Summary
Okulær overfladebetændelse skader det okulære overfladevæv og kompromitterer vitale funktioner i øjet. Den nuværende protokol beskriver en metode til at inducere okulær betændelse og indsamle kompromitterede væv i en musemodel af Meibomian kirtel dysfunktion (MGD).
Abstract
Okulære overfladesygdomme omfatter en række lidelser, der forstyrrer hornhindens, bindehindens funktioner og strukturer og det tilhørende okulære overfladekirtelnetværk. Meibomiakirtler (MG) udskiller lipider, der skaber et dæklag, der forhindrer fordampning af den vandige del af tårefilmen. Neutrofiler og ekstracellulære DNA-fælder befolker MG og den okulære overflade i en musemodel af allergisk øjensygdom. Aggregerede neutrofile ekstracellulære fælder (aggNET'er) formulerer en mesh-lignende matrix sammensat af ekstracellulært kromatin, der okkluderer MG-udløb og betingelser MG-dysfunktion. Her præsenteres en metode til inducering af okulær overfladebetændelse og MG-dysfunktion. Procedurerne for indsamling af organer relateret til den okulære overflade, såsom hornhinden, bindehinden og øjenlågene, er beskrevet detaljeret. Ved hjælp af etablerede teknikker til behandling af hvert organ vises også de vigtigste morfologiske og histopatologiske træk ved MG-dysfunktion. Okulære ekssudater giver mulighed for at vurdere den okulære overflades inflammatoriske tilstand. Disse procedurer muliggør undersøgelse af topiske og systemiske antiinflammatoriske interventioner på præklinisk niveau.
Introduction
Hvert blink med øjet genopfylder den glatte tårefilm spredt over hornhinden. Den okulære overfladeepitel letter fordelingen og korrekt orientering af tårefilmen på den okulære overflade. Muciner leveres af hornhinden og bindehindeepitelcellerne for at hjælpe med at placere den vandige del af tårefilmen, der kommer fra lacrimalkirtlerne på øjnenes overflade. Endelig udskiller MG lipider, der skaber et dækkende lag, der forhindrer fordampning af den vandige del af tårefilmen 1,2,3. På denne måde beskytter de koordinerede funktioner i alle de okulære organer den okulære overflade mod invaderende patogener eller skader og understøtter krystalklart syn uden smerte eller ubehag.
I en sund okulær overflade fejer den okulære flydende udledning eller øjenreum støv, døde epitelceller, bakterier, slim og immunceller væk. Aggregerede neutrofile ekstracellulære fælder (aggNET'er) formulerer en mesh-lignende matrix sammensat af ekstracellulært kromatin og inkorporerer disse komponenter i øjenreumet. AggNET'er løser inflammation ved proteolytisk nedbrydning af proinflammatoriske cytokiner og kemokiner4. Men når de bliver dysfunktionelle, driver disse afvigende aggNET'er patogenesen af sygdomme som vaskulære okklusioner i COVID-195, galdesten6 og sialolithiasis7. På samme måde spiller aggNET'er på den okulære overflade en beskyttende rolle og bidrager til at løse betændelse i den meget udsatte overflade8. Enten en overdrevet dannelse eller mangel på aggNET'er i den okulære overflade kan forringe tårefilmens stabilitet og / eller forårsage hornhindesår, cicatriserende konjunktivitis og tørre øjensygdomme. For eksempel er obstruktionen af MG en førende årsag til tørre øjnesygdom 9. AggNETs er også kendt for at tilslutte strømmen af lipidsekretion fra kanalerne i MG og forårsage Meibomian kirtel dysfunktion (MGD). Overbelastningen af MG-åbninger af aggNET'er forårsager mangel på fedtvæske, der omslutter den okulære overflade og retrograd flaskevæske, hvilket resulterer i dysfunktion af kirtelfunktionen og acinarskader. Denne dysfunktion kan resultere i fordampning af tårefilm, fibrose i margenerne på øjenlågene, øjenbetændelse og skadelig skade på MG10,11.
Flere dyremodeller er blevet udviklet gennem årene for at efterligne den patologiske proces af MGD hos mennesker. For eksempel har C57BL/6-mus i alderen 1 år hjulpet med at studere aldersrelaterede virkninger på tørre øjnes sygdom (DED) og MGD, hvilket afspejler okulær sygdomspatologi hos patienter i alderen 50 år og ældre12,13,14. Desuden er kaniner passende modeller til at undersøge virkningerne af farmakologiske interventioner. Derfor er inducerende MGD hos kaniner blevet rapporteret ved enten topisk administration af epinephrin eller systemisk introduktion af 13-cis-retinsyre (isotretinoin)15,16,17,18,19.
Selvom disse dyremodeller var tilstrækkelige til at bestemme de forskellige faktorer, der bidrager til MGD's patofysiologi, blev de begrænset i deres anvendelse. For eksempel var murinemodellen af aldersrelateret MGD ideel til dechifrering af elementer hos ældre voksne, og derfor syntes kaniner at være den mest egnede dyremodel til at studere okulære overfladesygdomme, da de muliggør undersøgelse af flere patofysiologiske mekanismer. På grund af manglen på omfattende analytiske værktøjer til at detektere proteiner ved den okulære overflade, og fordi mange dele af kaningenomet ikke er kommenteret, er de imidlertid begrænset til undersøgelser20,21.
Desuden gav disse dyremodeller, der blev brugt til at undersøge patogenesen af tørre øjne, ikke tilstrækkelige detaljer til at analysere den immunologiske arm af lidelsen, der tilskynder til betændelse i den okulære overflade. Følgelig viste murinemodellen af MGD udviklet af Reyes et al. en sammenhæng mellem allergisk øjensygdom hos mus og MGD hos mennesker og fremhævede immunetiologien, der er ansvarlig for obstruktiv MGD21. Denne model forbinder allergisk øjensygdom med et TH17-respons, der rekrutterer neutrofiler til bindehinden og øjenlåget, hvilket forårsager MGD og kronisk okulær betændelse21. Induktionen af MGD og okulær inflammation i denne murinemodel er et værdifuldt værktøj til at undersøge opstrøms begivenheder under udviklingen af lokal inflammation drevet af et løbende immunrespons21. Den nuværende protokol beskriver den okulære overfladebetændelse ledsaget af obstruktiv MGD. I denne metode immuniseres mus og udfordres efter 2 uger på den okulære overflade med immunogenet i 7 dage. Desuden beskrives trinene til isolering af okulært ekssudat og de tilhørende okulære organer under akut betændelse og dissektion af hornhinden, bindehinden og øjenlågene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverede dyr, blev udført i henhold til de institutionelle retningslinjer for dyrevelfærd og godkendt af dyrevelfærdskommissionen ved Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU) (tilladelsesnummer: 55.2.2-2532-2-1217). Hunmus med C57Bl/6 i alderen 7-9 uger blev anvendt til denne undersøgelse. Musene blev hentet fra kommercielle kilder (se Materialetabel) og holdt under specifikke patogenfrie forhold med 12 timers dag/nat-cyklusser.
1. Induktion af murine okulær overfladebetændelse
- Udfør immunogenpræparat til immunisering.
- Forbered immunogenet frisk på immuniseringsdagen, bland ovalbumin (OVA, 50 mg / ml) og kighostetoksin (100 μg / ml) i saltvand og adjuverende aluminiumhydroxid (40 mg / ml) (se materialetabel) i et forhold på 1: 1.
FORSIGTIG: Udfør åbning, rekonstitution og immunogenpræparat af kighostetoksin i et laminært sikkerhedsskab. Brug beskyttelses tøj og undgå enhver kontakt med huden. - Inkuber immunogen- og adjuvansblandingen ved stuetemperatur i 30 minutter og læg 100 μL i en 1 ml sprøjte.
- Udfør intraperitoneal injektion af immunogenopløsningen i en ikke-bedøvet mus.
- Hold musen blidt ved halen, mens du griber fat i burgitteret. Hold godt fast i huden på ryggen og nakkeområdet mellem tommelfingeren og pegefingeren, og fastgør halen og underbenene mellem ringen og lillefingeren mod håndfladen.
- Hold den faste mus med hovedet nedad.
- 100 μL af den fremstillede immunogenopløsning injiceres i højre eller venstre kvadrant i det nedre bughule.
- Forbered immunogenet frisk på immuniseringsdagen, bland ovalbumin (OVA, 50 mg / ml) og kighostetoksin (100 μg / ml) i saltvand og adjuverende aluminiumhydroxid (40 mg / ml) (se materialetabel) i et forhold på 1: 1.
- Udfør okulær overfladeudfordring 2 uger efter immunisering.
- Anæstetik musen med isofluran (2,5%).
- Påfør 5 μL OVA (50 mg/ml) eller saltvand (0,9 % NaCl) pr. øje på begge øjne, og vent, indtil dråben absorberes af øjet. Dette tager ~ 5 minutter.
- Gentag proceduren 1x dagligt i 7 dage.
BEMÆRK: Den aktuelle administration af medicin kan gøres på samme måde.
2. Indsamling af okulære ekssudater
- Gendan de okulære ekssudater, der dannes i udfordringsfasen, ved at påføre 50 μL sterilt saltvand på øjet umiddelbart efter udfordringen.
- For at opnå en enkeltcellesuspension behandles den opsamlede okulære udledning med rekombinant MNase (2 x 106 gel U/ml, se Materialetabel) indeholdende cofaktorcalcium (5 mM) ved 37 °C i 20 min.
- Centrifuge ved 400 x g i 7 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten isoleres, og cytokiner og kemokiner måles ved hjælp af multiplekset ELISA i henhold til producentens anvisninger (se Materialetabel).
BEMÆRK: Den opnåede supernatant kan anvendes til proteinanalyse og pellet til funktionelle assays såsom immunophenotyping, fagocytose, degranulation og genekspression.
3. Udskæring af okulært overfladevæv
- Disseker øjenlågene og øjenkloden ved at følge nedenstående trin.
- Afliv musen ved CO2 kvælning og cervikal dislokation.
- Placer musen på en jævn overflade.
- Desinficer kredsløbsområdet omkring øjet med en vatpind imprægneret med 70% ethanol.
- Lav et snit mellem øret og den retro-orbitale sinus og langs overfladen over pladebenet lodret, og forlæng snittet vandret under det nedre øjenlåg langs den maksillære knogle og over det øvre øjenlåg langs frontbenet. Dette danner et snit omkring øjet (figur 1).
- Hold forsigtigt det dissekerede væv rundt om øjet ved hjælp af buede tang og træk vævet og øjeæblet ud.
- Anbring de udskårne organer i steril PBS.
- Trim overskydende ansigtsmuskelvæv omkring de udskårne øvre øjenlåg ved hjælp af en skalpel og under stereomikroskopet.
- Saml bindehinden ved at følge nedenstående trin.
- Placer det øverste øjenlåg på en tør petriskål under stereomikroskopet.
- Brug en fin pincet og en skalpel til at skrælle det hvidlige slimlag meget forsigtigt ud af øjenlågets indre overflade.
- Derefter dissekeres hornhinden ved at følge nedenstående trin.
- Placer øjenkloden på en ny tør petriskål oven på tøris i 3 min.
- Tag petriskålen på bænkens overflade i en stabil position.
- Lav et lille snit ved hornhindens kant ved siden af limbus ved hjælp af en fin skarp saks.
- Forlæng snittet med skalpellen omkring øjenkloden, og adskil sclera fra hornhinden.
- Fjern rester af iris og linsen fra bagsiden af hornhinden ved generøst at skylle med saltopløsning.
4. Dokumentation af meibomisk kirtel (MG) obstruktion
- For at vurdere MG og dets åbninger skal du placere udskårne øjenlåg i opretstående stilling under stereomikroskopet (figur 2).
- Tag billeder med epi-belysning i hvidt lys i henhold til kameraets eksponeringstid og ISO-indstillinger.
BEMÆRK: Morfometrisk analyse af disse billeder giver pålidelig kvantificering af stikstørrelsen ved kirtlernes udløb. Kvantificeringen kan udføres ved at skitsere øjenpropperne med tryllestavsværktøjet og udføre kommandoen "Analyser partikler" i Image J-softwaren (se Materialetabel).
5. Transillumination af øjenlåg (Meibomian kirtelmorfologi)
- For at vurdere MG-området skal du placere de udskårne øjenlåg i vandret position og tænde baggrundsbelysningen på stereomikroskopet udstyret med et infrarødt kamera (figur 3).
- Tag billeder ved at justere eksponeringstiden i henhold til kameraets (se materialetabel) ISO.
BEMÆRK: Infrarød billeddannelse af disse transbelyste øjenlåg under stereomikroskopet kan hjælpe med at måle formen og størrelsen af hver acini. Morfometrisk analyse af disse billeder giver pålidelig kvantificering af størrelsen og antallet af MG. Kvantificeringen kan udføres ved at skitsere MG med stavværktøjet og udføre kommandoen "Analyser partikler" i Image J-softwaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nuværende protokol beskriver de sekventielle trin til etablering af en murinmodel af okulær overfladebetændelse. Protokollerne sigter mod at vise, hvordan man anvender terapi lokalt, får okulære ekssudater og punktafgiftsrelaterede tilbehørsorganer såsom sunde og betændte øjenlåg (figur 2), hornhinden og bindehinden. Der skal tages hensyn, når de øvre øjenlåg dissekeres til isolering af bindehinden, og den skal opbevares i 1x PBS under dissektion af hornhinden. Dette forhindrer tørring af bindehinden, som kan bruges til histologiske, farmakokinetiske og genekspressionsundersøgelser.
OVA og saltvand blev anvendt topisk i 7 på hinanden følgende dage efter ovennævnte protokol. Mus udfordret topisk med saltvand viste en sund okulær overflade med vidt åbne øjne og et regelmæssigt blinkende mønster. Imidlertid blev okulær betændelse indledt i immuniserede C57BL / 6J mus udfordret med OVA. Instillationen af OVA-opløsning på den okulære overflade forårsagede kløe og ikke smerte i de første 2 timer efter instillation. Ekssudat og øjenlågseksem blev kun observeret i løbet af de sidste 3 dage af udfordringsfasen. Ingen smerte var tydelig, at dømme dyrenes opførsel. Derfor blev der antaget et moderat stressniveau for musene over en kort periode. Den daglige OVA-udfordring udløste kliniske manifestationer som rigelig okulær udledning, kemose og smal åbning af øjnene. Derudover klæbede de øvre og nedre øjenlåg ofte til hinanden, hvilket forringede den væsentlige funktion af at blinke (figur 2). Strenge afbrydelseskriterier (supplerende fil) blev fulgt for denne model og blev godkendt af det lokale etiske råd for dyreforsøg. Den øjeblikkelige afbrydelse blev udført, hvis en mus nåede 15 point på et givet tidspunkt.
Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.
Efter eutanasi blev de okulære organer udskåret og blev observeret ved højere forstørrelse. De udskårne øjenlåg under et mikroskop viste store okklusioner, der tilsluttede åbningerne af MG og ødem, i skarp kontrast til de sunde øjenlåg, der viser små stik i kirtlen, der forer øjenlåget (figur 3).
Yderligere undersøgelse af kirtlens infrarøde transillumination afslører det racemiske udseende af MG's acini. Dette gør det muligt at kvantificere de synlige meibomiske kirtler (angivet med rødt). Øjenlågene fra saltvandsudfordrede mus viste den runde acini, der dannede MG. Til sammenligning medførte anvendelsen af OVA ødelæggelse og tab af nogle MG hos mus med allergisk øjensygdom (AED, figur 4). Den histologiske analyse af øjenlågene viste udvidet MG sammenlignet med naive mus administreret med kun saltvand i 7 dage (figur 5), hvilket tillod akkumulering af neutrofiler, der producerer aggNET'er, der endelig forhindrer kirtlens åbninger.
At adskille hornhinden fra øjets sclera kan være besværligt på grund af den glatte slimhindeoverflade af øjenkloden. Inkubering af øjeæblet på tøris i en petriskål i 3 minutter giver mulighed for at fastgøre øjet, lave et lille snit ved limbus og dissekere hornhinden (figur 6).
De trin, der blev optaget i protokolafsnittet, lettede indsamlingen af hornhinden og bindehinden. Derudover påførte den lokale administration af OVA alvorlig betændelse i bindehinden med et hyperæmisk udseende (figur 7).
Analysen af okulære ekssudater afslører molekylære mekanismer i udviklingen af MGD. Cytokin- og kemokinkvantificering som beskrevet viste forhøjede niveauer af den store kemokin, der letter neutrofil ekstravasation, fagocytose og degranulation (CXCL-1) i supernatanterne fra mus med AED8. Derudover var den primære mediator for det akutte faserespons og neutrofilproduktion, IL-6, også signifikant forhøjet hos mus med AED. På den anden side viste koncentrationen af IL-10, et antiinflammatorisk cytokin, ingen signifikante ændringer hos både naive og AED-mus (figur 8).
Figur 1: Udskæring af ansigtsvævet omkring orbitalområdet. Snitsporet er angivet med rødt. Dette giver mulighed for at udskille de okulære organer og undersøge indflydelsen og virkningerne af forskellige topisk administrerede terapier på tilbehør okulære organer såsom bindehinden og hornhinden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: OVA-administration forårsager kliniske manifestationer af MGD . (A) Mus administreret saltvand viser en sund okulær overflade med øjne vidt åbne. (B) OVA-applikation inducerer alvorlig okulær overfladebetændelse, den smalle åbning af øjnene og tegn på kemose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Duktale stik, der forhindrer de meibomiske kirtler (MG) placeret langs øjenlågene. (A) Repræsentativt makrofotografi af et sundt øjenlåg uden overdreven øjenudslip fra en mus, der kun administreres saltvand i 7 dage. (B) Øjenlåg, der viser store duktale okklusioner af MG og ødem efter udfordringsperioden. Skala bar = 300 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Transilluminaterende makrofotografi muliggør visualisering af MG's acini (røde linjer). (A) Forbedring af infrarøde niveauer visualiserer den sunde acini hos naive mus og afslører den tydelige lommeformede acini i de sunde øjenlåg. (B) Acini forekommer tyk i musenes berørte øjenlåg med OVA-påføring. Skala bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Histologisk analyse af øjenlågene viser udvidede kanaler af MG hos mus med gentagen OVA-fornærmelse i 7 dage . (A) Naive museøjenlåg viser fraværet af udvidede kanaler, der viser et sundt fungerende okulært organ (B) i modsætning til mus med OVA-udfordring. Skala bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Snit ved hornhinden ved siden af limbus og adskillelse af hornhinden fra sclera. Billede af øjeæblet, der viser snitpunktet (angivet med hvid pil). Skala bar = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Lokal administration af OVA . (A) Makrofotografier af murine okulære organer, der viser hornhinden. Skalastang: 600 μm. (B) Betændt bindehinde fra mus udfordret med OVA. Skala bar: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Måling af inflammatoriske markører i de indsamlede okulære ekssudater. Kvantitativ analyse af cytokiner og kemokiner i supernatanten af centrifugeret okulært ekssudat af naive mus (n = 7) og mus med MGD (n = 8). Data udtrykkes som median med et interval på 5%-95%. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af den tohalede Mann-Whitney U-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den olieagtige sekretion af de meibomiske kirtler er af stor betydning for et sundt øje22. Imidlertid kan obstruktionen af disse talgkirtler ved aggregerede neutrofile ekstracellulære fælder (aggNET'er), der stiller op som parallelle tråde placeret på tarsalpladerne på begge øjenlåg, forstyrre tårefilmen23. Denne forstyrrelse resulterer i Meibomian kirtel dysfunktion (MGD)1 og accelereret tårefordampning og betingelser skaden på den okulære overflade2. Denne protokol beskriver etablering af immunmedieret okulær overfladebetændelse, der fører til MG-obstruktion.
Undersøgelser fra musemodeller har bekræftet de underliggende immunmedierede mekanismer, der forårsager MG-obstruktion forbundet med okulær overfladebetændelse. Et robust TH17-respons, der rekrutterer neutrofiler i musemodellen af AED og en stigning i neutrofiler og andre myeloide celler i tårevæsken hos patienter med MGD, indikerer rollen som neutrofiler, der forhindrer MG21. Tilstedeværelsen af aggNET'er, der okkluderede MG-åbningerne, blev bekræftet med peptidylarginin deiminase 4 hos mus med AED. I denne model viste neutrofiler en formindsket kapacitet til at aggregere og dannede aggNET'er, der blokerede kanalerne og åbningerne i MG-kirtlerne10. Desuden viste tåreanalyse fra patienter med MGD en stigning i anafylatoxin C5a og kemokin IL-8, hvilket viste øget aktivitet i komplementsystemet og en høj tilstrømning af neutrofilinfiltration. Endelig understreger en stigning i niveauet af cytokiner forbundet med flere neutrofile funktioner, såsom IL-6, IL-18, MCP-1 / CCL-2 og MI / CXCL9, neutrofilernes primære position i patogenesen af MGD11.
Forekomsten af MGD er en væsentlig bidragyder til udviklingen af DED, og deter kompliceret at undersøge rollen som de mange elementer, der er involveret i patogenesen af okulære manifestationer. Derfor er udvælgelsen af dyr som modeller stærkt påvirket af det spørgsmål, der undersøges. For eksempel tjener kaniner som konventionelle modeller til farmaceutisk test af formuleringer; Katte-, svine- og hundemodeller er velegnede til at undersøge patologiske egenskaber svarende til menneskelige patienter, og mus er primært egnede til genetisk manipulation25.
Dyremodeller er værdifulde værktøjer til at undersøge sygdomspatogenese og undersøge den terapeutiske effekt af forskellige interventioner in vivo. For eksempel omfatter konventionelle behandlinger administration af øjendråbestillationer til behandling af kliniske okulære manifestationer; På grund af tårestrømmen og lacrimaldræningssystemet fjernes sådanne okulære indgreb imidlertid hurtigt fra den okulære overflade. Dette medfører kun midlertidig handling og kræver gentagne administrationer og høje doser. For at løse dette problem tjente kaninmodellen af tør øjensygdom (DED) som det ideelle medium til at undersøge termogeler og karboniserede nanogeler (CNG'er) som alternative topiske behandlinger. Termogeler opnået ved at konjugere forskellige grader af sulfatering af hyaluronsyre og en amintermineret poly (N-isopropylacrylacrylamid), når den indgives til øjet, omdannes til en gel. I kaninmodellen af DED blev denne gel tilbageholdt i længere tid, og en enkelt dråbe reparerede den beskadigede hornhindepitelia, stoppede apoptose og undertrykte okulær betændelse under en opfølgning på 7 dage, hvilket tyder på en afbrydelse i leukocytinfiltrationen på grund af inhiberingen af selektivinmedieret leukocytinteraktion26.
Desuden viste karboniserede nanogeler (CNG'er) som øjendråber i kaninmodellen af DED frie radikaler, der behandlede tåremangel og overdreven tårefordampning forårsaget af en forværret inflammatorisk respons og oxidativ stress. CNG'er blev opnået via pyrolyse af lysinhydrochlorid (Lys-CNG'er) og administreret, og en enkelt dosis mildnede DED-symptomerne inden for 4 dage. En lignende terapeutisk effekt kunne kun opnås med flere behandlinger af en 10 gange højere mængde cyclosporin A øjendråbestillationer. Disse nye biokompatible farmaceutiske interventioner udviste overlegne perspektiver som enkeltdosisinterventioner og mere udvidet okulær retention i prækliniske dyremodeller27.
Knockout af flere gener i musemodeller har afsløret rollen som flere proteiner involveret i patogenesen af MGD. For eksempel inducerer den dysregulerede genekspression af peroxisomproliferatoraktiveret receptor-gamma (PPAR γ)24 og ændringer i dens signalvej ændringer i cellecyklusindgang / proliferation, lipidsyntese og meibomisk kirtelatrofi under aldring13. Derudover indikerede fraværet af βENaC (β - epitelnatriumkanal) i en musemodel, at MG-dysfunktionsfænotypen, der var fremherskende hos kvinder, var forbundet med MG-atrofi og åbningsobstruktion som hos mennesker med pseudohypoaldosteronisme 1 (PHA)28. CD147's væsentlige rolle blev også belyst hos mus, og det menes at opretholde det rige lipidindhold i meibocytter29. Mus, der manglede enzymet superoxiddismutase 1, viste forhøjet oxidativ lipid- og DNA-skade, hvilket var forbundet med en stigning i MG-inflammation30. Endelig fører en enkelt mutation i ELOVL4, der koder for det enzym, der kræves for at syntetisere ekstremt langkædede fedtsyrerester, der danner meibumlipidomet, til funktionelle ændringer i den forreste okulære overflade31. Interessant nok blev MGD også induceret hos mus med en særlig diæt med ufuldstændig lipidsammensætning for at evaluere den terapeutiske virkning af azithromycin som en oftalmisk formulering32.
Mens de fleste af de undersøgelser, der anvender musemodeller, har identificeret flere gener involveret i MGD, mangler mange en underliggende immunologisk tilstand. AED-modellen giver en lang række mulige interventioner fra induktion af immunresponset, generering af IgE-antistoffer og effektorfasen ledsaget af flere patologiske ændringer, der ligner human fordampnings-MGD.
Ved undersøgelse af MGD ved hjælp af den nævnte protokol er det afgørende at tilføje immunogen (OVA og kighostetoksin) til alun i en 1: 1 andel. Man bør inkubere blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur for god adsorption af ovalbumin-pertussistoksinet til alunen. Disse interaktioner er afgørende for at udløse et tilstrækkeligt immunrespons. Derudover skal der under immunisering tages hensyn under injektion, da dette kan resultere i perforering af de underliggende organer i bughulen. Dette kan resultere i utilstrækkelig immunisering og systemisk betændelse i musen med dybe virkninger på immunresponset.
Okulære ekssudater er store weblignende ekstracellulære kromatinstrukturer, der burinfiltrerer immunceller. Derfor er MNase-behandling af opsamlede okulære ekssudater fra denne model afgørende for at opnå encellesuspensioner11. Derudover er disse ekssudater lette at opsamle ved den okulære overflade og er en kilde til levedygtige neutrofiler, der er transmigreret fra cirkulationen. Hovedbegrænsningen ved denne teknik er mængden af ekssudat, der skal opsamles fra de okulære overflader. Tilføjelse af 50 μL saltvand til hvert øje gør det muligt at genvinde op til 100 μL ekssudat fra en mus. Dette er næppe nok til 1-2 flowcytometri (FACS) farvninger og supernatanter til biokemiske undersøgelser.
Dissekering med en skalpel for senere at plukke øjet og omgivende væv kan ofte forårsage skade på den overfladiske temporale vene, ringere palpebrale vene eller okulær vinkelvene. Det tilrådes at skabe et snit i huden med mindre dybde omkring øjet, da blødningen kan forstyrre yderligere histologiske præparater. Under dissektion af et væv er opbevaring af andet væv i PBS afgørende, da tørring eller utilstrækkelig smøring kan resultere i tab af strukturelle træk.
Under dissektionen af hornhinden fra øjenkloden, hvis inkubationen af øjenkloden på tøris ikke muliggør en stabil kontrol, kan man forlænge tiden til op til 5 minutter, så snittet ved limbus og adskillelse af hornhinden er mulig.
Potentielle anvendelser
Okulær overfladebetændelse forbundet med MGD er en multifaktoriel sygdom. Udviklingen og progressionen af dysfunktion i disse lipidudskillende kirtler kan være forårsaget af oftalmiske, systemiske, hormonelle og genetiske faktorer, kemikalier, lægemidler, mekaniske skadelige stoffer og immunologiske reaktioner33. Flere undersøgelser har rapporteret neutrofiler, der forårsager okklusion af meibomiske kirtler og betændelse 11,21,34,35,36,37,38. Udviklingen af topiske og systemiske antiinflammatoriske interventioner, der forstyrrer disse immunologiske veje, kan tilbyde lindring til patienter, der lider af okulært ubehag på grund af MGD. Murine-modellen af allergisk øjensygdom kan anvendes i en præklinisk indstilling til at undersøge de farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaber af disse midler. Denne sygdomsmodel muliggør udvikling af passende strategier til at tackle MGD og hjælper med at bestemme korrekt administration af topiske eller systemiske antiinflammatoriske midler, der er målrettet mod vitale komponenter i sygdomsfremkaldende veje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af den tyske forskningsfond (DFG) 2886 PANDORA-projekt-nr. B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Projekt 861878 og af Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) til MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
- Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
- Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
- Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
- Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
- Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
- DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
- Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
- Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
- Nien, C. J., et al.
- Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
- Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
- Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
- Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
- Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
- Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
- Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
- Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
- Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
- Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters - New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
- Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
- Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
- Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
- Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
- Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
- McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
- Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
- Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
- Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
- Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
- von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
- Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).
