Okulær overfladebetændelse skader det okulære overfladevæv og kompromitterer vitale funktioner i øjet. Den nuværende protokol beskriver en metode til at inducere okulær betændelse og indsamle kompromitterede væv i en musemodel af Meibomian kirtel dysfunktion (MGD).
Okulære overfladesygdomme omfatter en række lidelser, der forstyrrer hornhindens, bindehindens funktioner og strukturer og det tilhørende okulære overfladekirtelnetværk. Meibomiakirtler (MG) udskiller lipider, der skaber et dæklag, der forhindrer fordampning af den vandige del af tårefilmen. Neutrofiler og ekstracellulære DNA-fælder befolker MG og den okulære overflade i en musemodel af allergisk øjensygdom. Aggregerede neutrofile ekstracellulære fælder (aggNET’er) formulerer en mesh-lignende matrix sammensat af ekstracellulært kromatin, der okkluderer MG-udløb og betingelser MG-dysfunktion. Her præsenteres en metode til inducering af okulær overfladebetændelse og MG-dysfunktion. Procedurerne for indsamling af organer relateret til den okulære overflade, såsom hornhinden, bindehinden og øjenlågene, er beskrevet detaljeret. Ved hjælp af etablerede teknikker til behandling af hvert organ vises også de vigtigste morfologiske og histopatologiske træk ved MG-dysfunktion. Okulære ekssudater giver mulighed for at vurdere den okulære overflades inflammatoriske tilstand. Disse procedurer muliggør undersøgelse af topiske og systemiske antiinflammatoriske interventioner på præklinisk niveau.
Hvert blink med øjet genopfylder den glatte tårefilm spredt over hornhinden. Den okulære overfladeepitel letter fordelingen og korrekt orientering af tårefilmen på den okulære overflade. Muciner leveres af hornhinden og bindehindeepitelcellerne for at hjælpe med at placere den vandige del af tårefilmen, der kommer fra lacrimalkirtlerne på øjnenes overflade. Endelig udskiller MG lipider, der skaber et dækkende lag, der forhindrer fordampning af den vandige del af tårefilmen 1,2,3. På denne måde beskytter de koordinerede funktioner i alle de okulære organer den okulære overflade mod invaderende patogener eller skader og understøtter krystalklart syn uden smerte eller ubehag.
I en sund okulær overflade fejer den okulære flydende udledning eller øjenreum støv, døde epitelceller, bakterier, slim og immunceller væk. Aggregerede neutrofile ekstracellulære fælder (aggNET’er) formulerer en mesh-lignende matrix sammensat af ekstracellulært kromatin og inkorporerer disse komponenter i øjenreumet. AggNET’er løser inflammation ved proteolytisk nedbrydning af proinflammatoriske cytokiner og kemokiner4. Men når de bliver dysfunktionelle, driver disse afvigende aggNET’er patogenesen af sygdomme som vaskulære okklusioner i COVID-195, galdesten6 og sialolithiasis7. På samme måde spiller aggNET’er på den okulære overflade en beskyttende rolle og bidrager til at løse betændelse i den meget udsatte overflade8. Enten en overdrevet dannelse eller mangel på aggNET’er i den okulære overflade kan forringe tårefilmens stabilitet og / eller forårsage hornhindesår, cicatriserende konjunktivitis og tørre øjensygdomme. For eksempel er obstruktionen af MG en førende årsag til tørre øjnesygdom 9. AggNETs er også kendt for at tilslutte strømmen af lipidsekretion fra kanalerne i MG og forårsage Meibomian kirtel dysfunktion (MGD). Overbelastningen af MG-åbninger af aggNET’er forårsager mangel på fedtvæske, der omslutter den okulære overflade og retrograd flaskevæske, hvilket resulterer i dysfunktion af kirtelfunktionen og acinarskader. Denne dysfunktion kan resultere i fordampning af tårefilm, fibrose i margenerne på øjenlågene, øjenbetændelse og skadelig skade på MG10,11.
Flere dyremodeller er blevet udviklet gennem årene for at efterligne den patologiske proces af MGD hos mennesker. For eksempel har C57BL/6-mus i alderen 1 år hjulpet med at studere aldersrelaterede virkninger på tørre øjnes sygdom (DED) og MGD, hvilket afspejler okulær sygdomspatologi hos patienter i alderen 50 år og ældre12,13,14. Desuden er kaniner passende modeller til at undersøge virkningerne af farmakologiske interventioner. Derfor er inducerende MGD hos kaniner blevet rapporteret ved enten topisk administration af epinephrin eller systemisk introduktion af 13-cis-retinsyre (isotretinoin)15,16,17,18,19.
Selvom disse dyremodeller var tilstrækkelige til at bestemme de forskellige faktorer, der bidrager til MGD’s patofysiologi, blev de begrænset i deres anvendelse. For eksempel var murinemodellen af aldersrelateret MGD ideel til dechifrering af elementer hos ældre voksne, og derfor syntes kaniner at være den mest egnede dyremodel til at studere okulære overfladesygdomme, da de muliggør undersøgelse af flere patofysiologiske mekanismer. På grund af manglen på omfattende analytiske værktøjer til at detektere proteiner ved den okulære overflade, og fordi mange dele af kaningenomet ikke er kommenteret, er de imidlertid begrænset til undersøgelser20,21.
Desuden gav disse dyremodeller, der blev brugt til at undersøge patogenesen af tørre øjne, ikke tilstrækkelige detaljer til at analysere den immunologiske arm af lidelsen, der tilskynder til betændelse i den okulære overflade. Følgelig viste murinemodellen af MGD udviklet af Reyes et al. en sammenhæng mellem allergisk øjensygdom hos mus og MGD hos mennesker og fremhævede immunetiologien, der er ansvarlig for obstruktiv MGD21. Denne model forbinder allergisk øjensygdom med et TH17-respons, der rekrutterer neutrofiler til bindehinden og øjenlåget, hvilket forårsager MGD og kronisk okulær betændelse21. Induktionen af MGD og okulær inflammation i denne murinemodel er et værdifuldt værktøj til at undersøge opstrøms begivenheder under udviklingen af lokal inflammation drevet af et løbende immunrespons21. Den nuværende protokol beskriver den okulære overfladebetændelse ledsaget af obstruktiv MGD. I denne metode immuniseres mus og udfordres efter 2 uger på den okulære overflade med immunogenet i 7 dage. Desuden beskrives trinene til isolering af okulært ekssudat og de tilhørende okulære organer under akut betændelse og dissektion af hornhinden, bindehinden og øjenlågene.
Den olieagtige sekretion af de meibomiske kirtler er af stor betydning for et sundt øje22. Imidlertid kan obstruktionen af disse talgkirtler ved aggregerede neutrofile ekstracellulære fælder (aggNET’er), der stiller op som parallelle tråde placeret på tarsalpladerne på begge øjenlåg, forstyrre tårefilmen23. Denne forstyrrelse resulterer i Meibomian kirtel dysfunktion (MGD)1 og accelereret tårefordampning og betingelser skaden på den okulæ…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af den tyske forskningsfond (DFG) 2886 PANDORA-projekt-nr. B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Projekt 861878 og af Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) til MH.
1x PBS | Gibco | ||
Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
Stereomicroscope | Zaiss | Stemi508 | |
Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm | |
Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |