Summary
眼表炎症会损害眼表组织并损害眼睛的重要功能。本协议描述了一种在睑板腺功能障碍（MGD）的小鼠模型中诱导眼部炎症和收集受损组织的方法。
Abstract
眼表疾病包括一系列干扰角膜、结膜和相关眼表腺网络的功能和结构的疾病。睑板腺（MG）分泌脂质，形成覆盖层，防止泪膜水部分蒸发。中性粒细胞和细胞外DNA陷阱在过敏性眼病小鼠模型中填充MG和眼表。聚集的中性粒细胞细胞外陷阱（aggNET）形成由细胞外染色质组成的网状基质，可阻塞MG出口并调节MG功能障碍。本文提出了一种诱导眼表炎症和MG功能障碍的方法。详细描述了收集与眼表相关的器官的程序，例如角膜，结膜和眼睑。使用处理每个器官的既定技术，还显示了MG功能障碍的主要形态学和组织病理学特征。眼渗出物提供了评估眼表炎症状态的机会。这些程序能够在临床前水平上研究局部和全身抗炎干预。
Introduction
每眨眼一下，就会补充分散在角膜上的光滑泪膜。眼表上皮有助于泪膜在眼表的分布和正确定向。粘蛋白由角膜和结膜上皮细胞提供，以帮助定位泪膜的水部分，这些泪膜来自眼睛表面的泪腺。最后，MG分泌脂质，形成覆盖层，防止泪膜1，2，3的水性部分蒸发。以这种方式，所有眼器官的协调功能保护眼表免受病原体入侵或伤害，并支持水晶般清晰的视力，而没有任何疼痛或不适。
在健康的眼表，眼流分泌物或眼部风湿可清除灰尘、死去的上皮细胞、细菌、粘液和免疫细胞。聚集的中性粒细胞细胞外陷阱（aggNET）配制由细胞外染色质组成的网状基质，并将这些成分掺入眼风湿中。AggNETs通过促炎细胞因子和趋化因子的蛋白水解降解来解决炎症4。然而，当它们变得功能失调时，这些异常的 aggNET 会驱动疾病的发病机制，例如 COVID-195、胆结石6 和唾液石症7 中的血管闭塞。同样，眼表上的aggNETs起着保护作用，有助于解决高度暴露表面的炎症8。眼表过度形成或缺乏 aggNET 都会损害泪膜稳定性和/或导致角膜伤口、瘙痒性结膜炎和干眼症。例如，MG的梗阻是干眼症的主要原因9。众所周知，AggNETs会堵塞MG导管的脂质分泌流并导致睑板腺功能障碍（MGD）。aggNETs对MG孔的充血导致缺乏脂肪液包裹眼表和逆行封堵液，导致腺体功能障碍和腺泡损伤。这种功能障碍会导致泪膜蒸发、眼睑边缘纤维化、眼睛发炎以及对 MG10，11 的有害损害。
多年来，已经开发了几种动物模型来模仿人类MGD的病理过程。例如，1岁的C57BL / 6小鼠帮助研究了与年龄相关的对干眼病（DED）和MGD的影响，反映了50岁及以上患者的眼部疾病病理学12，13，14。此外，兔子是研究药物干预效果的适当模型。因此，通过局部给予肾上腺素或全身引入13-顺式维甲酸（异维A酸）15，16，17，18，19在兔中诱导MGD已有报道。
尽管这些动物模型足以确定导致MGD病理生理学的不同因素，但它们的使用受到限制。例如，与年龄相关的MGD的小鼠模型仅适用于破译老年人的元素，因此，兔子似乎是最适合研究眼表疾病的动物模型，因为它们能够研究多种病理生理机制。然而，由于缺乏全面的分析工具来检测眼表的蛋白质，并且由于兔基因组的许多部分没有注释，它们仅限于研究20，21。
此外，这些用于研究干眼病发病机制的动物模型没有提供足够的细节来分析引发眼表炎症的疾病的免疫学臂。因此，由Reyes等人开发的MGD小鼠模型显示小鼠过敏性眼病与人类MGD之间存在关联，并强调了导致阻塞性MGD21的免疫病因。该模型将过敏性眼病与TH17反应相关联，TH17反应将中性粒细胞募集到结膜和眼睑，导致MGD和慢性眼部炎症21。在该小鼠模型中诱导MGD和眼部炎症是研究由持续免疫反应驱动的局部炎症发展过程中上游事件的宝贵工具21。目前的方案描述了伴有阻塞性MGD的眼表炎症。在该方法中，对小鼠进行免疫接种，并在2周后用免疫原在眼表上激发7天。此外，还描述了在急性炎症期间分离眼渗出物和相关眼器官的步骤以及角膜、结膜和眼睑的解剖。
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Protocol
所有涉及动物的程序均根据动物福利机构指南进行，并经埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学（FAU）动物福利委员会批准（许可证号：55.2.2-2532-2-1217）。本研究使用年龄为7-9周的雌性C57Bl / 6小鼠。从商业来源获得小鼠（见 材料表），并以12小时昼夜循环保存在特定的无病原体条件下。
1.诱导小鼠眼表炎症
- 进行免疫接种的免疫原准备。
- 在免疫当天新鲜制备免疫原，将卵清蛋白（OVA，50 mg / mL）和百日咳毒素（100 μg/ mL）混合在盐水中，并将佐剂氢氧化铝（40 mg / mL）（见 材料表）按1：1的比例混合。
注意：在层流安全柜中进行百日咳毒素的打开、重建和免疫原制备。穿防护服，避免与皮肤接触。 - 将免疫原和佐剂混合物在室温下孵育 30 分钟，然后将 100 μL 加载到 1 mL 注射器中。
- 在非麻醉小鼠中腹膜内注射免疫原溶液。
- 轻轻握住鼠标的尾巴，同时抓住笼子网格。用拇指和食指牢牢握住背部和颈部区域的皮肤，将无名指和小指之间的尾巴和下肢固定在手掌上。
- 保持固定鼠标的头部朝下。
- 在下腹腔的右象限或左象限中注入100μL制备的免疫原溶液。
- 在免疫当天新鲜制备免疫原，将卵清蛋白（OVA，50 mg / mL）和百日咳毒素（100 μg/ mL）混合在盐水中，并将佐剂氢氧化铝（40 mg / mL）（见 材料表）按1：1的比例混合。
- 免疫接种后 2 周进行眼表激发试验。
- 用异氟醚（2.5%）麻醉小鼠。
- 双眼每只眼睛涂抹 5 μL OVA （50 mg/mL） 或生理盐水 （0.9 % NaCl），等待滴剂被眼睛吸收。这需要~5分钟。
- 每天重复该过程 1 次，持续 7 天。
注意：局部给药可以以相同的方式进行。
2.眼渗出物的收集
- 通过在激发后立即向眼睛施用 50 μL 无菌盐水来恢复在挑战阶段形成的眼分泌物。
- 为了获得单细胞悬浮液，用含有辅因子钙（5mM）的重组MNase（2 x 106 凝胶U / mL，参见 材料表）在37°C下处理收集的眼分泌物20分钟。
- 在室温下以400× g 离心7分钟。
- 分离上清液并根据制造商的说明使用多重ELISA测量细胞因子和趋化因子（参见 材料表）。
注意：获得的上清液可用于蛋白质分析，沉淀可用于功能测定，例如免疫表型，吞噬作用，脱颗粒和基因表达。
3.眼表组织切除
- 按照以下步骤解剖眼睑和眼球。
- 通过CO2 窒息和颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
- 将鼠标放在平坦的表面上。
- 用浸有70%乙醇的拭子对眼睛周围的眼眶区域进行消毒。
- 在耳朵和眶后窦之间，沿着鳞状骨上方的表面垂直切开一个切口，将切口沿上颌骨水平延伸至下眼睑下方，沿额骨在上眼睑上方水平延伸。这在眼睛周围形成一个切口（图1）。
- 使用弯曲的镊子小心地将解剖的组织固定在眼睛周围，然后将组织和眼球拉出。
- 将切除的器官放入无菌PBS中。
- 使用手术刀和体视显微镜下修剪切除的上眼睑周围多余的面部肌肉组织。
- 按照以下步骤收集结膜。
- 将上眼睑放在立体显微镜下的干燥培养皿上。
- 使用细镊子和手术刀，非常轻柔地从眼睑内表面剥离白色粘液层。
- 接下来，按照以下步骤解剖角膜。
- 将眼球放在干冰顶部的新干培养皿上3分钟。
- 将培养皿以稳定的位置放在工作台表面上。
- 用细而锋利的剪刀在角膜缘旁边的角膜边缘做一个小切口。
- 用手术刀在眼球周围延长切口，将巩膜与角膜分开。
- 通过大量用盐水冲洗，从角膜背面去除虹膜和晶状体的残留物。
4. 睑板腺（MG）梗阻的记录
- 为了评估MG及其孔口，将切除的眼睑放在体视显微镜下的直立位置（图2）。
- 根据相机的曝光时间和ISO设置，使用白光落射照明拍摄图像。
注意：对这些图像的形态学分析提供了腺体出口处塞子尺寸的可靠量化。定量可以通过用魔杖工具勾勒眼塞并执行Image J软件的“分析颗粒”命令来执行（参见 材料表）。
5. 眼睑透照（睑板腺形态）
- 要评估MG区域，请将切除的眼睑置于水平位置，并打开配备红外摄像头的立体显微镜的背光（图3）。
- 根据相机的ISO调整曝光时间（参见 材料表），以捕获图像。
注意：在体视显微镜下对这些透照眼睑的红外成像可以帮助测量每个腺泡的形状和大小。这些图像的形态学分析提供了MG大小和数量的可靠定量。可以通过使用魔杖工具勾勒出MG并执行Image J软件的“分析颗粒”命令来进行定量。
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Representative Results
本协议描述了建立眼表炎症小鼠模型的顺序步骤。这些协议旨在展示如何在局部应用治疗，获取眼部渗出物，并切除相关的辅助器官，如健康和发炎的眼睑（图2），角膜和结膜。解剖上眼睑时必须注意结膜的隔离，并且在角膜解剖期间必须将其储存在1x PBS中。这将防止结膜干燥，结膜可用于组织学、药代动力学和基因表达研究。
按照上述方案连续7天局部施用OVA和生理盐水。局部用盐水攻击的小鼠显示出健康的眼表，眼睛睁开，有规律的眨眼模式。然而，在用OVA攻击的免疫C57BL / 6J小鼠中煽动了眼部炎症。滴注后的前2小时内，在眼表滴注OVA溶液引起瘙痒，而不是疼痛。渗出液和眼睑湿疹仅在挑战阶段的最后3天观察到。判断动物的行为，没有明显的疼痛。因此，假设小鼠在短时间内承受适度的压力。每日OVA挑战引发了临床表现，如大量眼分泌物，水肿和眼睛狭窄。此外，上下眼睑经常相互粘附，损害了眨眼的基本功能（图2）。该模型遵循严格的中断标准 （补充文件）， 并得到当地动物实验伦理委员会的批准。如果一只鼠标在任何给定时间达到 15 点，则立即中断。
补充文件。请点击此处下载此文件。
安乐死后，切除眼器官并在更高的放大倍数下观察。显微镜下切除的眼睑显示大片闭塞堵塞了MG的孔口和水肿，与健康眼睑显示眼睑内壁腺体的小塞形成鲜明对比（图3）。
对腺体红外透照的进一步检查揭示了MG腺泡的外消旋外观。这允许量化可见的睑板腺（以红色表示）。来自盐水挑战小鼠的眼睑显示形成MG的圆形腺泡。相比之下，OVA的应用在过敏性眼病小鼠中诱导了一些MG的破坏和损失（AED， 图4）。眼睑的组织学分析显示，与仅用盐水施用7天的幼稚小鼠相比，MG扩张（图5），允许中性粒细胞积累产生aggNET，最终阻塞腺体的孔口。
由于眼球粘液表面湿滑，将角膜与眼睛巩膜分开可能很麻烦。将眼球在培养皿中的干冰上孵育3分钟可以固定眼睛，在角膜缘处做一个小切口，并解剖角膜（图6）。
协议部分中列出的步骤有助于角膜和结膜的收集。此外，OVA的局部给药对结膜造成严重炎症，出现充血外观（图7）。
眼分泌物分析揭示了MGD发展的分子机制。如前所述细胞因子和趋化因子定量显示，主要趋化因子水平升高，促进AED8小鼠上清液中的中性粒细胞外渗、吞噬作用和脱颗粒（CXCL-1）。此外，急性期反应和中性粒细胞产生的主要介质IL-6在AED小鼠中也显着升高。另一方面，IL-10（一种抗炎细胞因子）的浓度在幼稚小鼠和AED小鼠中均未显示显着变化（图8）。
图1：切除眼眶区域周围的面部组织。 切口轨迹以红色表示。这允许切除眼器官并研究各种局部给药疗法对结膜和角膜等辅助眼器官的影响和效果。 请点击此处查看此图的大图。
图2：OVA给药引起MGD的临床表现 。 （A）给予盐水的小鼠显示出健康的眼表，眼睛睁得大大的。（B）OVA应用诱发严重的眼表炎症，眼睛狭窄的睁开和水肿的迹象。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：导管栓阻塞了位于眼睑的睑板腺 （MG）。 （A）健康眼睑的代表性微距照片，仅7天从给予盐水的小鼠中没有过多的眼分泌物。（B）挑战期后眼睑显示MG的大导管闭塞和水肿。比例尺 = 300 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：透照微距摄影可实现 MG 腺泡（红线）的可视化。 （A）提高红外水平使幼稚小鼠的健康腺泡可视化，并揭示健康眼睑中独特的口袋形腺泡。（B）使用OVA后，腺泡在小鼠受影响的眼睑中显得很厚。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图5：眼睑的组织学分析显示，重复OVA损伤7天的小鼠中MG导管扩张。 （A）幼稚小鼠眼睑显示没有任何扩张的导管，描绘了一个健康功能的眼器官（B），与具有OVA挑战的小鼠相比。比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图6：角膜缘旁边的角膜切口以及角膜与巩膜的分离。显示切口点的眼球图像（由白色箭头表示）。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图7：OVA的局部给药 。 （A）显示角膜的小鼠眼器官的宏观照片。比例尺：600μm。 （B）来自用OVA攻击的小鼠的发炎结膜。比例尺：100 μm。 请点击这里查看此图的大图。
图8：收集的眼分泌物中炎症标志物的测量。 幼稚小鼠（n = 7）和MGD小鼠（n = 8）离心眼分泌物上清液中细胞因子和趋化因子的定量分析。数据以中位数表示，范围为 5%-95%。使用双尾曼-惠特尼U检验计算统计学显著性。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
睑板腺的油性分泌物对健康的眼睛非常重要22。然而，聚集的中性粒细胞细胞外陷阱（aggNET）阻塞这些皮脂腺，这些中性粒细胞细胞外陷阱（aggNET）排列成位于双眼睑睑板上的平行链，可以破坏泪膜23。这种破坏导致睑板腺功能障碍（MGD）1 和加速泪液蒸发并调节眼表损伤2。该协议描述了建立导致MG梗阻的免疫介导的眼表炎症。
来自小鼠模型的研究已经证实了导致与眼表炎症相关的MG阻塞的潜在免疫介导机制。在AED小鼠模型中募集中性粒细胞的强烈TH17反应以及MGD患者泪液中中性粒细胞和其他骨髓细胞的增加表明中性粒细胞阻碍MG21的作用。在患有AED的小鼠中，肽基精氨酸脱亚胺酶4证实了aggNETs闭塞MG孔的存在。在该模型中，中性粒细胞显示出聚集和形成阻塞MG腺体导管和孔口的agGNETT的能力降低10。此外，MGD患者的泪液分析显示过敏毒素C5a和趋化因子IL-8增加，表明补体系统的活性增加和中性粒细胞浸润的大量流入。最后，与几种中性粒细胞功能（如IL-6，IL-18，MCP-1 / CCL-2和MIG / CXCL9）相关的细胞因子水平升高强调了中性粒细胞在MGD11发病机制中的主要位置。
MGD的发生是DED发展的重要因素，并且检查参与眼部表现发病机制的众多元素的作用是复杂的24。因此，动物作为模型的选择受到所调查问题的严重影响。例如，兔子是制剂药物测试的传统模型;猫科动物、猪和犬类模型适用于研究与人类患者相似的病理特征，小鼠主要适用于基因操作25。
动物模型是研究疾病发病机制和检查 体内各种干预措施的治疗效果的宝贵工具。例如，常规治疗包括滴眼液以治疗临床眼部表现;然而，由于泪液流和泪液引流系统，这种眼部干预会迅速从眼表移除。这仅引起暂时作用，需要重复给药和高剂量。为了解决这个问题，干眼病（DED）的兔子模型是检查热凝胶和碳化纳米凝胶（CNG）作为替代局部治疗的理想介质。通过不同程度的透明质酸硫酸化和胺封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）共轭获得的热凝胶，当施用于眼睛时，会转化为凝胶。在DED的兔模型中，这种凝胶保留了更长的时间，在7天的随访中，单滴修复了受损的角膜上皮，停止了细胞凋亡，并抑制了眼部炎症，这表明由于抑制选择素介导的白细胞相互作用，白细胞浸润中断26。
此外，在DED的兔模型中，碳化纳米凝胶（CNGs）作为滴眼液显示出自由基清除，治疗由炎症反应和氧化应激加剧引起的泪液缺陷和过度泪液蒸发。通过盐酸赖氨酸（Lys-CNGs）热解获得CNGs并给药，单剂量在4天内减轻DED症状。类似的治疗效果只能通过几次治疗10倍以上的环孢素A滴眼液滴注来实现。这些新型生物相容性药物干预在临床前动物模型中表现出作为单剂量干预和更延长的眼部保留的优越前景27。
小鼠模型中几个基因的敲除揭示了参与MGD发病机制的多种蛋白质的作用。例如，过氧化物酶体增殖物激活的受体γ（PPAR γ）24 的失调基因表达及其信号通路的改变诱导细胞周期进入/增殖，脂质合成和衰老过程中睑板腺萎缩的变化13。此外，小鼠模型中βENaC（β - 上皮钠通道）的缺失表明，女性中普遍存在的MG功能障碍表型与MG萎缩和口梗阻有关，就像假性醛固酮增多症1（PHA）28一样。CD147的重要作用也在小鼠中阐明，并且被认为可以维持减数细胞29的丰富脂质含量。缺乏超氧化物歧化酶1的小鼠表现出升高的氧化脂质和DNA损伤，这与MG炎症30的增加有关。最后，ELOVL4中编码合成形成睑板脂质组的极长链脂肪酸残基所需的酶的单个突变导致前眼表的功能变化31。有趣的是，MGD也在脂质组成不完整的特殊饮食小鼠中诱导，以评估阿奇霉素作为眼科制剂的治疗效果32。
虽然大多数使用小鼠模型的研究已经确定了几个参与MGD的基因，但许多缺乏潜在的免疫疾病。AED模型提供了一系列可能的干预措施，从诱导免疫反应，产生IgE抗体和效应阶段，伴随着类似于人类蒸发性MGD的几种病理变化。
当使用上述方案研究MGD时，以1：1的比例将免疫原（OVA和百日咳毒素）添加到明矾中至关重要。应在室温下将混合物孵育30分钟，以使卵清蛋白 - 百日咳毒素很好地吸附到明矾中。这些相互作用对于触发足够的免疫反应至关重要。此外，在免疫接种期间，注射时必须注意，因为这可能导致腹膜腔下层器官穿孔。这可能导致小鼠免疫不足和全身炎症，对免疫反应产生深远影响。
眼部渗出物是大的网状细胞外染色质结构，笼状浸润免疫细胞。因此，MNase处理从该模型收集的眼分泌物对于获得单细胞悬液至关重要11。此外，这些渗出物很容易聚集在眼表，并且是从循环中迁移的活中性粒细胞的来源。该技术的主要局限性是从眼表收集的渗出物量。向每只眼睛添加 50 μL 生理盐水可从一只小鼠中回收多达 100 μL 的渗出物。这对于用于生化研究的 1-2 次流式细胞术 （FACS） 染色和上清液来说几乎不够。
用手术刀解剖，然后拔除眼睛和周围组织，通常会导致颞浅静脉、睑下静脉或眼角静脉损伤。建议在眼睛周围深度较小的皮肤上创建一个切口，因为出血会干扰进一步的组织学准备。在解剖一个组织的过程中，将其他组织储存在PBS中是必不可少的，因为干燥或润滑不足会导致结构特征的丧失。
在从眼球上解剖角膜期间，如果眼球在干冰上的孵育不能实现稳定的控制，则可以将时间延长至5分钟，以便切口在角膜缘处并分离角膜是可能的。
潜在应用
与MGD相关的眼表炎症是一种多因素疾病。这些脂质分泌腺功能障碍的发展和进展可由眼科、全身、激素和遗传因素、化学物质、药物、机械毒剂和免疫反应引起33。一些研究报告了中性粒细胞导致睑板腺闭塞和炎症11，21，34，35，36，37，38。开发干扰这些免疫途径的局部和全身抗炎干预措施可以为因MGD而遭受眼部不适的患者提供缓解。过敏性眼病的小鼠模型可用于临床前环境，以研究这些药物的药代动力学和药效学特性。这种疾病模型能够制定适当的策略来解决MGD，并有助于确定针对致病途径中重要成分的局部或全身抗炎剂的正确给药。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了德国研究基金会（DFG）2886 PANDORA项目-No.B3的部分支持;SCHA 2040/1-1;MU 4240/2-1;CRC1181（C03）;TRR241（B04），H2020-FETOPEN-2018-2020项目861878，并由大众基金会（授予97744）授予MH。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
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