Summary
Okulær overflatebetennelse skader det okulære overflatevevet og kompromitterer vitale funksjoner i øyet. Den nåværende protokollen beskriver en metode for å indusere okulær betennelse og samle kompromittert vev i en musemodell av Meibomian kjertel dysfunksjon (MGD).
Abstract
Okulære overflatesykdommer inkluderer en rekke lidelser som forstyrrer funksjonene og strukturene i hornhinnen, bindehinden og det tilhørende okulære overflatekjertelnettverket. Meibomske kjertler (MG) utskiller lipider som skaper et dekklag som forhindrer fordampning av den vandige delen av tårefilmen. Neutrofiler og ekstracellulære DNA-feller befolker MG og den okulære overflaten i en musemodell av allergisk øyesykdom. Aggregerte nøytrofile ekstracellulære feller (aggNETs) formulerer en maskelignende matrise sammensatt av ekstracellulær kromatin som okkluderer MG-uttak og betingelser MG dysfunksjon. Her presenteres en metode for å indusere okulær overflatebetennelse og MG-dysfunksjon. Prosedyrene for å samle organer relatert til okulær overflate, som hornhinnen, bindehinden og øyelokkene, er beskrevet i detalj. Ved hjelp av etablerte teknikker for behandling av hvert organ, vises også de viktigste morfologiske og histopatologiske egenskapene til MG-dysfunksjon. Okulære ekssudater gir mulighet til å vurdere den inflammatoriske tilstanden til den okulære overflaten. Disse prosedyrene muliggjør undersøkelse av aktuelle og systemiske antiinflammatoriske inngrep på preklinisk nivå.
Introduction
Hvert øyeblikk fyller på den glatte tårefilmen spredt over hornhinnen. Det okulære overflateepitelet letter fordelingen og korrekt orientering av tårfilmen på okulæroverflaten. Muciner er tilveiebrakt av hornhinnen og konjunktivepitelceller for å hjelpe til med å plassere den vandige delen av tårefilmen som kommer fra lacrimalkjertlene på øynenees overflate. Til slutt utskiller MG lipider som skaper et dekklag som forhindrer fordampning av den vandige delen av tårefilmen 1,2,3. På denne måten beskytter de koordinerte funksjonene til alle okulære organer den okulære overflaten mot invaderende patogener eller skader og støtter krystallklart syn uten smerte eller ubehag.
I en sunn okulær overflate feier den okulære flytende utslipp eller øye rheum bort støv, døde epitelceller, bakterier, slim og immunceller. Aggregerte nøytrofile ekstracellulære feller (aggNETs) formulerer en maskelignende matrise sammensatt av ekstracellulær kromatin og inkorporerer disse komponentene i øyets rheum. AggNETs løser betennelse ved proteolytisk nedbrytning av proinflammatoriske cytokiner og kjemokiner4. Men når de blir dysfunksjonelle, driver disse avvikende aggNETene patogenesen av sykdommer som vaskulære okklusjoner i COVID-195, gallestein6 og sialolithiasis7. På samme måte spiller aggNETs på den okulære overflaten en beskyttende rolle og bidrar til å løse betennelse i den svært eksponerte overflaten8. Enten en overdrevet formasjon eller mangel på aggNETs i okulær overflate kan svekke tårefilmens stabilitet og / eller forårsake hornhinnenesår, cicatrizing konjunktivitt og tørr øyesykdom. For eksempel er obstruksjon av MG en ledende årsak til tørr øyesykdom9. AggNETs er også kjent for å plugge strømmen av lipidsekresjon fra kanalene til MG og forårsake Meibomian kjertel dysfunksjon (MGD). Overbelastning av MG-åpninger av aggNETs forårsaker mangel på fettvæske som omslutter okulær overflate og retrograd flaskevæske, noe som resulterer i dysfunksjon av kjertelfunksjonen og acinarskader. Denne dysfunksjonen kan resultere i tårefilmfordampning, fibrose i kantene på øyelokkene, øyebetennelse og skadelig skade på MG10,11.
Flere dyremodeller har blitt utviklet gjennom årene for å etterligne den patologiske prosessen med MGD hos mennesker. For eksempel har C57BL / 6 mus i alderen 1 år bidratt til å studere aldersrelaterte effekter på tørr øyesykdom (DED) og MGD, noe som gjenspeiler den okulære sykdomspatologien hos pasienter i alderen 50 år og eldre12,13,14. Videre er kaniner egnede modeller for å undersøke effekten av farmakologiske tiltak. Induserende MGD hos kaniner er derfor rapportert enten ved topikal administrering av adrenalin eller systemisk innføring av 13-cis-retinsyre (isotretinoin)15,16,17,18,19.
Selv om disse dyremodellene var tilstrekkelige for å bestemme de ulike faktorene som bidrar til patofysiologien til MGD, var de begrenset i bruken. For eksempel var murine-modellen for aldersrelatert MGD ideell for å dechiffrere elementer bare hos eldre voksne, og derfor syntes kaniner å være den mest egnede dyremodellen for å studere okulære overflatesykdommer, da de muliggjør undersøkelse av flere patofysiologiske mekanismer. På grunn av mangel på omfattende analyseverktøy for å oppdage proteiner på okulær overflate og fordi mange deler av kaningenomet ikke er kommentert, er de imidlertid begrenset for undersøkelser20,21.
I tillegg ga disse dyremodellene som ble brukt til å undersøke patogenesen av tørr øyesykdom ikke tilstrekkelige detaljer for å analysere den immunologiske armen av lidelsen som fremkaller betennelsen i den okulære overflaten. Følgelig viste murine modellen av MGD utviklet av Reyes et al. en sammenheng mellom allergisk øyesykdom hos mus og MGD hos mennesker og fremhevet immunetiologien som er ansvarlig for obstruktiv MGD21. Denne modellen forbinder allergisk øyesykdom med en TH17-respons som rekrutterer nøytrofiler til bindehinden og øyelokket, noe som forårsaker MGD og kronisk okulær betennelse21. Induksjonen av MGD og okulær betennelse i denne murine modellen er et verdifullt verktøy for å undersøke oppstrøms hendelser under utvikling av lokal betennelse drevet av en pågående immunrespons21. Den nåværende protokollen beskriver okulær overflatebetennelse ledsaget av obstruktiv MGD. I denne metoden immuniseres mus og etter 2 uker utfordres på okulær overflate med immunogen i 7 dager. Videre beskrives trinnene for å isolere okulært ekssudat og tilhørende okulære organer under akutt betennelse og disseksjon av hornhinnen, bindehinnen og øyelokkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i henhold til de institusjonelle retningslinjene for dyrevelferd og godkjent av dyrevelferdskommisjonen ved Friedrich-Alexander-Universitetet i Erlangen-Nürnberg (FAU) (tillatelsesnummer: 55.2.2-2532-2-1217). Kvinnelige C57Bl/6-mus i alderen 7-9 uker ble brukt i denne studien. Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell) og holdt i spesifikke patogenfrie forhold med 12 timers dag / natt sykluser.
1. Induksjon av murine okulær overflatebetennelse
- Utfør immunogen forberedelse for immunisering.
- Tilbered immunogen friskt på immuniseringsdagen, bland ovalbumin (OVA, 50 mg / ml) og kikhostetoksin (100 μg / ml) i saltvann og adjuvant aluminiumhydroksyd (40 mg / ml) (se materialtabell) i en 1: 1-andel.
FORSIKTIG: Utfør åpning, rekonstituering og immunogen tilberedning av kikhostetoksin i et laminært sikkerhetsskap. Bruk verneutstyr og unngå kontakt med huden. - Inkuber immunogen og adjuvant blanding ved romtemperatur i 30 minutter og legg 100 μL i en 1 ml sprøyte.
- Utfør intraperitoneal injeksjon av immunogenoppløsningen i en ikke-bedøvet mus.
- Hold musen mykt ved halen mens du tar tak i burgitteret. Hold fast huden på ryggen og nakkeområdet mellom tommelen og pekefingeren og fest halen og underekstremitetene mellom ringen og lillefingeren mot håndflaten.
- Hold den faste musen med hodet nedover.
- Injiser 100 μL av den tilberedte immunogenoppløsningen i høyre eller venstre kvadrant i underbukhulen.
- Tilbered immunogen friskt på immuniseringsdagen, bland ovalbumin (OVA, 50 mg / ml) og kikhostetoksin (100 μg / ml) i saltvann og adjuvant aluminiumhydroksyd (40 mg / ml) (se materialtabell) i en 1: 1-andel.
- Utfør okulær overflateutfordring 2 uker etter immunisering.
- Bedøv musen med isofluran (2,5%).
- Påfør 5 μL OVA (50 mg/ml) eller saltvann (0,9 % NaCl) per øye på begge øynene, og vent til dråpen blir absorbert av øyet. Dette tar ~ 5 min.
- Gjenta prosedyren 1x daglig i 7 dager.
MERK: Den aktuelle administrasjonen av medisiner kan gjøres på samme måte.
2. Samling av okulære ekssudater
- Gjenopprett okulære ekssudater dannet under utfordringsfasen ved å påføre 50 μL steril saltvann til øyet umiddelbart etter utfordringen.
- For å oppnå en enkeltcellet suspensjon, behandle den oppsamlede okulære utladningen med rekombinant MNase (2 x 106 gel U / ml, se materialtabell) som inneholder kofaktorkalsium (5 mM) ved 37 ° C i 20 minutter.
- Sentrifuge ved 400 x g i 7 minutter ved romtemperatur.
- Isoler supernatanten og mål cytokinene og kjemokinene ved hjelp av multiplekset ELISA i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell).
MERK: Den oppnådde supernatanten kan brukes til proteinanalyse og pelleten for funksjonelle analyser som immunfenotyping, fagocytose, degranulering og genuttrykk.
3. Eksisjon av okulært overflatevev
- Disseker øyelokkene og øyekulen ved å følge trinnene nedenfor.
- Avlive musen ved CO2 kvelning og cervikal dislokasjon.
- Plasser musen på en jevn overflate.
- Desinfiser orbitalområdet rundt øyet med en vattpinne impregnert med 70% etanol.
- Gjør et snitt mellom øret og retro-orbital sinus og langs overflaten over plateepitelbenet vertikalt, og forleng snittet horisontalt under det nedre øyelokket langs det maksillære beinet og over øvre øyelokk langs frontbenet. Dette danner et snitt rundt øyet (figur 1).
- Hold forsiktig det dissekerte vevet rundt øyet ved hjelp av buede tang og trekk vevet og øyebollet ut.
- Plasser de utskårne organene i steril PBS.
- Trim overflødig ansiktsmuskelvev rundt de utskårne øvre øyelokkene ved hjelp av en skalpell og under stereomikroskopet.
- Samle konjunktivene ved å følge trinnene nedenfor.
- Plasser øvre øyelokk på en tørr petriskål under stereomikroskopet.
- Bruk fin pinsett og en skalpell, skrell det hvite slimlaget veldig forsiktig ut av øyelokkets indre overflate.
- Deretter dissekerer hornhinnen ved å følge trinnene nedenfor.
- Plasser øyekulen på en ny tørr petriskål oppå tørris i 3 min.
- Ta petriskålen på benken i stabil stilling.
- Lag et lite snitt på grensen til hornhinnen ved siden av limbus ved hjelp av fin skarp saks.
- Forleng snittet med skalpellen rundt øyekloden, og skille sclera fra hornhinnen.
- Fjern rester av iris og linsen fra baksiden av hornhinnen ved sjenerøst å skylle med saltoppløsning.
4. Dokumentasjon av Meibomian kjertel (MG) obstruksjon
- For å vurdere MG og dens åpninger, plasser utskårne øyelokk i oppreist stilling under stereomikroskopet (figur 2).
- Ta bilder med hvitt lys epi-belysning i henhold til kameraets eksponeringstid og ISO-innstillinger.
MERK: Morfometrisk analyse av disse bildene gir pålitelig kvantifisering av pluggstørrelsen ved utløpet av kjertlene. Kvantifiseringen kan utføres ved å skissere øyepluggene med tryllestavverktøyet og utføre kommandoen "Analyser partikler" i Image J-programvaren (se Materialtabell).
5. Transilluminering av øyelokk (Meibomian kjertelmorfologi)
- For å vurdere MG-området, plasser de utskårne øyelokkene i horisontal stilling og slå på bakgrunnsbelysningen til stereomikroskopet utstyrt med et infrarødt kamera (figur 3).
- Ta bilder ved å justere eksponeringstiden i henhold til kameraets (se materialtabell) ISO.
MERK: Infrarød avbildning av disse transilluminerte øyelokkene under stereomikroskopet kan bidra til å måle formen og størrelsen på hver acini. Morfometrisk analyse av disse bildene gir pålitelig kvantifisering av størrelse og antall MG. Kvantifiseringen kan utføres ved å skissere MG med tryllestavverktøyet og utføre kommandoen "Analyser partikler" i Image J-programvaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver de sekvensielle trinnene for å etablere en murine modell av okulær overflatebetennelse. Protokollene tar sikte på å vise hvordan man bruker terapi lokalt, oppnår okulære ekssudater og avgiftsassosierte tilbehørsorganer som sunne og betente øyelokk (figur 2), hornhinnen og bindehinden. Oppmerksomhet må betales når de øvre øyelokkene blir dissekert for isolering av bindehinden, og den må lagres i 1x PBS under disseksjonen av hornhinnen. Dette vil forhindre tørking av bindehinden, som kan brukes til histologiske, farmakokinetiske og genuttrykksstudier.
OVA og saltvann ble påført topisk i 7 påfølgende dager etter ovennevnte protokoll. Mus som ble utfordret lokalt med saltvann viste en sunn okulær overflate med vidåpne øyne og et vanlig blinkende mønster. Okulær betennelse ble imidlertid initiert hos immuniserte C57BL/6J-mus som ble utfordret med OVA. Instillasjonen av OVA-oppløsning på okulær overflate forårsaket kløe, og ikke smerte, de første 2 timene etter innånding. Ekssudat og øyelokkeksem ble kun observert i løpet av de siste 3 dagene av smittefasen. Ingen smerte var tydelig, dømme oppførselen til dyrene. Det ble derfor antatt et moderat stressnivå for musene over en kort periode. Den daglige OVA-utfordringen utløste kliniske manifestasjoner som rikelig okulær utflod, kjemose og smal åpning av øynene. I tillegg festet øvre og nedre øyelokk seg ofte til hverandre, noe som svekket den essensielle funksjonen ved å blinke (figur 2). Strenge avbruddskriterier (Supplementary File) ble fulgt for denne modellen og ble godkjent av det lokale etiske styret for dyreforsøk. Den umiddelbare avbrudd ble utført hvis en mus nådde 15 poeng til enhver tid.
Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Etter eutanasi ble okulære organer skåret ut og observert ved høyere forstørrelse. De utskårne øyelokkene under et mikroskop viste store okklusjoner som plugget åpningene til MG og ødem, i sterk kontrast til de friske øyelokkene som viste små plugger i kjertelen som fôrer øyelokket (figur 3).
Videre undersøkelse av kjertelens infrarøde transilluminasjon avslører det racemiske utseendet til acini av MG. Dette gjør det mulig å kvantifisere de synlige Meibomske kjertlene (angitt i rødt). Øyelokkene fra saltvannsutfordrede mus viste den runde acinien som dannet MG. Til sammenligning induserte anvendelsen av OVA ødeleggelse og tap av noe MG hos mus med allergisk øyesykdom (AED, figur 4). Den histologiske analysen av øyelokkene viste dilatert MG sammenlignet med naive mus administrert med bare saltvann i 7 dager (figur 5), noe som tillot akkumulering av nøytrofiler som produserer aggNET som til slutt hindrer kjertelens åpninger.
Å skille hornhinnen fra øyets sclera kan være tungvint på grunn av den glatte slimete overflaten av øyekloden. Inkubering av øyeeplet på tørris i en petriskål i 3 minutter gjør det mulig å feste øyet, lage et lite snitt ved limbus og dissekere hornhinnen (figur 6).
Trinnene som ble vervet i protokolldelen, lettet samlingen av hornhinnen og bindehinden. I tillegg påførte lokal administrasjon av OVA konjunktivene alvorlig inflammasjon, med hyperemisk utseende (figur 7).
Analysen av okulære ekssudater avslører molekylære mekanismer i utviklingen av MGD. Cytokin- og kjemokinkvantifisering som beskrevet viste forhøyede nivåer av de viktigste kjemokinene som letter nøytrofil ekstravasasjon, fagocytose og degranulering (CXCL-1) i supernatantene fra mus med AED8. I tillegg var hovedmediatoren for akuttfaseresponsen og nøytrofilproduksjonen, IL-6, også signifikant forhøyet hos mus med AED. På den annen side viste konsentrasjonen av IL-10, et antiinflammatorisk cytokin, ingen signifikante endringer hos både naive og AED-mus (figur 8).
Figur 1: Eksisjon av ansiktsvevet rundt orbitalområdet. Snittsporet er angitt med rødt. Dette gjør det mulig å fjerne okulære organer og undersøke påvirkning og effekter av ulike topisk administrerte terapier på tilbehørs okulære organer som bindehinden og hornhinnen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: OVA-administrasjon forårsaker kliniske manifestasjoner av MGD . (A) Mus administrert saltvann viser en sunn okulær overflate med øynene åpne. (B) OVA-påføring induserer alvorlig okulær overflatebetennelse, smal åpning av øynene og tegn på kjemose. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Duktale plugger som hindrer Meibomian kjertler (MG) plassert langs øyelokkene. (A) Representativt makrofotografi av et sunt øyelokk uten overdreven okulær utslipp fra en mus administrert saltvann i 7 dager. (B) Øyelokk som viser store duktale okklusjoner av MG og ødem etter smitteperioden. Skala bar = 300 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Transilluminating makrofotografering muliggjør visualisering av MGs acini (røde linjer). (A) Forbedring av infrarøde nivåer visualiserer den sunne acini av naive mus og avslører den distinkte lommeformede acini i de sunne øyelokkene. (B) Acini vises tykk i musens berørte øyelokk med OVA-applikasjon. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Histologisk analyse av øyelokkene viser dilaterte kanaler av MG hos mus med gjentatt OVA-fornærmelse i 7 dager . (A) Naive museøyelokk viser fravær av utvidede kanaler, som viser et sunt fungerende okulært organ (B) i motsetning til mus med OVA-utfordring. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Snitt ved hornhinnen ved siden av limbus og separasjon av hornhinnen fra sclera. Bilde av øyeeplet som viser snittpunktet (indikert med hvit pil). Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Lokal administrasjon av OVA . (A) Makrofotografier av murine okulære organer som viser hornhinnen. Skala bar: 600 μm. (B) Inflammet konjunktiv fra mus utfordret med OVA. Skala bar: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Måling av betennelsesmarkører i de innsamlede okulære ekssudatene. Kvantitativ analyse av cytokiner og kjemokiner i supernatant av sentrifugert okulært ekssudat av naive mus (n = 7) og mus med MGD (n = 8). Data uttrykkes som median med et område på 5%-95%. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av den tosidige Mann-Whitney U-testen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den oljeaktige sekresjonen av Meibomian kjertlene er av stor betydning for et sunt øye22. Imidlertid kan obstruksjonen av disse talgkjertlene av aggregerte nøytrofile ekstracellulære feller (aggNETs) som stiller opp som parallelle tråder plassert på tarsalplatene i begge øyelokkene, forstyrre tårefilmen23. Denne forstyrrelsen resulterer i meibomisk kjerteldysfunksjon (MGD)1 og akselerert tårefordampning og betinger skaden på den okulære overflaten2. Denne protokollen beskriver etablering av immunmediert okulær overflatebetennelse som fører til MG-obstruksjon.
Studier fra musemodeller har bekreftet de underliggende immunmedierte mekanismene som forårsaker MG-obstruksjon assosiert med okulær overflatebetennelse. En robust TH17-respons som rekrutterer nøytrofiler i musemodellen av AED og en økning i nøytrofiler og andre myeloide celler i tårevæsken hos pasienter med MGD indikerer rollen som nøytrofiler som hindrer MG21. Tilstedeværelsen av aggNETs som okkluderte MG-åpningene ble bekreftet med peptidyl arginin deiminase 4 hos mus med AED. I denne modellen viste nøytrofiler en redusert evne til å aggregere og dannet aggNETs som hindret kanalene og åpningene til MG-kjertlene10. Videre viste tåreanalyse fra pasienter med MGD en økning i anafylatoksin C5a og kjemokin IL-8, som viste økt aktivitet i komplementsystemet og høy tilstrømning av nøytrofil infiltrasjon. Endelig understreker en økning i nivået av cytokiner assosiert med flere nøytrofile funksjoner, som IL-6, IL-18, MCP-1 / CCL-2 og MIG / CXCL9, den primære posisjonen til nøytrofiler i patogenesen av MGD11.
Forekomsten av MGD er en betydelig bidragsyter til utviklingen av DED, og undersøkelse av rollen til de mange elementene som er involvert i patogenesen av okulære manifestasjoner er komplisert24. Derfor er valget av dyr som modeller sterkt påvirket av spørsmålet som undersøkes. For eksempel fungerer kaniner som konvensjonelle modeller for farmasøytisk testing av formuleringer; Katte-, svin- og hundemodeller er egnet for å undersøke patologiske egenskaper som ligner på menneskelige pasienter, og mus er primært egnet for genetisk manipulasjon25.
Dyremodeller er verdifulle verktøy for å undersøke sykdomspatogenese og undersøke den terapeutiske effekten av ulike intervensjoner in vivo. For eksempel inkluderer konvensjonelle behandlinger administrering av øyedråpeinstillasjoner for å behandle kliniske okulære manifestasjoner; På grunn av tårestrøm og lacrimal dreneringssystem fjernes imidlertid slike okulære inngrep raskt fra okulær overflate. Dette medfører bare midlertidig handling og krever gjentatte administrasjoner og høye doser. For å løse dette problemet fungerte kaninmodellen av tørr øyesykdom (DED) som det ideelle mediet for å undersøke termogeler og karboniserte nanogeler (CNG) som alternative aktuelle behandlinger. Termogeler oppnådd ved å konjugere forskjellige grader av sulfatering av hyaluronsyre og en amin-avsluttet poly (N-isopropylakrylamid), når de administreres til øyet, forvandles til en gel. I kaninmodellen av DED ble denne gelen beholdt i lengre tid, og en enkelt dråpe reparerte det skadede hornhinneepitelet, stoppet apoptose og undertrykt okulær betennelse under en oppfølging på 7 dager, noe som tyder på et avbrudd i leukocyttinfiltrasjonen på grunn av inhibering av selektinmediert leukocyttinteraksjon26.
Videre, i kaninmodellen av DED, viste karboniserte nanogeler (CNG) som øyedråper frie radikaler som behandlet tåremangel og overdreven tårefordampning forårsaket av en forverret inflammatorisk respons og oksidativt stress. CNG ble oppnådd via pyrolyse av lysinhydroklorid (Lys-CNG) og administrert, og en enkelt dose reduserte DED-symptomene innen 4 dager. En lignende terapeutisk effekt var bare oppnåelig med flere behandlinger av en 10 ganger høyere mengde ciklosporin A øyedråpeinstillasjoner. Disse nye biokompatible farmasøytiske inngrepene viste overlegne perspektiver som enkeltdoseintervensjoner og mer utvidet okulær retensjon i prekliniske dyremodeller27.
Knockout av flere gener i musemodeller har avduket rollen som flere proteiner involvert i patogenesen av MGD. For eksempel induserer det dysregulerte genuttrykket til peroksisomproliferatoraktivert reseptor-gamma (PPAR γ)24 og endringer i signalveien endringer i cellesyklusinngang / proliferasjon, lipidsyntese og meibomisk kjertelatrofi under aldring13. I tillegg indikerte fraværet av βENaC (β - epitelial natriumkanal) i en musemodell at MG-dysfunksjonsfenotypen som var utbredt hos kvinner, var assosiert med MG-atrofi og åpningsobstruksjon som hos mennesker med pseudohypoaldosteronisme 1 (PHA) 28. Den essensielle rollen til CD147 ble også belyst hos mus, og det antas å opprettholde det rike lipidinnholdet i meibocytter29. Mus mangelfull for enzymet superoksiddismutase 1 viste forhøyet oksidativ lipid- og DNA-skade, som var knyttet til en økning i MG-betennelse30. Til slutt fører en enkelt mutasjon i ELOVL4 som koder for enzymet som kreves for å syntetisere ekstremt langkjedede fettsyrerester som danner meibumlipidomet, til funksjonelle endringer i den fremre okulære overflaten31. Interessant nok ble MGD også indusert hos mus med et spesielt diett med ufullstendig lipidsammensetning for å evaluere den terapeutiske effekten av azitromycin som en oftalmisk formulering32.
Mens de fleste studiene som bruker musemodeller har identifisert flere gener involvert i MGD, mangler mange en underliggende immunologisk tilstand. AED-modellen gir en rekke mulige inngrep fra induksjon av immunresponsen, genereringen av IgE-antistoffer og effektorfasen, ledsaget av flere patologiske forandringer som ligner human fordampnings-MGD.
Ved undersøkelse av MGD ved bruk av den nevnte protokollen, er det avgjørende å tilsette immunogen (OVA og kikhostetoksin) til alun i en 1:1-andel. Man bør inkubere blandingen i 30 minutter ved romtemperatur for god adsorpsjon av ovalbumin-kikhostetoksinet til alun. Disse interaksjonene er avgjørende for å utløse en tilstrekkelig immunrespons. I tillegg, under immunisering, må det tas hensyn under injeksjon, da dette kan føre til perforering av de underliggende organene i bukhulen. Dette kan resultere i utilstrekkelig immunisering og systemisk betennelse i musen, med dype effekter på immunresponsen.
Okulære ekssudater er store nettlignende ekstracellulære kromatinstrukturer som burinfiltrerer immunceller. Derfor er MNase-behandling av innsamlede okulære ekssudater fra denne modellen avgjørende for å oppnå encellede suspensjoner11. I tillegg er disse ekssudatene enkle å samle på okulær overflate og er en kilde til levedyktige nøytrofiler som har transmigrert fra sirkulasjonen. Hovedbegrensningen av denne teknikken er mengden ekssudat som skal samles fra okulære overflater. Tilsetning av 50 μL saltvann til hvert øye tillater utvinning av opptil 100 μL ekssudat fra en mus. Dette er knapt nok for 1-2 flowcytometri (FACS) farging og supernatanter for biokjemiske studier.
Dissekering med en skalpell for senere å plukke øyet og omkringliggende vev kan ofte forårsake skade på overfladisk temporal vene, dårligere palpebral vene eller okulær vinkelvene. Det anbefales å lage et snitt i huden med mindre dybde rundt øyet, da blødningen kan forstyrre ytterligere histologiske preparater. Under disseksjon av ett vev er lagring av andre vev i PBS viktig, da tørking eller utilstrekkelig smøring kan føre til tap av strukturelle egenskaper.
Under disseksjonen av hornhinnen fra øyekulen, hvis inkubasjonen av øyekulen på tørris ikke muliggjør en jevn kontroll, kan man forlenge tiden til opptil 5 minutter slik at snittet ved limbus og separasjon av hornhinnen er mulig.
Potensielle bruksområder
Okulær overflatebetennelse assosiert med MGD er en multifaktoriell sykdom. Utviklingen og progresjonen av dysfunksjon i disse lipidutskillende kjertlene kan skyldes oftalmiske, systemiske, hormonelle og genetiske faktorer, kjemikalier, legemidler, mekaniske skadelige midler og immunologiske responser33. Flere studier har rapportert nøytrofiler som forårsaker okklusjon av meibomiske kjertler og betennelse 11,21,34,35,36,37,38. Utviklingen av aktuelle og systemiske antiinflammatoriske inngrep som forstyrrer disse immunologiske veiene, kan gi lindring til pasienter som lider av okulært ubehag på grunn av MGD. Murine modell av allergisk øyesykdom kan benyttes i en preklinisk setting for å undersøke farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaper av disse midlene. Denne sykdomsmodellen muliggjør utvikling av hensiktsmessige strategier for å takle MGD og bidrar til å bestemme riktig administrasjon av aktuelle eller systemiske antiinflammatoriske midler som retter seg mot vitale komponenter i sykdomsfremkallende veier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av German Research Foundation (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, og av Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) til MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
References
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
- Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
- Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
- Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
- Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
- Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
- DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
- Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
- Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
- Nien, C. J., et al.
- Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
- Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
- Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
- Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
- Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
- Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
- Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
- Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
- Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
- Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters - New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
- Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
- Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
- Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
- Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
- Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
- McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
- Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
- Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
- Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
- Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
- von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
- Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).
