Summary
Des injections intravitréniennes ont été effectuées dans l’œil de mouton dans le but d’administrer une thérapie génique à médiation virale à la rétine.
Abstract
Il existe plusieurs méthodes pour l’administration d’agents thérapeutiques à la rétine, y compris l’administration intravitréenne (IVT), sous-rétinienne, suprachoroïdienne, périoculaire ou topique. L’administration de médicaments IVT implique une injection dans l’humeur vitrée de l’œil, une substance gélatineuse qui remplit la chambre postérieure de l’œil et maintient la forme du globe oculaire. Bien que la voie IVT soit moins ciblée que l’administration sous-rétinienne, elle est beaucoup moins invasive et est largement utilisée en milieu clinique pour une gamme de maladies oculaires.
Nous avons précédemment démontré l’efficacité de l’administration intravitréenne d’un produit de thérapie génique médiée par un virus adéno-associé (AAV) (AAV9. CLN5) chez les ovins atteints d’une forme naturelle CLN5 de céroïde lipofuscinose neuronale (LCN). Les moutons affectés ont reçu une thérapie génique IVT dans un œil, l’autre œil non traité servant de contrôle interne. La structure et la fonction rétiniennes ont été maintenues dans l’œil traité jusqu’à 15 mois après le traitement, tandis que l’œil non traité a présenté une fonction progressivement déclinante et une atrophie sévère lors de l’examen post-mortem. Sur la base des études sur les moutons, le produit de thérapie génique CLN5 a été approuvé en tant que nouveau médicament expérimental (IND) candidat par la Food and Drug Administration des États-Unis en septembre 2021. Cet article détaille le protocole chirurgical pour l’administration IVT d’un vecteur viral thérapeutique à l’œil ovin.
Introduction
Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour administrer des agents thérapeutiques à la rétine, y compris l’administration intravitréenne (IVT), sous-rétinienne, suprachoroïdienne, périoculaire ou topique. Chaque voie d’administration implique de surmonter des barrières telles que la barrière hémato-rétinienne ou les membranes limitantes internes et externes et a des taux d’efficacité variables selon le médicament administré et la cible rétinienne spécifique 1,2.
L’administration de médicaments IVT implique une injection dans l’humeur vitrée de l’œil, une substance gélatineuse qui occupe la chambre postérieure de l’œil. La fonction principale de l’humeur vitrée est de maintenir la forme du globe oculaire et de maintenir les tissus oculaires, tels que le cristallin et la rétine, en place. L’humeur vitrée est composée en grande partie d’eau, avec de petites quantités de collagène, d’acide hyaluronique et d’autres protéines non collagènes3. L’injection de TVI est une procédure simple et courante utilisée couramment pour traiter un large éventail de conditions oculaires, y compris la dégénérescence maculaire liée à l’âge, l’œdème maculaire diabétique, la rétinopathie diabétique, l’occlusion veineuse rétinienne et plusieurs dystrophies rétiniennes héréditaires 4,5.
Céroïdes lipofuscinoses neuronales (NCL; Maladie de Batten) sont un groupe de maladies mortelles de surcharge lysosomale qui provoquent une dégénérescence sévère du cerveau et de la rétine. Il existe actuellement 13 variantes connues de NCL résultant de mutations dans différents gènes (CLN1-8, CLN10-14) qui affectent principalement les enfants, mais dont l’âge d’apparition et la gravité de la maladie varient6. Les LCN partagent des symptômes progressifs communs, notamment un déclin cognitif et moteur, des convulsions et une perte de vision. Il n’y a pas de remède pour NCL; cependant, la thérapie enzymatique substitutive dirigée vers le cerveau fait actuellement l’objet d’essais cliniques pour la maladie CLN27,8, et la thérapie génique médiée par AAV s’est révélée très prometteuse dans les études précliniques, avec un essai clinique pour la thérapie génique CLN5 qui devrait commencer en 2022 9,10.
De nombreuses autres espèces développent des formes naturelles de LCN, notamment les chats, les chiens, les moutons et les vaches. Deux modèles ovins de LCN font actuellement l’objet d’études actives en Nouvelle-Zélande : un modèle de maladie CLN5 chez les moutons de Borderdale et un modèle de maladie CLN6 chez les moutons du South Hampshire. Les moutons atteints présentent de nombreuses caractéristiques cliniques et pathologiques de la maladie humaine, notamment une atrophie rétinienne et une perte de vision10,11. Bien que la thérapie génique CLN5 dirigée vers le cerveau chez les moutons atteints de la maladie CLN5 puisse prévenir ou arrêter l’atrophie cérébrale et le déclin clinique, les moutons traités perdent toujours la vue9. Cela a mis en évidence la nécessité de traiter la rétine pour préserver la vision et maintenir une meilleure qualité de vie, ce qui a conduit à la mise en place d’un protocole de thérapie génique oculaire chez le mouton.
L’œil de mouton représente un bon modèle de l’œil humain en raison de sa similitude dans les dimensions du globe oculaire, le volume vitré et la structure rétinienne10,12,13. Cet article détaille le protocole chirurgical pour l’administration par IVT d’un petit volume (≤100 μL) de vecteur viral thérapeutique à l’œil d’ovin.
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Protocol
Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d’éthique animale de l’Université Lincoln et sont conformes aux directives des National Institutes of Health des États-Unis pour le soin et l’utilisation des animaux dans la recherche et à la loi néo-zélandaise sur le bien-être des animaux (1999). Les moutons Borderdale ont été diagnostiqués à la naissance14 et maintenus dans les fermes de recherche de l’Université Lincoln. Trois brebis homozygotes (CLN5-/-) âgées de 3 mois ont reçu une seule injection de TIV à l’œil gauche, l’œil droit non traité agissant comme un contrôle interne. Les données d’électrorétinographie et de pathologie ont été comparées aux données historiques sur les témoins sains et affectés. Le vecteur viral utilisé dans cette étude était un virus adéno-associé auto-complémentaire de sérotype 9, contenant le promoteur de l’action bêta du poulet (CBh) et le CLN5 ovin optimisé pour les codons (scAAV9/CBh-oCLN5opt). Le vecteur viral a été fourni par le Vector Core de l’Université de Caroline du Nord, NC, États-Unis.
1. Préopératoire
- Autoclaver la trousse chirurgicale (Figure 1).
- Jeûnez les moutons pendant 24 h avant la chirurgie.
- Enregistrer les poids vifs avant la chirurgie.
Figure 1 : Kit de chirurgie intravitréenne. Les instruments requis pour la chirurgie IVT comprennent (1) un spéculum pour maintenir les paupières ouvertes et (2) une paire de pinces nasales incurvées pour saisir la conjonctive bulbaire et faire pivoter l’œil. (3) Un hémostatique à nez droit est également inclus comme instrument alternatif pour saisir la conjonctive bulbaire et maintenir l’œil en place s’il a roulé dans l’orbite oculaire. Ce kit est autoclavé avant la chirurgie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Intervention chirurgicale
- Attachez l’animal et, à l’aide de tondeuses électroniques, rasez la laine d’un côté du cou sur la veine jugulaire.
- Obstruez la veine jugulaire en appliquant une pression à la base de la rainure jugulaire et visualisez la veine surélevée.
- Prélever la quantité appropriée de diazépam (0,3 mg/kg) et de kétamine (7,5 mg/kg) dans une seringue stérile et fixer une aiguille stérile de 20 G. Insérez l’aiguille dans la veine jugulaire et retirez doucement sur le piston pour vous assurer que le sang pénètre dans le moyeu et que l’aiguille est à l’intérieur de la veine. Une fois confirmé, induire par administration intraveineuse (jugulaire).
- Immédiatement après l’induction, placez l’animal en position couchée dorsale, étendez le cou et tenez la langue vers le haut et vers l’avant, à l’aide d’un laryngoscope pour visualiser le larynx. Effectuer une intubation endotrachéale en insérant doucement un tube endotrachéal (taille 6,0-9,0 selon la taille du mouton) entre les cordes vocales lorsque l’animal expire. Gonflez immédiatement le brassard endotrachéal et fixez le tube avec une attache autour de la mâchoire inférieure. Confirmez le débit d’air à travers le tube.
- Transférer le mouton sur la table chirurgicale et le placer en position couchée latérale.
- Connectez immédiatement le tube endotrachéal aux tuyaux de l’appareil d’anesthésie pour l’administration d’isoflurane dans 100% d’oxygène. Commencez d’abord avec 3% à 4% d’isoflurane puis réduisez à 2%-3% pour l’entretien. Observez la ventilation spontanée des moutons.
- Surveillez la fréquence cardiaque (pouls), la fréquence respiratoire, la saturation en oxygène, les niveaux de CO2 en fin de marée et la température corporelle rectale tout au long de la procédure. Voir le tableau 1 pour les valeurs physiologiques de ces paramètres chez les moutons anesthésiés (variables, mais à utiliser à titre indicatif).
- Placez un grand champ carré stérile sur un chariot d’opération chirurgicale, suivi des instruments stériles.
- Placez un champ chirurgical fenestré stérile sur l’œil à injecter.
- Désinfecter l’œil de façon aseptique à l’aide d’une seringue stérile de 20 ml pour irriguer l’œil avec une solution de povidone iodée à 1-5%.
- Appliquer 1-2 gouttes Alcaine 0,5% W / V solution ophtalmique, comme anesthésique local, sur l’œil.
- Ajuster un spéculum oculaire Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) aux paupières pour maintenir l’œil ouvert.
- Saisissez la conjonctive bulbaire sur la face dorsolatérale de l’œil avec une pince et faites pivoter le globe oculaire ventromédialement.
| Conscient | Anesthésiés | Point d’intervention critique recommandé | |
| Fréquence cardiaque (battements/min) | 50-80 (repos) à 280 (actif) | 50-80 | <50, >100 |
| Fréquence respiratoire (respirations/min) | 15-40 (repos) à 350 (surchauffé) | 10-30 | <8, >40 |
| Saturation en oxygène (mm Hg) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| CO2 en fin de marée (mm Hg) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| Température corporelle (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36, >40 |
Tableau 1: Valeurs physiologiques des paramètres à surveiller chez les ovins anesthésiés.
3. Préparation virale
- Conserver les aliquotes du vecteur AAV à −80 °C jusqu’à utilisation.
- Le jour de la chirurgie, décongelez le nombre requis de flacons pour l’administration de la IVT sur glace.
- Immédiatement avant l’administration, faire tourbillonner l’aliquote du vecteur viral et centrifuger à 400 × g pendant 10 s pour recueillir le contenu.
- Diluer chaque aliquote de vecteur viral dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x filtrée stérile à la dose désirée dans un volume final de 100 μL. Préparer les dilutions vectorielles dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 mL à faible liaison aux protéines à l’aide d’embouts de pipette filtrants stériles. Éliminer tous les consommables qui ont été en contact avec le vecteur viral dans une solution désinfectante (voir le tableau des matières).
NOTE: Dans la publication originale15 , la dose de l’agent thérapeutique (AAV9. CLN5) était 1,9 x 1010 génomes viraux. La posologie recommandée varie en fonction de l’agent thérapeutique administré; Par conséquent, une posologie n’a pas été incluse dans le protocole standard présenté ici. - Aspirer les 100 μL de la préparation du vecteur AAV dans une seringue stérile de 1 mL à faible espace mort avec une aiguille de 28 G x 1/2 po fixée en permanence pour injection immédiate. Assurez-vous que le temps entre la préparation et l’injection est inférieur à 2 min.
4. Administration virale
- Insérez l’aiguille à environ 7 mm en arrière de la sclérotique sur la face latérale de l’œil et inclinée vers l’arrière pour éviter la lentille (figure 2 et figure 3). Administrer l’injection unique de 100 μL sous forme de bolus aussi près que possible de la rétine sans perturber la surface rétinienne.
- Rincer l’œil avec environ 10 à 15 mL de solution de povidone iodée à 1-5 %, suivie de 10 mL de solution saline avant de retirer le spéculum et le drapé.
- Retournez le mouton et répétez avec l’autre œil si nécessaire.
Figure 2 : Rotation ventromédiale du globe oculaire. (A) Saisir la conjonctive bulbaire à l’aide d’une pince non dentée et (B) tourner ventromédialement (c.-à-d. vers le bas et vers le museau) pour exposer la surface dorsolatérale de l’œil pour injection. Abréviations : V = ventrale, D = dorsale, M = médiale, L = latérale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Emplacement et profondeur de l’injection. L’aiguille est injectée sur la face dorsolatérale du globe oculaire et toute la longueur de la tige de l’aiguille (0,5 po/12,7 mm) est insérée dans l’œil. Notez l’angle de l’aiguille vers la partie postérieure de l’œil pour éviter le cristallin et injectez le plus près possible de la rétine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
5. Prise en charge postopératoire
- À la fin de la procédure, arrêtez l’anesthésie par inhalation de gaz isoflurane, rincez la ligne avec de l’oxygène à 100%, débranchez le tuyau du tube endotrachéal et transférez les moutons dans la salle de réveil.
- Placez les moutons en position couchée sternale, les pattes repliées en dessous, et surveillez jusqu’à rétablissement complet. Assurez-vous que la bouche de l’animal est libre de toute obstruction.
- Lorsque le réflexe de déglutition est observé, dégonfler partiellement le brassard du tube endotrachéal et retirer doucement le tube de la bouche.
- Administrer un anti-inflammatoire non stéroïdien intramusculaire dans le muscle biceps fémoral du membre postérieur, des antibiotiques sous-cutanés sur le côté du cou ou derrière l’épaule et des gouttes ophtalmiques à 0,5% de chloramphénicol à la surface du globe oculaire.
- Fournir de l’eau et de la nourriture (granulés de luzerne et paillettes) une fois que les moutons peuvent se tenir debout sans aide.
- Administrer des gouttes ophtalmiques de chloramphénicol à 0,5% 2-3 par jour pendant 7 jours après la chirurgie.
- Gardez les moutons à l’intérieur pendant la nuit avant de retourner dans l’enclos extérieur environ 24 heures après la chirurgie.
- Enregistrez les températures rectales quotidiennes pendant 3 semaines. Surveillez tout changement dans le pouls ou la fréquence respiratoire, la consommation alimentaire, le neurocomportement, la température corporelle, le poids, la posture, la santé oculaire et les signes cliniques de mauvaise santé. Rechercher un traitement vétérinaire approprié s’il y a des signes d’événements indésirables.
6. Évaluation de l’efficacité in vivo
- Si le but de l’injection de TVI est de préserver la vision, surveiller l’efficacité in vivo par des méthodes telles que les tests de labyrinthe ou l’électrorétinographie (ERG) pour évaluer la fonction des cellules rétiniennes ou la tomographie par cohérence optique (OCT) pour évaluer la structure rétinienne.
REMARQUE: Ces mesures d’efficacité ont été bien décrites après la thérapie génique IVT11,15,16.
7. Analyse tissulaire post-mortem
- Pratiquer l’euthanasie des moutons par une méthode approuvée à un critère d’évaluation approprié après une chirurgie par injection intravitréenne.
REMARQUE : Les méthodes d’euthanasie suggérées, comme les médicaments d’euthanasie vétérinaire intraveineuse ou un boulon perforant à la colonne cervicale suivie d’une exsanguination rapide, sont détaillées ailleurs15,16. - Récoltez des globes d’yeux de mouton à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants / émoussés incurvés. Couper le canthus latéral et médial pour augmenter l’ouverture de l’orbite, puis couper systématiquement à travers les plis conjonctivals, le tissu conjonctif, les muscles et le nerf optique pour libérer le globe oculaire de la cavité.
- Fixez par immersion des globes oculaires énucléés intacts dans du formol à 10% pendant 2 h, suivi d’une postfixation dans la solution de Bouin pendant 4 h, en faisant une petite coupe (0,5 cm) dans la sclérotique pour permettre une perfusion suffisante. Sinon, fixez les globes oculaires par immersion dans la solution de Davidson pendant 48 h.
- Traiter des sections de tissu oculaire par incorporation et sectionnement de routine à la cire de paraffine à 3-5 μm.
REMARQUE : Les procédures de coloration pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) et l’analyse immunohistochimique ont été décrites précédemment15,16. - Évaluer l’efficacité dans les tissus post-mortem par des mesures telles que l’épaisseur totale de la rétine, l’épaisseur de la couche rétinienne, le nombre de rangées cellulaires de la couche nucléaire externe et la coloration immunohistochimique pour les types de cellules rétiniennes, la glie rétinienne ou les protéines d’intérêt.
NOTE: Pour les protocoles de ces analyses, voir les publications précédentes15,16.
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Representative Results
L’efficacité de l’administration IVT d’un vecteur de thérapie génique CLN5 dans l’atténuation du dysfonctionnement et de la dégénérescence rétiniens chez les moutons atteints de LCN CLN5 a déjà été démontrée par ce groupe de recherche15. Les moutons atteints ont reçu une injection unique de 100 μL de CLN5 de CLN5 emballée dans un vecteur AAV sérotype 9 (AAV9) (AAV9. CLN5) dans un œil, l’œil controlatéral servant de contrôle interne non traité. La vision a été évaluée mensuellement à partir de l’âge au moment de l’injection (3 mois) jusqu’à la maladie terminale (18 mois). L’analyse post-mortem de l’histologie rétinienne a été réalisée sur des yeux traités et non traités, ainsi que sur des témoins sains appariés selon l’âge et affectés par CLN5.
L’analyse par électrorétinographie (ERG) a démontré une préservation de la fonction rétinienne dans l’œil traité, tandis que l’œil non traité a diminué de la même manière que les animaux atteints de CLN5 (Figure 4)15. L’histologie rétinienne était presque normalisée dans l’œil traité, avec une épaisseur rétinienne totale comparable à celle des animaux témoins sains dans la rétine centrale. En revanche, l’épaisseur de la rétine non traitée était comparable à celle des animaux atteints de CLN5 (Figure 5)15. La surcharge lysosomale, une caractéristique pathologique caractéristique du LCN, n’a pas été observée dans l’œil traité, mais était présente dans l’œil non traité15. Ces résultats démontrent que le vecteur de thérapie génique administré par injection de TVI a pu arrêter la pathogenèse de la maladie dans l’œil de mouton affecté par CLN5. L’expression de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), un marqueur du stress rétinien et de l’astroglie, était plus faible dans les yeux traités que dans les yeux non traités, ce qui indique que l’inflammation associée à la maladie était atténuée après le traitement (Figure 6)15.
Figure 4 : Réponses ERG adaptées à l’obscurité des moutons CLN5-/- après administration intravitréenne d’AAV9. CLN5. (A) Amplitudes moyennes (± SEM) des GRE au fil du temps chez les yeux traités (vert foncé, n = 3) et non traités (vert clair, n = 3) des moutons CLN5-/-, ainsi que chez les moutons témoins sains (bleu, n = 6) et CLN5 (rouge, n = 6). (B) Des traces représentatives d’ERG provenant des yeux traités et non traités et des témoins sains et des moutons affectés âgés de 5 (ligne noire) et de 17 (ligne grise) mois. * indique P < 0,05. Cette figure reproduite est tirée de Murray et al.15 avec la permission d’Elsevier. Abréviations : ERG = électrorétinographie; AAV = virus adéno-associé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Épaisseur rétinienne du mouton CLN5-/- après administration intravitréenne d’AAV9. CLN5. Photomicrographies représentatives de la coloration histologique H&E dans les yeux traités et non traités des moutons CLN5-/- par rapport aux témoins appariés selon l’âge. Les images et les mesures d’épaisseur ont été prises à deux endroits; rétine centrale (A-E) et rétine périphérique (F-J). (E) Épaisseur rétinienne moyenne (± SEM) (μm) dans la rétine centrale des yeux traités (vert foncé, n = 3) et non traités (vert clair, n = 3) par rapport à la rétine témoin saine (bleu, n = 4) et affectée par CLN5 (rouge, n = 4). (J) Épaisseur rétinienne moyenne (± SEM) (μm) dans la rétine périphérique des yeux traités et non traités des moutons CLN5-/- par rapport à la rétine saine et à la rétine affectée par CLN5. * indique P < 0,05, **** indique P < 0,0001. Barres d’échelle = 50 μm. Cette figure est reproduite à partir de Murray et al.15 avec la permission d’Elsevier. Abréviations : NFL = couche de fibres nerveuses; GCL = couche de cellules ganglionnaires; IPL = couche plexiforme interne; INL = couche nucléaire interne; BPO = couche plexiforme externe; ONL = couche nucléaire externe; IS/OS = segments interne et externe des photorécepteurs; EPR = épithélium pigmentaire rétinien. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Immunoréactivité du GFAP dans la rétine de moutons CLN5-/- après administration intravitréenne d’AAV9. CLN5. Images confocales représentatives de l’immunoréactivité du GFAP dans les yeux traités et non traités des moutons CLN5-/- par rapport aux témoins. (A-D) Immunoréactivité GGAP, (E-H) MARQUEUR NUCLÉAIRE DAPI, (I-L) images fusionnées des deux canaux. Barre d’échelle = 20 μm. Cette figure est reproduite à partir de Murray et al.15 avec la permission d’Elsevier. Abréviations : NFL = couche de fibres nerveuses; GCL = couche de cellules ganglionnaires; INL = couche nucléaire interne; ONL = couche nucléaire externe; IS/OS = segments interne et externe des photorécepteurs; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les injections intravitréennes sont l’une des interventions chirurgicales les plus courantes en ophtalmologie humaine et se sont révélées efficaces pour administrer des thérapies géniques médiées par AAV à la rétine des moutons. Nous avions précédemment démontré l’efficacité de l’AAV9. La thérapie génique CLN5 administrée par voie intravitréenne dans l’atténuation du dysfonctionnement rétinien et de la dégénérescence chez les moutons avec CLN5 NCL15. On espère que l’application de cette voie d’administration aux patients humains atteints de LCN s’avérera également bénéfique.
Le protocole pour les injections de TIV de petit volume dans un œil de mouton est relativement simple et non invasif, facilement reproductible et facile à apprendre pour un non-expert. Le succès dépend des cellules cibles dans la rétine, du traitement administré, ainsi que de l’emplacement et de la direction de l’injection elle-même. Bien que les injections de IVT soient souvent considérées comme les plus efficaces pour cibler les couches internes de la rétine, de nombreux chercheurs ont démontré l’efficacité des injections d’IVT dans les maladies où la rétine externe est le principal emplacement de la pathogenèse de la maladie15,17,18,19. Les différences dans les résultats fonctionnels et pathologiques après les injections de TPI sont également probablement liées au type de traitement administré. Par exemple, la thérapie génique pour délivrer des gènes codant pour des protéines solubles (par exemple, CLN5) s’est avérée beaucoup plus efficace que les thérapies géniques pour délivrer des gènes codant pour des protéines intracellulaires ou membranaires (par exemple, CLN6)15. Quels que soient la cible et le type de traitement, il est essentiel d’obtenir le site d’injection et l’angle corrects pour maximiser l’efficacité. Tel que décrit dans le protocole, le site d’injection pour les moutons doit être d’environ 7 mm en arrière de la sclérotique sur la face latérale de l’œil et incliné vers l’arrière pour cibler le vitré postérieur. L’inclinaison de l’aiguille est à la fois pour éviter le cristallin et pour diriger le médicament injecté le plus près possible de la rétine. L’utilisation d’une seringue de sécurité avec une aiguille fixe en permanence de 28 G (ou moins) x 0,5 dans un espace mort faible est cruciale pour minimiser l’inconfort lié à l’injection et le volume mort restant dans l’aiguille ou le moyeu. Cette aiguille de longueur peut être complètement insérée dans l’œil de mouton à un angle postérieur sans microscope chirurgical et/ou risque de perforation de la rétine. Les chercheurs qui ont accès à un microscope chirurgical peuvent l’utiliser pour fournir un niveau supplémentaire de certitude pour éviter la perturbation de la rétine. Sinon, l’utilisation de seringues de sécurité et la connaissance des dimensions du globe oculaire de mouton à l’âge traité sont suffisantes pour effectuer cette procédure en toute sécurité15.
Lorsque vous saisissez l’œil pour le faire pivoter médialement et exposer le site d’injection, il est essentiel d’utiliser des instruments atraumatiques non dentés pour éviter d’endommager le tissu délicat de l’œil. Si l’œil est positionné au centre, il est relativement simple de saisir la conjonctive bulbaire au bord de la sclérotique et de l’iris et de tourner d’une main, tout en injectant de l’autre main. Cependant, si l’œil a tourné décentrée, ce qui peut se produire sous anesthésie générale, il est souvent nécessaire d’utiliser un hémostatique pour serrer la conjonctive bulbaire et faire pivoter l’œil en position, laissant l’hémostat en place pour poursuivre la procédure.
Les yeux de mouton sont robustes et bien récupérés après un traitement IVT avec AAV9 porteur de CLN5 ovin, avec un seul mouton développant une uvéite dans l’œil traité 1 semaine après l’injection15. Dans ce cas, l’uvéite s’est résolue en 1 semaine et n’a eu aucun impact à long terme sur la vision. Mis à part ce seul cas, aucun effet négatif des injections de TIV n’a été signalé dans la première étude publiée15, ou chez les >30 animaux supplémentaires du programme de recherche injectés à l’âge de 3 mois, 6 mois ou 9 mois suivant le protocole décrit ici. Cependant, il existe d’autres mesures quantitatives de la sécurité des injections que les chercheurs pourraient envisager d’ajouter à leurs évaluations postopératoires. Il s’agit notamment des mesures de la pression intraoculaire (PIO), de l’imagerie du fond d’œil ou de l’OCT. Les images du fond d’œil avant et après l’injection peuvent mettre en évidence s’il y a eu une perturbation de la rétine en raison de l’injection et, à long terme, peuvent fournir un aperçu de la santé rétinienne en général.
Dans le cas où un marqueur fluorescent est injecté, l’imagerie par fluorescence du fond d’œil peut aider à visualiser la propagation du marqueur injecté16,20. La TCO peut être utilisée pour visualiser la rétine en coupe transversale in vivo afin d’identifier tout dommage structurel potentiel après l’injection et de mesurer l’épaisseur de la rétine au fil du temps en réponse au traitement. La fonction visuelle post-injection peut également être évaluée par ERG ou essai labyrinthe15,16. Dans le cas de la thérapie génique à médiation virale IVT, l’impact de la réponse immunitaire et la présence d’anticorps neutralisants dirigés contre les vecteurs AAV doivent être pris en compte. Bien que cela ne fasse pas partie du protocole décrit ici pour les moutons, il est suggéré que les sujets soient testés pour la présence d’anticorps neutralisants anti-AAV avant la thérapie génique, quelle que soit la voie d’administration, afin d’augmenter l’efficacité de la transduction16,21. Les lecteurs sont invités à consulter une analyse plus complète de la question des réponses immunitaires à l’AAV par Whitehead et coll.22.
Une complication fréquente au cours des procédures IVT est l’hémorragie sous-conjonctivale (SCH)23, qui peut survenir si les capillaires de la conjonctive bulbaire sont perforés lors de l’insertion de l’aiguille. Heureusement, les PPB sont généralement inoffensives et se résolvent en quelques jours; Cependant, il est préférable d’éviter les capillaires conjonctivals lors de l’insertion de l’aiguille. Après l’injection de TPI, il est important de traiter les yeux injectés avec des gouttes ophtalmiques antibiotiques (par exemple, le chloramphénicol) et de surveiller les yeux pour détecter tout signe d’infection ou d’inflammation (uvéite). Un autre événement courant au cours des procédures IVT est une augmentation de la PIO. Ces augmentations sont le plus souvent des pics de pression transitoires dans les minutes qui suivent l’injection et ne causent aucun dommage durable24,25. Cependant, il existe des cas où la PIO doit être envisagée et surveillée. Lorsque des affections oculaires préexistantes telles que le glaucome sont présentes, ou lorsque des volumes plus élevés (≥100 μL) sont injectés, la PIO doit être surveillée de près, et une paracentèse prophylactique de la chambre antérieure doit être envisagée pour réduire la pression dans le globe oculaire 4,16. En outre, les pics répétés de PIO dans le cas d’injections répétées de IVT peuvent être préoccupants et doivent être atténués comme ci-dessus4. Ici, nous démontrons la IVT aux fins d’une seule thérapie génique médiée par AAV; Par conséquent, les conséquences à long terme des injections répétées ne sont pas une considération majeure.
Les limites des injections de IVT comprennent la nécessité de pénétrer les barrières anatomiques et la spécificité cible inférieure par rapport aux méthodes plus invasives. Tout d’abord, la substance injectée sera diluée dans le vitré et aura ensuite une distance pour diffuser à travers la cavité vitrée et le tissu rétinien vers les cellules cibles. Cela signifie que la rétine interne est plus facilement transduite que la rétine externe après l’injection de TVI, et des doses plus élevées peuvent être nécessaires pour contrer la dilution26. Le protocole décrit ici souligne l’importance d’injecter le plus près possible de la rétine pour atténuer les effets de la dilution et de la diffusion à travers le corps vitré. Par conséquent, toute la longueur de l’arbre à aiguille de 0,5 po / 12,7 mm est insérée dans l’œil. L’avantage supplémentaire de l’insertion de la longueur totale de l’aiguille est la réduction du risque de reflux liquidien pendant l’injection 4,27.
Bien que ce protocole actuel l’omet, il est recommandé de retarder le retrait de l’aiguille de plusieurs minutes après l’injection afin de réduire davantage les risques de reflux liquidien. De plus, l’injection doit être effectuée lentement pour s’assurer que le jet de liquide injecté ne perturbe pas la rétine ou ne provoque pas un pic rapide de PIO, et qu’une vitesse d’injection accrue n’affecte pas les taux de diffusion à travers le vitré28,29. La membrane limite interne (ILM) est la principale barrière entre le vitré et la rétine, qui fonctionne pour restreindre le mouvement des molécules dans la rétine30. Cependant, la perméabilité de l’ILM peut être augmentée par la digestion ou le peeling chirurgical et est probablement augmentée dans l’œil malade, ce qui facilite la pénétration des molécules thérapeutiques.
En ce qui concerne la spécificité cible, l’administration de IVT a le moins par rapport à d’autres voies intraoculaires telles que la voie sous-rétinienne et suprachoroïdienne, comme discuté ci-dessus et ailleurs10. Cependant, de nouvelles générations d’AAV sont régulièrement développées pour contenir des modifications, qui améliorent le ciblage sur des types de cellules particuliers ou surmontent plus efficacement les obstacles tels que l’ILM31. L’utilisation de telles capsides modifiées a augmenté l’efficacité de la transduction après l’administration de TVI chez un certain nombre d’espèces modèles 5,32,33.
Le but de la thérapie génique détaillée par Murray et al.15 était de fournir une copie fonctionnelle du gène CLN5 ; par conséquent, une mesure de l’efficacité est la présence de cellules transduites exprimant la protéine CLN5. Nous avons tenté d’utiliser l’immunohistochimie pour détecter les cellules transduites par CLN5 dans la rétine, comme nous le faisons régulièrement dans le tissu cérébral des moutons; Cependant, l’anticorps que nous utilisons généralement dans le tissu cérébral flottant librement ne fonctionne pas dans le tissu rétinien incorporé dans la paraffine. Des dépannages et des recherches sur d’autres moyens de détecter le gène ou la protéine d’intérêt dans la rétine sont en cours pour ajouter à l’évaluation de l’efficacité. Une façon potentielle d’y parvenir est d’injecter un vecteur viral contenant un gène rapporteur (comme la protéine fluorescente verte; GFP) et l’évaluation de l’expression de la GFP par immunohistochimie. Une autre façon d’évaluer l’efficacité consiste à utiliser la PCR quantitative pour évaluer les niveaux d’expression des transgènes.
Le développement de protocoles pour les injections de IVT chez les grands animaux est une étape cruciale vers le traitement des maladies dégénératives de la rétine, en particulier les maladies à composante génétique, car la thérapie génique IVT est un traitement potentiel prometteur. Pour les maladies dégénératives où la rétine est déjà fragile, le traitement IVT présente moins de risque de décollement ou de déchirure de la rétine. Compte tenu des similitudes dans la taille et la structure des yeux des moutons et des humains, l’optimisation de la dose et du volume des injections de IVT chez les moutons est une étape pertinente vers la traduction à la clinique. Cet article détaille le protocole d’injection de IVT dans l’œil de mouton, qui est sûr et montre un très faible taux de réponses inflammatoires oculaires. Cette méthode démontre également l’efficacité de la thérapie génique oculaire médiée par AAV9 pour traiter la composante rétinienne du LCN chez les moutons.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) pour son aide dans l’établissement de ce protocole et la réalisation des injections décrites par Murray et coll.15. Les auteurs reconnaissent également le financement de CureKids New Zealand, de la Canterbury Medical Research Foundation, de Neurogene Inc et de la Batten Disease Support and Research Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
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