Rite 1615-5500 Plasticware
24-well tissue culture plate Corning Costar  09761146 Plasticware
5x Phusion HF Buffer Thermo Scientific F-518L PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate Fisher FB012927 Plasticware
96-well tissue culture plate Falcon 08-772-2C Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal AbCam ab191468 Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062 Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine National Center for Biotechnology Information NA Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes Calbiochem CAS 589205 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter Invitrogen A50298 Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes Thermo Scientific 50001012 Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool Horizon Discovery Ltd. NA Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 Dharmacon, Inc. T-2002-02 Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher  BP231100 Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10013CV Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution Sigma-Aldrich D3072-1ML CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed Dharmacon, Inc. U-002005-20 CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		 Dharmacon, Inc. crRNA-460XXX CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL Dharmacon, Inc. VCAS11227 CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer Ensembl NA Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal Santa Cruz Biotechnology sc25778 Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit IBI Scientific IB47010 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified Gibco 16000044 Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide MilliporeSigma H9268 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane MilliporeSigma IPFL10100 Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer LI-COR 927-60001 Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 926-68070 Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 926-32211 Western blot reagent
Microcentrifuge Eppendorf  5425 R Plasticware
miRBase microRNA viewer miRBase NA Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well Invitrogen NP0321BOX Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System LI-COR CLx Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System Owl D2-BP Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) Integrated DNA Technology NA PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Scientific F530S PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x MilliporeSigma 20-188 Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade Invitrogen 25530049 PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) Thermo Scientific EN0531 PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium Gibco MT10041CV Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer Snap Gene NA Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12563029 Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler ThermoFisher Scientific 4375305 Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System Invitrogen EI0001 Equipment; Protein gel electrophoresis system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com). , Available from: https://www.snapgene.com (2022).
  20. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI). , Available from: https://www.ensembl.org (2022).
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory). , Available from: https://www.mirbase.org (2022).
  23. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon). , Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022).
  24. Tools for Guide Design and Off-Target Prediction (MIT CRISPR Design Tool from the Zhang Lab). , Available from: http://crispr.mit.edu (2022).
  25. Sangsu Bae, J. P., Kim, J. -S. Cas-OFFinder (from Sangsu Bae, Jeongbin Park, Jin-Soo Kim). , Available from: http://www.rgenome.net/cas-offinder/ (2022).
  26. Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center). , Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022).
  27. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  28. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents. , Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022).
  29. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  30. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  31. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  32. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Tags

علم الأحياء ، العدد 182 ، كريسبر ، Cas9 المستحث ، الضربة القاضية microRNA ، مجموعة miR-888
أداة تحرير الجينات كريسبر لتحليل الشبكة العنقودية MicroRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, C., Quan, L., Yi, G.,… More

Chambers, C., Quan, L., Yi, G., Esquela-Kerscher, A. CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63704, doi:10.3791/63704 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter