Summary

Induktion af øjenoverfladebetændelse og indsamling af involverede væv

Published: August 04, 2022
doi:

Summary

Okulær overfladebetændelse skader det okulære overfladevæv og kompromitterer vitale funktioner i øjet. Den nuværende protokol beskriver en metode til at inducere okulær betændelse og indsamle kompromitterede væv i en musemodel af Meibomian kirtel dysfunktion (MGD).

Abstract

Okulære overfladesygdomme omfatter en række lidelser, der forstyrrer hornhindens, bindehindens funktioner og strukturer og det tilhørende okulære overfladekirtelnetværk. Meibomiakirtler (MG) udskiller lipider, der skaber et dæklag, der forhindrer fordampning af den vandige del af tårefilmen. Neutrofiler og ekstracellulære DNA-fælder befolker MG og den okulære overflade i en musemodel af allergisk øjensygdom. Aggregerede neutrofile ekstracellulære fælder (aggNET’er) formulerer en mesh-lignende matrix sammensat af ekstracellulært kromatin, der okkluderer MG-udløb og betingelser MG-dysfunktion. Her præsenteres en metode til inducering af okulær overfladebetændelse og MG-dysfunktion. Procedurerne for indsamling af organer relateret til den okulære overflade, såsom hornhinden, bindehinden og øjenlågene, er beskrevet detaljeret. Ved hjælp af etablerede teknikker til behandling af hvert organ vises også de vigtigste morfologiske og histopatologiske træk ved MG-dysfunktion. Okulære ekssudater giver mulighed for at vurdere den okulære overflades inflammatoriske tilstand. Disse procedurer muliggør undersøgelse af topiske og systemiske antiinflammatoriske interventioner på præklinisk niveau.

Introduction

Hvert blink med øjet genopfylder den glatte tårefilm spredt over hornhinden. Den okulære overfladeepitel letter fordelingen og korrekt orientering af tårefilmen på den okulære overflade. Muciner leveres af hornhinden og bindehindeepitelcellerne for at hjælpe med at placere den vandige del af tårefilmen, der kommer fra lacrimalkirtlerne på øjnenes overflade. Endelig udskiller MG lipider, der skaber et dækkende lag, der forhindrer fordampning af den vandige del af tårefilmen 1,2,3. På denne måde beskytter de koordinerede funktioner i alle de okulære organer den okulære overflade mod invaderende patogener eller skader og understøtter krystalklart syn uden smerte eller ubehag.

I en sund okulær overflade fejer den okulære flydende udledning eller øjenreum støv, døde epitelceller, bakterier, slim og immunceller væk. Aggregerede neutrofile ekstracellulære fælder (aggNET’er) formulerer en mesh-lignende matrix sammensat af ekstracellulært kromatin og inkorporerer disse komponenter i øjenreumet. AggNET’er løser inflammation ved proteolytisk nedbrydning af proinflammatoriske cytokiner og kemokiner4. Men når de bliver dysfunktionelle, driver disse afvigende aggNET’er patogenesen af sygdomme som vaskulære okklusioner i COVID-195, galdesten6 og sialolithiasis7. På samme måde spiller aggNET’er på den okulære overflade en beskyttende rolle og bidrager til at løse betændelse i den meget udsatte overflade8. Enten en overdrevet dannelse eller mangel på aggNET’er i den okulære overflade kan forringe tårefilmens stabilitet og / eller forårsage hornhindesår, cicatriserende konjunktivitis og tørre øjensygdomme. For eksempel er obstruktionen af MG en førende årsag til tørre øjnesygdom 9. AggNETs er også kendt for at tilslutte strømmen af lipidsekretion fra kanalerne i MG og forårsage Meibomian kirtel dysfunktion (MGD). Overbelastningen af MG-åbninger af aggNET’er forårsager mangel på fedtvæske, der omslutter den okulære overflade og retrograd flaskevæske, hvilket resulterer i dysfunktion af kirtelfunktionen og acinarskader. Denne dysfunktion kan resultere i fordampning af tårefilm, fibrose i margenerne på øjenlågene, øjenbetændelse og skadelig skade på MG10,11.

Flere dyremodeller er blevet udviklet gennem årene for at efterligne den patologiske proces af MGD hos mennesker. For eksempel har C57BL/6-mus i alderen 1 år hjulpet med at studere aldersrelaterede virkninger på tørre øjnes sygdom (DED) og MGD, hvilket afspejler okulær sygdomspatologi hos patienter i alderen 50 år og ældre12,13,14. Desuden er kaniner passende modeller til at undersøge virkningerne af farmakologiske interventioner. Derfor er inducerende MGD hos kaniner blevet rapporteret ved enten topisk administration af epinephrin eller systemisk introduktion af 13-cis-retinsyre (isotretinoin)15,16,17,18,19.

Selvom disse dyremodeller var tilstrækkelige til at bestemme de forskellige faktorer, der bidrager til MGD’s patofysiologi, blev de begrænset i deres anvendelse. For eksempel var murinemodellen af aldersrelateret MGD ideel til dechifrering af elementer hos ældre voksne, og derfor syntes kaniner at være den mest egnede dyremodel til at studere okulære overfladesygdomme, da de muliggør undersøgelse af flere patofysiologiske mekanismer. På grund af manglen på omfattende analytiske værktøjer til at detektere proteiner ved den okulære overflade, og fordi mange dele af kaningenomet ikke er kommenteret, er de imidlertid begrænset til undersøgelser20,21.

Desuden gav disse dyremodeller, der blev brugt til at undersøge patogenesen af tørre øjne, ikke tilstrækkelige detaljer til at analysere den immunologiske arm af lidelsen, der tilskynder til betændelse i den okulære overflade. Følgelig viste murinemodellen af MGD udviklet af Reyes et al. en sammenhæng mellem allergisk øjensygdom hos mus og MGD hos mennesker og fremhævede immunetiologien, der er ansvarlig for obstruktiv MGD21. Denne model forbinder allergisk øjensygdom med et TH17-respons, der rekrutterer neutrofiler til bindehinden og øjenlåget, hvilket forårsager MGD og kronisk okulær betændelse21. Induktionen af MGD og okulær inflammation i denne murinemodel er et værdifuldt værktøj til at undersøge opstrøms begivenheder under udviklingen af lokal inflammation drevet af et løbende immunrespons21. Den nuværende protokol beskriver den okulære overfladebetændelse ledsaget af obstruktiv MGD. I denne metode immuniseres mus og udfordres efter 2 uger på den okulære overflade med immunogenet i 7 dage. Desuden beskrives trinene til isolering af okulært ekssudat og de tilhørende okulære organer under akut betændelse og dissektion af hornhinden, bindehinden og øjenlågene.

Protocol

Alle procedurer, der involverede dyr, blev udført i henhold til de institutionelle retningslinjer for dyrevelfærd og godkendt af dyrevelfærdskommissionen ved Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU) (tilladelsesnummer: 55.2.2-2532-2-1217). Hunmus med C57Bl/6 i alderen 7-9 uger blev anvendt til denne undersøgelse. Musene blev hentet fra kommercielle kilder (se Materialetabel) og holdt under specifikke patogenfrie forhold med 12 timers dag/nat-cyklusser. <strong…

Representative Results

Den nuværende protokol beskriver de sekventielle trin til etablering af en murinmodel af okulær overfladebetændelse. Protokollerne sigter mod at vise, hvordan man anvender terapi lokalt, får okulære ekssudater og punktafgiftsrelaterede tilbehørsorganer såsom sunde og betændte øjenlåg (figur 2), hornhinden og bindehinden. Der skal tages hensyn, når de øvre øjenlåg dissekeres til isolering af bindehinden, og den skal opbevares i 1x PBS under dissektion af hornhinden. Dette forhin…

Discussion

Den olieagtige sekretion af de meibomiske kirtler er af stor betydning for et sundt øje22. Imidlertid kan obstruktionen af disse talgkirtler ved aggregerede neutrofile ekstracellulære fælder (aggNET’er), der stiller op som parallelle tråde placeret på tarsalpladerne på begge øjenlåg, forstyrre tårefilmen23. Denne forstyrrelse resulterer i Meibomian kirtel dysfunktion (MGD)1 og accelereret tårefordampning og betingelser skaden på den okulæ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev delvist støttet af den tyske forskningsfond (DFG) 2886 PANDORA-projekt-nr. B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Projekt 861878 og af Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) til MH.

Materials

1x PBS Gibco
Aluminium Hydroxide Imject alum Adjuvant 77161 40 mg/ mL
Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks Charles River Laboratories 
Calcium Carl roth CN93.1 1 M
Final Concentration: 5 mM
Curved forceps FST by Dumont SWITZERLAND 5/45 11251-35
Fine sharp scissor FST Stainless steel, Germany 15001-08
Laminar safety cabinet Herasafe
Macrophotography Camera Canon EOS6D
Macrophotography Camera (without IR filter) Nikon D5300
Mnase New England biolabs M0247S 2 x 106 gel U/mL
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) Biolegend CLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9% (Saline) B.Braun
Ovalbumin (OVA) Endofit, Invivogen 9006-59-1 10 mg/200 µL in saline
Pertussis toxin  ThermoFisher Scientific  PHZ1174 50 µg/ 500 µL in saline
Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL
Petridish Greiner bio-one 628160
Scalpel Feather disposable scalpel No. 21  Final Concentration: in vivo:  300 ng/ 100 µL
Stereomicroscope Zaiss Stemi508
Syringe (corneal/iris washing) BD Microlane 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm
Syringe (i.p immunization) BD Microlane 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm

References

  1. Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
  2. Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
  3. Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
  4. Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
  5. Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
  6. Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
  7. Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
  8. Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
  9. DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
  10. Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
  11. Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
  12. Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
  13. Nien, C. J., et al. Age-related changes in the meibomian gland. Experimental Eye Research. 89 (6), 1021-1027 (2009).
  14. Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
  15. Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
  16. Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
  17. Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
  18. Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
  19. Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
  20. Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
  21. Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
  22. Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
  23. Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
  24. Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
  25. Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters – New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
  26. Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
  27. Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
  28. Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
  29. Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
  30. Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
  31. McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
  32. Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
  33. Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
  34. Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
  35. Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
  36. von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
  37. Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
  38. Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).

Play Video

Cite This Article
Singh, J., Shan, X., Mahajan, A., Herrmann, M., Schauer, C., Knopf, J., Muñoz, L. E. Induction of Ocular Surface Inflammation and Collection of Involved Tissues. J. Vis. Exp. (186), e63890, doi:10.3791/63890 (2022).

View Video