Summary
眼表面の炎症は眼の表面組織に害を及ぼし、眼の重要な機能を損ないます。本プロトコルは、マイボーム腺機能不全(MGD)のマウスモデルにおいて眼の炎症を誘発し、損なわれた組織を収集する方法を記載する。
Abstract
眼表面疾患には、角膜、結膜、および関連する眼表面腺ネットワークの機能と構造を乱すさまざまな障害が含まれます。マイボーム腺(MG)は、涙液膜の水性部分の蒸発を防ぐ被覆層を作成する脂質を分泌します。好中球と細胞外DNAトラップは、アレルギー性眼疾患のマウスモデルでMGと眼の表面に生息しています。凝集好中球細胞外トラップ(aggNET)は、MG出口を閉塞し、MG機能障害を条件付ける細胞外クロマチンで構成されるメッシュ状のマトリックスを定式化します。ここでは、眼表面炎症およびMG機能障害を誘発する方法が提示される。角膜、結膜、まぶたなど、眼の表面に関連する臓器を採取する手順が詳細に説明されています。各臓器を処理するための確立された技術を使用して、MG機能障害の主要な形態学的および組織病理学的特徴も示されます。眼の滲出液は、眼の表面の炎症状態を評価する機会を提供します。これらの手順により、前臨床レベルでの局所および全身の抗炎症介入の調査が可能になります。
Introduction
瞬きするたびに、角膜上に分散した滑らかな涙液膜が補充されます。眼表面上皮は、眼表面上の涙液膜の分布および正しい配向を促進する。ムチンは角膜と結膜の上皮細胞によって提供され、涙腺から来る涙液膜の水性部分を目の表面に配置するのに役立ちます。最後に、MGは、涙液膜1、2、3の水性部分の蒸発を防ぐ被覆層を作成する脂質を分泌する。このように、すべての眼器官の協調機能は、侵入する病原体や怪我から眼の表面を保護し、痛みや不快感なしに透き通った視力をサポートします。
健康な眼の表面では、眼を流れる分泌物または眼のリウマチがほこり、死んだ上皮細胞、細菌、粘液、および免疫細胞を一掃します。凝集好中球細胞外トラップ(aggNET)は、細胞外クロマチンで構成されるメッシュ状のマトリックスを定式化し、これらの成分を眼のリウマチに取り込みます。AggNETは、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインのタンパク質分解によって炎症を解消します4。しかし、それらが機能不全になると、これらの異常なアグネットは、COVID-195、胆石6、および唾液分泌症7の血管閉塞などの疾患の病因を引き起こします。同様に、眼表面のアグネットは保護的な役割を果たし、露出度の高い表面の炎症の解消に貢献します8。眼の表面に誇張された形成またはアグネットの欠如のいずれかが、涙液膜の安定性を損なうか、角膜創傷、瘢痕性結膜炎、およびドライアイ疾患を引き起こす可能性があります。例えば、MGの閉塞はドライアイ疾患の主な原因である9。AggNETは、MGの管からの脂質分泌の流れを塞ぎ、マイボーム腺機能障害(MGD)を引き起こすことも知られています。aggNETによるMG開口部の鬱血は、眼の表面を包む脂肪液と逆行性の瓶詰め液の不足を引き起こし、腺機能の機能不全と腺房損傷を引き起こします。この機能不全は、涙液膜の蒸発、まぶたの縁の線維化、眼の炎症、およびMG10,11への有害な損傷を引き起こす可能性があります。
ヒトにおけるMGDの病理学的過程を模倣するために、いくつかの動物モデルが長年にわたって開発されてきた。例えば、1歳のC57BL/6マウスは、50歳以上の患者の眼疾患の病理を反映して、ドライアイ疾患(DED)およびMGDに対する加齢に伴う影響の研究に役立っています12,13,14。さらに、ウサギは薬理学的介入の効果を調査するための適切なモデルである。したがって、ウサギにおけるMGDの誘導は、エピネフリンの局所投与または13-シス-レチノイン酸(イソトレチノイン)の全身導入のいずれかによって報告されています15,16,17,18,19。.
これらの動物モデルは、MGDの病態生理に寄与するさまざまな要因を決定するのに十分でしたが、その利用には制限がありました。例えば、加齢性MGDのマウスモデルは、高齢者のみの要素を解読するのに理想的であり、したがって、ウサギは複数の病態生理学的メカニズムの調査を可能にするため、眼の表面疾患を研究するのに最も適した動物モデルであると考えられました。しかし、眼の表面でタンパク質を検出するための包括的な分析ツールがなく、ウサギゲノムの多くの部分が注釈されていないため、調査には制限されています20,21。
さらに、ドライアイ疾患の病因を調査するために使用されたこれらの動物モデルは、眼表面の炎症を引き起こす障害の免疫学的アームを分析するための適切な詳細を提供しなかった。したがって、Ryesらによって開発されたMGDのマウスモデルは、マウスのアレルギー性眼疾患とヒトのMGDとの関連を示し、閉塞性MGD21の原因となる免疫病因を強調しました。このモデルは、アレルギー性眼疾患を、結膜とまぶたに好中球を動員し、MGDと慢性眼の炎症を引き起こすTH17応答に関連付けます21。このマウスモデルにおけるMGDおよび眼の炎症の誘導は、進行中の免疫応答によって引き起こされる局所炎症の発生中の上流のイベントを調査するための貴重なツールです21。現在のプロトコルは、閉塞性MGDを伴う眼表面の炎症について説明しています。この方法では、マウスを免疫し、2週間後、免疫原を用いて眼の表面に7日間挑戦する。さらに、急性炎症および角膜、結膜、および眼瞼の解剖中に眼の滲出液および関連する眼器官を単離する手順が記載されている。
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Protocol
動物を含むすべての手順は、動物福祉に関する制度的ガイドラインに従って実施され、フリードリヒアレクサンダー大学エアランゲンニュルンベルク(FAU)の動物福祉委員会によって承認されました(許可番号:55.2.2-2532-2-1217)。本研究では、7〜9週齢の雌C57Bl / 6マウスを使用しました。マウスは市販の供給源( 材料表を参照)から入手し、12時間の昼/夜サイクルで特定の病原体のない状態に保たれました。
1.マウス眼表面炎症の誘発
- 免疫のための免疫原調製を行う。
- 免疫原を新たに調製し、生理食塩水にオボアルブミン(OVA、50 mg / mL)と百日咳毒素(100 μg / mL)とアジュバント水酸化アルミニウム(40 mg / mL)( 材料表を参照)を1:1の割合で混合します。
注意: 層流安全キャビネットで百日咳毒素の開封、再構成、および免疫原の準備を実行します。防護服を着用し、皮膚との接触を避けてください。 - 免疫原とアジュバントの混合物を室温で30分間インキュベートし、100 μLを1 mLシリンジにロードします。
- 免疫原溶液の腹腔内注射を無麻酔マウスに行う。
- ケージグリッドをつかみながら、マウスの尾をそっと持ちます。親指と人差し指の間の背中の皮膚と首の部分をしっかりと持ち、薬指と小指の間の尾と下肢を手のひらに固定します。
- 固定マウスの頭を下に向けてください。
- 調製した免疫原溶液100μLを下腹腔の左右象限に注入します。
- 免疫原を新たに調製し、生理食塩水にオボアルブミン(OVA、50 mg / mL)と百日咳毒素(100 μg / mL)とアジュバント水酸化アルミニウム(40 mg / mL)( 材料表を参照)を1:1の割合で混合します。
- 予防接種の2週間後に眼の表面チャレンジを行います。
- マウスをイソフルラン(2.5%)で麻酔する。
- 片目のOVA(50 mg / mL)または生理食塩水(0.9%NaCl)を両眼に5 μL塗布し、滴が目に吸収されるまで待ちます。これには~5分かかります。
- この手順を1日1回7日間繰り返します。
注:薬の局所投与も同じ方法で行うことができます。
2.眼の滲出液の収集
- チャレンジの直後に50 μLの滅菌生理食塩水を眼に塗布することにより、チャレンジ段階で形成された眼の滲出液を回収します。
- シングルセル懸濁液を得るには、収集した眼の分泌物を補因子カルシウム(5 mM)を含む組換えMNase(2 x 106 gel U/mL、 材料の表を参照)で37°Cで20分間処理します。
- 室温で400 x g で7分間遠心分離します。
- 上清を単離し、製造元の指示に従ってマルチプレックスELISAを使用してサイトカインとケモカインを測定します( 材料表を参照)。
注:得られた上清はタンパク質分析に使用でき、ペレットはイムノフェノタイピング、食作用、脱顆粒、遺伝子発現などの機能アッセイに使用できます。
3.眼表面組織の切除
- 以下の手順に従って、まぶたとアイグローブを解剖します。
- CO2窒息および頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
- マウスを平らな面に置きます。
- 70%エタノールを染み込ませた綿棒で目の周りの眼窩領域を消毒します。
- 耳と眼窩後洞の間、および扁平上皮骨の上の表面に沿って垂直に切開を行い、上顎骨に沿って下まぶたの下、前頭骨に沿って上まぶたの上を水平に切開します。これにより、目の周りに切開が形成されます(図1)。
- 湾曲した鉗子を使用して、解剖した組織を目の周りで慎重に保持し、組織と眼球を引き出します。
- 切除した臓器を滅菌PBSに入れます。
- 切除した上まぶたの周りの余分な顔の筋肉組織をメスと実体顕微鏡でトリミングします。
- 以下の手順に従って結膜を収集します。
- 実体顕微鏡下で乾いたペトリ皿の上に上まぶたを置きます。
- 細いピンセットとメスを使用して、まぶたの内面から白っぽい粘液層を非常に穏やかに剥がします。
- 次に、以下の手順で角膜を解剖します。
- ドライアイスの上にある新しいドライペトリ皿にアイグローブを3分間置きます。
- ペトリ皿を安定した位置でベンチの表面に持っていきます。
- 細かい鋭いハサミを使用して、辺縁の隣の角膜の境界に小さな切開を行います。
- 眼球の周りのメスで切開を延長し、強膜を角膜から分離します。
- 生理食塩水でたっぷりと洗い流すことによって角膜の裏側から虹彩と水晶体の残りを取り除きます。
4.マイボーム腺(MG)閉塞の文書化
- MGとその開口部を評価するには、切除したまぶたを実体顕微鏡下で直立させます(図2)。
- カメラの露光時間とISO設定に従って、白色光落射照明で画像をキャプチャします。
注:これらの画像の形態測定分析は、腺の出口でのプラグサイズの信頼性の高い定量化を提供します。定量化は、ワンドツールでアイプラグの輪郭を描き、Image Jソフトウェアの「粒子を解析」コマンドを実行することで実行できます( 材料表を参照)。
5.まぶたの透過照明(マイボーム腺形態)
- MG領域を評価するには、切除したまぶたを水平に置き、赤外線カメラを備えた実体顕微鏡のバックライトをオンにします(図3)。
- カメラのISOに従って露光時間を調整して画像をキャプチャします( 材料表を参照)。
注:実体顕微鏡下でこれらの透過照明まぶたの赤外線イメージングは、各腺房の形状とサイズを測定するのに役立ちます。これらの画像の形態測定分析は、MGのサイズと数の信頼性の高い定量化を提供します。定量化は、ワンドツールでMGの輪郭を描き、Image Jソフトウェアの「粒子の解析」コマンドを実行することで実行できます。
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Representative Results
本プロトコルは、眼表面炎症のマウスモデルを確立するための逐次ステップを記載する。プロトコルは、治療法を局所的に適用し、眼の滲出液を取得し、健康なまぶたや炎症を起こしたまぶた(図2)、角膜、結膜などの関連する付属器官を切除する方法を示すことを目的としています。結膜の単離のために上まぶたを解剖するときは注意を払い、角膜の解剖中に1x PBSに保存する必要があります。これにより、結膜の乾燥が防止され、組織学的、薬物動態学的、および遺伝子発現の研究に使用できます。
OVAと生理食塩水は、上記のプロトコルに従って7日間連続して局所適用されました。.生理食塩水で局所的に挑戦されたマウスは、大きく開いた目と規則的なまばたきパターンを備えた健康な眼の表面を示しました。しかし、眼の炎症は、OVAに挑戦した免疫C57BL / 6Jマウスで扇動されました。眼の表面へのOVA溶液の点眼は、点眼後の最初の2時間、痛みではなくかゆみを引き起こした。滲出液とまぶたの湿疹は、チャレンジフェーズの最後の3日間にのみ観察されました。動物の行動を判断すると、痛みは明らかではありませんでした。したがって、短期間にわたるマウスに対する適度なレベルのストレスが想定された。毎日のOVAチャレンジは、豊富な眼の分泌物、ケモシス、狭い目の開口部などの臨床症状を引き起こしました。また、上まぶたと下まぶたが頻繁に付着し、まばたきの本質的な機能を損ないました(図2)。このモデルについては、厳格な中断基準 (補足ファイル) に従い、動物実験のために地元の倫理委員会によって承認されました。即時中断は、1匹のマウスが任意の時点で15ポイントに達した場合に実行されました。
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安楽死後、眼の臓器を切除し、より高い倍率で観察した。顕微鏡下で切除されたまぶたは、まぶたの内側を覆う腺の小さなプラグを示す健康なまぶたとはまったく対照的に、MGの開口部を塞ぐ大きな閉塞と浮腫を示しました(図3)。
腺の赤外線透過照明をさらに調べると、MGの腺房のラセミ体の外観が明らかになります。これにより、目に見えるマイボーム腺(赤で表示)を定量化することができます。生理食塩水チャレンジマウスのまぶたは、MGを形成する丸い腺房を示しました。比較すると、OVAの適用は、アレルギー性眼疾患のマウスにおいていくつかのMGの破壊および喪失を誘発した(AED、 図4)。まぶたの組織学的解析では、生理食塩水のみを7日間投与したナイーブマウスと比較してMGが拡張し(図5)、最終的に腺の開口部を閉塞する好中球が蓄積してアグネットを産生することがわかりました。
角膜を目の強膜から分離することは、目の球の滑りやすい粘膜表面のために面倒な場合があります。眼球をドライアイスの上でペトリ皿で3分間インキュベートすると、眼を固定し、辺縁部を少し切開し、角膜を解剖することができます(図6)。
プロトコルセクションに参加したステップは、角膜と結膜の収集を容易にしました。さらに、OVAの局所投与は結膜に重度の炎症を与え、充血の出現を示しました(図7)。
眼の滲出液の分析は、MGDの発症における分子メカニズムを明らかにします。記載されたサイトカインおよびケモカイン定量は、AED8を有するマウスからの上清において、好中球の溢出、食作用、および脱顆粒(CXCL−1)を促進する主要なケモカインのレベルの上昇を示した。さらに、急性期反応と好中球産生の主要なメディエーターであるIL-6も、AEDマウスで有意に上昇しました。一方、抗炎症性サイトカインであるIL-10の濃度は、ナイーブマウスとAEDマウスの両方で有意な変化を示さなかった(図8)。
図1:眼窩領域を囲む顔面組織の切除。 切開跡は赤で示されています。これにより、眼の臓器を切除し、結膜や角膜などの副眼の臓器に対するさまざまな局所投与された治療法の影響と効果を調査することができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:OVA投与はMGDの臨床症状を引き起こす 。 (A)生理食塩水を投与されたマウスは、目を大きく開いた健康な眼の表面を示す。(B)OVAの適用は、重度の眼表面の炎症、目の狭い開口部、およびケモシスの兆候を誘発します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:まぶたに沿って位置するマイボーム腺(MG)を塞ぐ管管プラグ。 (A)生理食塩水を7日間のみ投与したマウスからの過剰な眼球分泌のない健康なまぶたの代表的なマクロ写真。(B)チャレンジ期間後にMGの大きな乳管閉塞と浮腫を示すまぶた。スケールバー= 300μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マクロ写真を透過的に照射することで、MGの腺房(赤い線)を視覚化できます。 (A)赤外線レベルを高めると、ナイーブマウスの健康な腺房が視覚化され、健康なまぶたにはっきりとしたポケット型の腺房が明らかになります。(B)腺房は、OVAを適用するとマウスの影響を受けたまぶたに厚く見えます。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:まぶたの組織学的分析は、OVAの傷害を7日間繰り返し たマウスのMGの拡張管を示しています。 (A)ナイーブマウスのまぶたは、拡張した管がないことを示し、OVAチャレンジのマウスとは対照的に、正常に機能する眼の器官(B)を示しています。スケールバー= 200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:辺縁の隣の角膜を切開し、強膜から角膜を分離する。 切開点を示す眼球の画像(白い矢印で示す)。スケールバー= 500μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:OVAの局所投与 。 (A)角膜を示すマウス眼器官のマクロ写真。スケールバー:600μm。 (B)OVAに挑戦したマウスからの炎症性結膜。スケールバー:100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:採取した眼滲出液中の炎症マーカーの測定。 ナイーブマウス(n = 7)およびMGDマウス(n = 8)の遠心分離された眼滲出液の上清中のサイトカインおよびケモカインの定量分析。データは、5%〜95%の範囲の中央値で表されます。統計的有意性は、両側マン・ホイットニーU検定を用いて計算した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マイボーム腺の油性分泌は、健康な目にとって非常に重要です22。しかしながら、両眼瞼の足根板上に位置する平行鎖として並ぶ凝集好中球細胞外トラップ(aggNET)によるこれらの皮脂腺の閉塞は、涙液膜23を破壊する可能性がある。この破壊は、マイボーム腺機能障害(MGD)1 と涙液の蒸発の加速をもたらし、眼の表面2の損傷を条件付けます。このプロトコルは、MG閉塞につながる免疫介在性眼表面炎症の確立について説明しています。
マウスモデルからの研究は、眼の表面炎症に関連するMG閉塞を引き起こす根本的な免疫媒介メカニズムを確認しました。AEDのマウスモデルにおける好中球を動員する強力なTH17応答、およびMGD患者の涙液中の好中球および他の骨髄細胞の増加は、MG21を妨害する好中球の役割を示しています。MG開口部を閉塞するaggNETの存在は、AEDを有するマウスにおいてペプチジルアルギニンデイミナーゼ4で確認された。このモデルでは、好中球は凝集する能力の低下を示し、MG腺の管と開口部を塞ぐアグネットを形成しました10。さらに、MGD患者からの涙液分析は、アナフィラトキシンC5aおよびケモカインIL-8の増加を示し、補体系の活性の増加および好中球浸潤の高流入を示した。最後に、IL-6、IL-18、MCP-1 / CCL-2、およびMIG / CXCL9などのいくつかの好中球機能に関連するサイトカインのレベルの増加は、MGD11の病因における好中球の主要な位置を強調しています。
MGDの発生はDEDの発症に大きく貢献しており、眼の症状の病因に関与する多数の要素の役割を調べることは複雑です24。したがって、モデルとしての動物の選択は、調査中の質問に大きく影響されます。例えば、ウサギは製剤の医薬品試験のための従来のモデルとして機能します。ネコ、ブタ、およびイヌのモデルは、ヒト患者と同様の病理学的特徴を調査するのに適しており、マウスは主に遺伝子操作に適している25。
動物モデルは、疾患の病因を調査し、 in vivoでのさまざまな介入の治療効果を調べるための貴重なツールです。例えば、従来の治療には、臨床的眼症状を治療するための点眼点眼の投与が含まれる。しかしながら、涙液流および涙流ドレナージシステムのために、そのような眼の介入は眼の表面から迅速に除去される。これは一時的な作用のみを引き起こし、反復投与と高用量を必要とします。この問題を解決するために、ドライアイ疾患(DED)のウサギモデルは、代替局所治療としてサーモゲルと炭化ナノゲル(CNG)を調べるための理想的な媒体として役立ちました。異なる程度のヒアルロン酸とアミン末端ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)を結合させることによって得られるサーモゲルは、眼に投与されると、ゲルに変化する。DEDのウサギモデルでは、このゲルはより長い時間保持され、1滴で損傷した角膜上皮を修復し、アポトーシスを停止し、7日間の追跡期間中に眼の炎症を抑制し、セレクチンを介した白血球相互作用の阻害による白血球浸潤の中断を示唆しています26。
さらに、DEDのウサギモデルでは、点眼剤としての炭化ナノゲル(CNG)は、悪化した炎症反応と酸化ストレスによって引き起こされる涙液欠乏症と過度の涙液蒸発を治療するフリーラジカル消去を示しました。塩酸リジン(Lys-CNG)の熱分解によってCNGが得られ、投与され、単回投与で4日以内にDED症状が緩和されました。同様の治療効果は、10倍多い量のシクロスポリンA点眼薬のいくつかの治療でのみ達成可能でした。.これらの新しい生体適合性の薬学的介入は、前臨床動物モデルにおいて単回投与介入およびより延長された眼の保持として優れた視点を示した27。
マウスモデルにおけるいくつかの遺伝子のノックアウトは、MGDの病因に関与する複数のタンパク質の役割を明らかにしました。例えば、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ(PPAR γ)24 の調節不全の遺伝子発現とそのシグナル伝達経路の変化は、加齢中の細胞周期の侵入/増殖、脂質合成、およびマイボーム腺萎縮の変化を誘発します13。さらに、マウスモデルにβENaC(β-上皮性ナトリウムチャネル)がないことは、女性に蔓延するMG機能障害表現型が、偽性低アルドステロン症のヒトと同様にMG萎縮および開口部閉塞と関連していることを示しました1(PHA)28。CD147の本質的な役割はマウスでも解明されており、減数分裂細胞の豊富な脂質含有量を維持すると考えられています29。酵素スーパーオキシドジスムターゼ1を欠損したマウスは、酸化脂質およびDNA損傷の上昇を示し、これはMG炎症の増加と関連していた30。最後に、マイバムリピドームを形成する超長鎖脂肪酸残基を合成するのに必要な酵素をコードするELOVL4における単一の変異は、前眼表面31の機能的変化をもたらす。興味深いことに、MGDは、眼科用製剤としてのアジスロマイシンの治療有効性を評価するために、不完全な脂質組成を有する特別な食事を有するマウスにおいても誘導された32。
マウスモデルを用いた研究のほとんどは、MGDに関与するいくつかの遺伝子を特定していますが、多くは根本的な免疫学的状態を欠いています。AEDモデルは、免疫応答の誘導、IgE抗体の生成、およびエフェクター相から、ヒト蒸発MGDに似たいくつかの病理学的変化を伴う、可能な介入の全範囲を提供します。
上記のプロトコルを利用してMGDを調査する場合、ミョウバンに免疫原(OVAと百日咳毒素)を1:1の割合で追加することが重要です。ミョウバンへのオボアルブミン-百日咳毒素の良好な吸着のために、室温で30分間混合物をインキュベートする必要があります。これらの相互作用は、適切な免疫応答を引き起こすために不可欠です。さらに、予防接種中は、腹膜腔の根底にある臓器に穿孔する可能性があるため、注射中に注意を払う必要があります。これは、マウスの不十分な免疫化と全身性炎症をもたらし、免疫応答に深刻な影響を与える可能性があります。
眼の滲出液は、浸潤免疫細胞をケージする大きなウェブ状の細胞外クロマチン構造です。したがって、このモデルから採取された眼滲出液のMNase処理は、単一細胞懸濁液を得るために不可欠である11。さらに、これらの滲出液は眼の表面で収集しやすく、循環から移動した生存可能な好中球の供給源です。この技術の主な制限は、眼の表面から収集される滲出液の量です。各眼に50 μLの生理食塩水を加えることで、1匹のマウスから最大100 μLの滲出液を回収できます。これは、生化学的研究のための1-2フローサイトメトリー(FACS)染色および上清にはかろうじて十分です。
メスで解剖して後で目や周囲の組織を摘採すると、表在側頭静脈、下眼瞼静脈、または眼角静脈に損傷を与えることがよくあります。出血はさらなる組織学的調製を妨げる可能性があるため、目の周りの深さの少ない皮膚に切開を作成することをお勧めします。1つの組織の解剖中、乾燥または不十分な潤滑は構造的特徴の喪失をもたらす可能性があるため、他の組織をPBSに保存することが不可欠です。
眼球からの角膜の解剖中に、ドライアイス上での眼球のインキュベーションが安定した制御を可能にしない場合、辺縁部の切開および角膜の分離が可能になるように、時間を最大5分まで延長することができる。
適用例
MGDに関連する眼の表面炎症は多因子性疾患です。これらの脂質分泌腺の機能不全の発症および進行は、眼科的、全身的、ホルモン的、および遺伝的要因、化学物質、薬物、機械的有害物質、および免疫学的反応によって引き起こされる可能性があります33。いくつかの研究は、マイボーム腺の閉塞と炎症を引き起こす好中球を報告しています11、21、34、35、36、37、38。これらの免疫経路を妨害する局所的および全身的な抗炎症介入の開発は、MGDによる眼の不快感に苦しむ患者に救済を提供することができます。アレルギー性眼疾患のマウスモデルは、これらの薬剤の薬物動態学的および薬力学的特性を調査するために前臨床設定で利用することができる。この疾患モデルは、MGDに取り組むための適切な戦略の開発を可能にし、疾患を引き起こす経路の重要な成分を標的とする局所または全身の抗炎症剤の適切な投与を決定するのに役立ちます。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この作業は、ドイツ研究財団(DFG)2886 PANDORAプロジェクト-No.B3によって部分的にサポートされました。SCHA 2040/1-1;MU 4240/2-1;CRC1181(C03);TRR241(B04)、H2020-FETOPEN-2018-2020プロジェクト861878、およびフォルクスワーゲン財団(助成金97744)からMHへ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
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