Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

केनोरहाब्डिस एलिगेंस आंतों का हाथ विच्छेदन

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64120
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Colorado State University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल जीनोमिक्स, प्रोटिओमिक्स, माइक्रोबायोम या अन्य परखों में इनपुट के लिए हाथ से वयस्क केनोरहाब्डिस एलिगेंस नेमाटोड कीड़े से आंतों को अलग करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है।

Abstract

केवल 20 कोशिकाओं से युक्त, केनोरहाब्डिस एलिगेंस आंत पाचन, चयापचय, उम्र बढ़ने, प्रतिरक्षा और पर्यावरणीय प्रतिक्रिया सहित कई जीवन-सहायक कार्यों का गठजोड़ है। एलिगेंस होस्ट और उसके पर्यावरण के बीच महत्वपूर्ण बातचीत आंत के भीतर अभिसरण करती है, जहां आंत माइक्रोबायोटा केंद्रित होता है। इसलिए, आंत-विशिष्ट प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए आंत के ऊतकों को बाकी कीड़े से दूर करने की क्षमता आवश्यक है। यह प्रोटोकॉल वयस्क सी एलिगेंस आंतों को हाथ से विच्छेदित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। प्रक्रिया को आसानी या प्रशिक्षण उद्देश्यों के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल उपभेदों में किया जा सकता है। एक बार तकनीक पूरी हो जाने के बाद, आंतों को किसी भी जीनोटाइप के बिना लेबल वाले कीड़े से एकत्र किया जा सकता है। यह माइक्रोडिसेक्शन दृष्टिकोण मेजबान आंतों के ऊतकों और आंत माइक्रोबायोटा के एक साथ कैप्चर के लिए अनुमति देता है, जो कई माइक्रोबायोम अध्ययनों के लिए एक लाभ है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न आंतों की तैयारी के लिए डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में शामिल हो सकते हैं लेकिन आंतों की कोशिकाओं से आरएनए अलगाव और कैप्चर किए गए माइक्रोबायोटा से डीएनए अलगाव तक सीमित नहीं हैं। कुल मिलाकर, सी एलिगेंस आंतों का हाथ विच्छेदन आंत जीव विज्ञान के महत्वपूर्ण पहलुओं की जांच करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि प्रदान करता है।

Introduction

केनोरहाब्डिस एलिगेंस नेमाटोड वर्म, केवल 959 कोशिकाओं और 4 दिन के अंडे से अंडे के जीवन चक्र के साथ, कई आनुवंशिकी, जीनोमिक्स और विकास ता्मक अध्ययनोंके लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली है। आगे और रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीनिंग में आसानी, इंजीनियर फ्लोरोसेंट मार्करों की व्यापकता, न्यूक्लियोटाइड-विशिष्ट जीनोम संपादन करने की क्षमता, और कई समुदाय-व्यापी संसाधनों ने सभी ने सी एलिगेंस प्रणाली में प्रमुख खोजों और अंतर्दृष्टि में योगदान दिया है। हालांकि, एक महत्वपूर्ण दोष कोशिकाओं, ऊतकों या अंगों की शुद्ध आबादी प्राप्त करने की कठिनाई है, जो छोटे, नाजुक हैं, और परस्पर जुड़े हो सकते हैं। चूंकि कोशिकाओं की शुद्ध आबादी जीनोमिक्स परख जैसे आरएनए-सेक, सीएचआईपी-सेक और एटीएसी-सेक के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए सी एलिगेंस कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों की शुद्ध तैयारी प्राप्त करने के लिए कई दृष्टिकोण सामने आए हैं। यहां, वयस्क सी एलिगेंस कीड़े से बड़े वर्गों में आंतों को हाथ से विच्छेदित करने की एक विधि का वर्णन किया गया है। परिणामी तैयारी डाउनस्ट्रीम जीनोमिक्स परख (चित्रा 1) के लिए उपयुक्त हैं।

यहां वर्णित ठीक पैमाने पर ऊतक विच्छेदन विधि (चित्रा 2) सिर्फ एक दृष्टिकोण है। अन्य वैकल्पिक तकनीकों - जैसे आणविक टैगिंग, कीड़े को अलग करना, और फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) और पोस्ट हॉक विश्लेषण के साथ सेल प्रकारों को शुद्ध करना - सी एलिगेंस आणविक जीव विज्ञान की ऊतक-विशिष्ट विशेषताओं का सर्वेक्षण करने के लिए भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। इन अन्य दृष्टिकोणों पर हाथ विच्छेदन का एक लाभ, हालांकि, यह है कि इसका उपयोग सी एलिगेंस आंत और इसकी जीवाणु सामग्री 3,4,5 की विशेषताओं का एक साथ पता लगानेके लिए किया जा सकता है। यह 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण को सक्षम बनाता है और सी एलिगेंस प्रणाली के भीतर माइक्रोबायोम अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि, एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि आंतों की कोशिकाएं व्यक्तिगत रूप से अलग नहीं होती हैं।

आणविक टैगिंग केवल निर्दिष्ट ऊतक या रुचि की कोशिकाओं के भीतर अणुओं को एक सेल प्रकार-विशिष्ट टैग प्रदान करती है। इन टैग को तब कुल कृमि तैयारी से अलग किया जा सकता है। इस तरह, टैग किए गए पॉलीए-बाइंडिंग प्रोटीन या स्प्लिस्ड लीडर को चलाने वाले ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों ने ऊतक-विशिष्ट ट्रांसस्क्रिप्टम प्रोफाइलिंग 6,7,8,9,10 और 3'यूटीआर मैपिंग11,12 को सक्षम किया है। इसी तरह, ऊतक-विशिष्ट प्रतिलेखन कारक प्रोफाइल को CHIP-seq और DAMID का उपयोग करके आयोजित किया गया है, जिसमें प्रमोटर-विशिष्ट प्रतिलेखन कारक वेरिएंट को टैग या एंजाइम संलयन13,14 के साथ जोड़ा गया था।

एफएसीएस उनके आंतरिक सेलुलर विशेषताओं और फ्लोरोसेंट गुणों के आधार पर अलग किए गए कीड़े से सेल प्रकार के हित को अलग करने की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण ने विभिन्न अंगों 8,15,16 और व्यक्तिगत न्यूरोनल सेल प्रकार 8,9,15,16,17,18 से ऊतक-विशिष्ट ट्रांसस्क्रिप्टम उत्पन्न किए हैं और इसका उपयोग पूरे सी एलिगेंस तंत्रिका तंत्र 19,20 का अभिव्यक्ति मानचित्र बनाने के लिए किया गया है। . एफएसीएस, और इसके चचेरे भाई प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक सॉर्टिंग (एफएएनएस), का उपयोग सेल-विशिष्ट क्रोमैटिन प्रोफाइल21,22 उत्पन्न करने के लिए भी किया गया है।

अंत में, पोस्ट-हॉक विश्लेषण एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन परख में किया जा सकता है। इस विधि में, सभी अलग-अलग कोशिकाओं का सर्वेक्षण किया जाता है, प्रत्येक के सेल प्रकार को विश्लेषण चरण में रखा जाता है, और सेल प्रकार की रुचि को आगे के अध्ययन के लिए चुनिंदा रूप से फ़िल्टर किया जाता है। सी एलिगेंस भ्रूण 23,24,25,26,27 और एल 128 चरण कीड़े में उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प दोनों के साथ विकासशील कोशिकाओं के प्रतिलेख प्राप्त करने के लिए पोस्ट-हॉक विश्लेषण का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। क्रोमैटिन पहुंच को एक समान रणनीति 29 का उपयोग करके आरएनए-सेक के बजाय एटीएसी-सेक का उपयोग करके भीचित्रित किया गया है।

प्रत्येक दृष्टिकोण के अपने फायदे और सीमाएं हैं। एलिगेंस आंत के लिए, आंत्र कोशिकाओं के कृमि विघटन और एफएसीएस अलगाव भ्रूण और लार्वा चरण30 में प्राप्त करने योग्य है लेकिन वयस्कों में चुनौतीपूर्ण है। यह आंत की बड़ी, एंडो-रिडुप्लिकेटेड और दृढ़ता से अनुयायी कोशिकाओं के कारण माना जाता है, जिससे उन्हें बिना क्षतिग्रस्त को अलग करना मुश्किल हो जाता है। यहां वर्णित हाथ विच्छेदन विधि इन चुनौतियों को दरकिनार करती है, जिससे वयस्क कीड़े की आंत के बड़े हिस्सों के अलगाव की अनुमति मिलती है। इस चरण से गोनाड को हाथ से विच्छेदित करने का अभ्यास व्यापक और सीधा है। आंत विच्छेदन गोनाड विच्छेदन के समान है लेकिन आमतौर पर कम कियाजाता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल डॉ जेम्स मैकघी और बार्ब गोज़ज़िन्स्की द्वारा विकसित एक लंबे, अप्रकाशित प्रोटोकॉल से अनुकूलित है। यह सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रारंभिक चरण के भ्रूण 23,33,34,35 से ब्लास्टोमेरेस को अलग करने के लिए तकनीकों को उधार लेता है। हालांकि सी एलिगेंस में अधिकांश कोशिका या ऊतक प्रकारों को अलग करने के लिए हाथ विच्छेदन संभव नहीं है, यह वयस्क कीड़े से आंतों को अलग करने के लिए आदर्श है। इसलिए, हाथ विच्छेदन आंत-विशिष्ट सेल तैयारी प्राप्त करने के लिए अन्य साधनों का पूरक है।

Protocol

वर्तमान अध्ययन के लिए सीएल 2122 कीड़े का उपयोग किया गया था। कीड़े एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (पी 40 ओडी010440) द्वारा वित्त पोषित केनोरहाब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी, सामग्री की तालिका देखें) के माध्यम से प्राप्त किए गए थे।

1. विच्छेदन के लिए कीड़े का बढ़ना

  1. मानक संवर्धन प्रक्रियाओं (यानी, ई कोलाई ओपी 50 के साथ बीजित एनजीएम प्लेटों) 36,37 के बाद सिंक्रनाइज़ेशन के लिए मिश्रित चरण सीएल 2122 कीड़े की एक बड़ी प्लेट उगाएं।
    नोट: आमतौर पर अधिकतम अंडे देने की क्षमता तक पहुंचने में ~ 96 घंटे लगते हैं।
    1. भ्रूण 72-96 घंटे की अवधि के भीतर कीड़े को तैयार करता है। भ्रूण तैयार करने के बाद, भ्रूण को 48 घंटे के लिए एम 9 ( तालिका 1 देखें) में हैच करने की अनुमति दें। यह एल 1 चरण कीड़े की तुल्यकालिक आबादी उत्पन्न करेगा।
      नोट: सीएल 2122 कीड़े आंत-विशिष्ट एमटीएल -2 (मेटैलोथियोनिन 2) प्रमोटर38 से संचालित एक एकीकृत ट्रांसजीन-जीएफपी (हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन) को परेशान करते हैं। यह प्रमोटर आंतों के सेल साइटोप्लाज्म के लिए विशिष्ट है और आंत को फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर देखने की अनुमति देता है। एक बार प्रशिक्षित होने के बाद, उपयोगकर्ताओं को प्रतिदीप्ति मार्गदर्शन आवश्यक नहीं लग सकता है।
  2. प्लेट ने कम से कम दो छोटी प्लेटों पर एल 1 कीड़े सिंक्रनाइज़ किए। पर्याप्त भोजन के साथ एनजीएम प्लेटों पर कीड़े उगाएं जब तक कि वे वयस्क चरण तक नहीं पहुंच जाते (अंडे देने में सक्षम भ्रूण की उपस्थिति से पहचाने जाते हैं)। यह 20 डिग्री सेल्सियस पर 38-46 घंटे के बीच लगता है।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखें कि एक ही विकास चरण प्रतिकृति और तुलनात्मक उपभेदों में काटा जाता है।
      नोट: कीड़े को विकसित करने के लिए समय की लंबाई तनाव, तापमान, खाद्य स्रोत और विकास चरण लक्षित39 पर निर्भर है। वयस्क चरण के पास अन्य चरणों का भी उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि एल 4 और पुराने वयस्क चरण। माइक्रोबायोम प्रयोगों की योजना बनाने के लिए, पारंपरिक खाद्य स्रोत (ई कोलाई ओपी 50) से परे विभिन्न जीवाणु खाद्य स्रोतों का उपयोग कीड़े को विकसित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि सेम्बियो उपभेद4 या रुचि के रोगज़नक़40।

2. स्टॉक समाधान और माइक्रोकेशिका पिपेट की तैयारी

नोट: तालिका 1 वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी बफर और समाधानों का विवरण प्रदान करती है।

  1. न्यूक्लियस मुक्त शंक्वाकार ट्यूब में 50 एमएल अंडा लवण (जैसे, अंडा बफर) तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक बार बन जाने के बाद, कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  2. न्यूक्लियस मुक्त शंक्वाकार ट्यूब में 100 एमएम लेवैमिसोल स्टॉक समाधान का 10 एमएल तैयार करें। एक बार तैयार होने के बाद, 500 μL एलिकोट बनाएं और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एलिकोट को एक बार में 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डीफ्रॉस्ट और संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. एक न्यूक्लियस-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 20 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक एसिटाइलेटेड बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) समाधान का 1 एमएल तैयार करें। एक बार तैयार होने के बाद, 50 μL एकल-उपयोग एलिकोट बनाएं और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: बीएसए के एसिटाइलेटेड संस्करण का उपयोग करना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह बीएसए का एकमात्र रूप है जो न्यूक्लियस-मुक्त है। गैर-एसिटाइलेटेड बीएसए न्यूक्लियस का एक महत्वपूर्ण स्रोत हो सकता है और इस प्रकार, नमूनों के क्षरण का कारण बन सकता है।
  4. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए प्रत्येक में कम से कम पांच 50 μm और 100 μm माइक्रोकेशिका पिपेट तैयार करें।
    1. सबसे पहले, सुई खींचने वाले का उपयोग करके एक इंजेक्शन सुई आकार में मानक ग्लास केशिकाओं (4 इंच लंबे और 1.2 मिमी बाहरी व्यास) को खींचें (सामग्री की तालिका देखें) और सटर इंस्ट्रूमेंट्स पिपेट कुकबुक41 से "अनुयायी सेल, सी एलिगेंस और ड्रोसोफिला" के लिए शर्तें (शर्तें: गर्मी = रैंप + 5; पुल = 100; वेल = 75; देरी = 90; दबाव = 500; 2.5 मिमी x 2.5 मिमी बॉक्स)।
    2. इसके बाद, माइक्रोकैपिलरी पिपेट को माइक्रोफोर्ज का उपयोग करके या तो 50 μm (एम 5/0.1 उद्देश्य के तहत माइक्रोफोर्ज ओकुलर शासक द्वारा इंगित तीन टिक चिह्न) या 100 μm (समान परिस्थितियों में पांच टिक चिह्न) आकार में बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। ये आकार माइक्रोकेशिका पिपेट (चित्रा 3) के अनुमानित उद्घाटन व्यास का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    3. फिर, माइक्रोकेशिका पिपेट पर एक मुंह एस्पिरेटर ट्यूब चिपकाएं।
      नोट: एस्पिरेटर पिपेट को पारंपरिक रूप से मुंह से पाइपिंग द्वारा नियंत्रित किया जाता है, लेकिन कई आधुनिक सुरक्षा प्रोटोकॉल इस विधि को अस्वीकार करते हैं। जैसे, उपयोगकर्ता उंगली और अंगूठे के बीच ट्यूबिंग को चुटकी मारकर मुंह की श्वास नली के साथ आकांक्षा को नियंत्रित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, अतिरिक्त सुरक्षा के लिए मुंह के एस्पिरेटर ट्यूबिंग सिस्टम के भीतर एक सिरिंज फिल्टर स्थापित किया जा सकता है।

3. प्रयोगात्मक तैयारी

  1. न्यूक्लियस मुक्त शंक्वाकार ट्यूब में 5 एमएल विच्छेदन बफर तैयार करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  2. न्यूक्लियस-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में काम करने वाले एसिटाइलेटेड बीएसए समाधान का 1 एमएल तैयार करें। बर्फ पर रखें।
  3. न्यूक्लियस-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 350 μL कार्यशील लेविसोल समाधान बनाएं। तीन प्रतियों में तैयार करें (लगभग 20 कीड़े के लिए एक ट्यूब)। बर्फ पर रखें।
  4. न्यूक्लियस-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में चेलेशन बफर तैयार करें (तालिका 1)। प्रतिकृति बनाएं (लगभग 10 विच्छेदित कीड़े के लिए एक ट्यूब)। बर्फ पर रखें। हाथ विच्छेदन के दौरान चेलेशन बफर का उपयोग करने से आरएनए की गुणवत्ता और मात्रा में सुधार होता है (चित्रा 4)।
  5. प्रति प्रयोगात्मक समूह में एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें जिसमें न्यूक्लियस-मुक्त ट्यूब में 500 μL न्यूक्लिक एसिड अलगाव अभिकर्मक या किट-निर्दिष्ट अलगाव अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) शामिल हैं। बर्फ पर रखें। इस ट्यूब का उपयोग भंडारण या बाद में उपयोग के लिए अंतिम, पृथक आंतों को इकट्ठा करने के लिए किया जाएगा।
  6. एक एम 9 स्नान और एक विच्छेदन बफर स्नान तैयार करें। ऐसा करने के लिए, दो 35 मिमी व्यास बाँझ पेट्री व्यंजन प्राप्त करें। फिर, एक डिश में 2 एमएल एम 9 और दूसरे में 2 एमएल विच्छेदन बफर जोड़ें। अंत में, प्रत्येक स्नान में काम करने वाले बीएसए समाधान के 100 μL जोड़ें। मिश्रण करने के लिए घुमाएं। स्नान में बीएसए जोड़ने से कीड़े प्लास्टिक से चिपकने से बच जाएंगे।
  7. विच्छेदन सरणी तैयार करें। एक 2-वेल कॉनकैविटी स्लाइड प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें) और पहले कुएं में 150 μL कार्यशील लेविसोल समाधान जोड़ें। फिर, दूसरे कुएं में 150 μL विच्छेदन बफर जोड़ें। अंत में, प्रत्येक कुएं में काम करने वाले बीएसए समाधान के 20 μL जोड़ें। प्रत्येक कुएं में बीएसए जोड़ने से कीड़े स्लाइड से चिपकने से बच जाएंगे।

4. सी एलिगेंस आंत का हाथ विच्छेदन

  1. एक कीड़ा पिक का उपयोग करके, एनजीएम प्लेट से 20 वयस्क कीड़े को एम 9 स्नान (चरण 3.6) में ले जाएं। यह कीड़े से बाहरी बैक्टीरिया को धो देगा।
  2. फिर, सभी 20 कीड़े को एम 9 स्नान से विच्छेदन बफर स्नान (चरण 3.6) में ले जाएं। यह आगे बाहरी बैक्टीरिया को धो देगा और विच्छेदन बफर में कीड़े को बराबर करेगा।
  3. इसके बाद, विच्छेदन बफर स्नान से कीड़े के बैचों (यानी, 10 के सेट में) को ले जाना लेवमिसोल समाधान (चरण 3.7) वाले कुएं में ले जाएं।
    नोट: लेवामिसोल अस्थायी रूप से कीड़े को लकवाग्रस्त कर देगा।
    1. एक बार जब कृमि आंदोलन धीमा हो जाता है, तो जल्दी से उन्हें लेवैमिसोल से विच्छेदन बफर वाले कुएं में ले जाएं (चरण 3.7)। इस बात का ध्यान रखें कि कीड़े को अधिक लकवाग्रस्त न करें।
      नोट: लेवमिसोल समाधान में बैचों में ले जाए गए कीड़े की संख्या उपयोगकर्ता के आराम के आधार पर भिन्न हो सकती है। यह शुरू में एम 9 स्नान में उठाए गए कीड़े की संख्या के लिए भी सच है और फिर विच्छेदन बफर स्नान में ले जाया गया। विच्छेदन के लिए अतिरिक्त कीड़े उपलब्ध होना अच्छा अभ्यास है, खासकर प्रशिक्षण के दौरान, क्योंकि उपयोगकर्ता सीखता है और प्रोटोकॉल के साथ सहज हो जाता है।
  4. फिर, विच्छेदन शुरू करने से पहले कीड़े को विच्छेदन बफर में थोड़ा आगे बढ़ना शुरू करने की अनुमति दें।
    नोट: आंतें अत्यधिक लकवाग्रस्त कीड़े (यानी, कीड़े जो बिल्कुल भी नहीं चल रहे हैं) से अच्छी तरह से बाहर नहीं निकलती हैं।
  5. तैयार होने पर, हाइपोडर्मिक सुई (यानी, 27 जी एक्स 1/2 इंच) का उपयोग करके फ्लोरोसेंट विच्छेदन दायरे के तहत कीड़े को विच्छेदित करें ( सामग्री की तालिका देखें) या तो ग्रसनी के ठीक पीछे (चित्रा 5एए) या मलाशय के ठीक सामने (चित्रा 5 एबी)। यह आंत के दो बड़े वर्गों का उत्पादन करेगा, एक पूर्वकाल-मध्य आधा और एक मध्य-पीछे का आधा। बाकी कीड़े के लिए इस पैटर्न को जारी रखें, आंतों की वांछित कुल संख्या प्राप्त होने तक पूर्ववर्ती-मध्य और मध्य-पीछे के वर्गों से प्राप्त आंत वर्गों की संख्या को बराबर रखें।
    नोट: हाइपोडर्मिक सुई को एक खाली 1 एमएल सिरिंज बैरल में चिपकाने से हाथ विच्छेदन के दौरान इसके हेरफेर में सहायता मिल सकती है। उपयोगकर्ता के आराम और अनुभव के आधार पर, विच्छेदन कटौती करना असामान्य नहीं है जो आंतों का कोई टुकड़ा नहीं देता है। हालांकि, अभ्यास के साथ, यह बहुत कम आम हो जाता है।
  6. आंतों को शरीर से अधिकतम रूप से बाहर निकालने के लिए लगभग 1 मिनट प्रतीक्षा करें। वे आम तौर पर एक लूप आकार लेते हैं और गोनैड्स (चित्रा 5 ए) के एक हिस्से से चिपके हो सकते हैं। प्रतीक्षा करते समय, आरएनए क्षरण को कम करने में मदद करने के लिए कुएं में 50 μL चेलेशन बफर जोड़ें (चित्रा 4)।
  7. प्रतीक्षा करते समय और आंत के एक्सट्रूज़न को सुविधाजनक बनाने में मदद करने के लिए, मुंह के श्वासयंत्र से जुड़े 100 μm माइक्रोकेशिका पिपेट का उपयोग करें और आंत / कीड़े को पिपेट के अंदर और बाहर खींचें (चित्रा 5 बी)। यह आंत को गोनाड से मुक्त करने में भी मदद करेगा। ध्यान रखें कि गलती से माइक्रोकेशिका पिपेट में पूरी तरह से चूसकर आंत को खो न दें।
    नोट: उपयोगकर्ता आंत को शरीर के बाकी हिस्सों और गोनैड से मुक्त करने के लिए 100 μm और 50 μm माइक्रोकेशिका पिपेट के बीच वैकल्पिक कर सकता है। 50 μm माइक्रोकेशिका पिपेट के छोटे व्यास के उद्घाटन आंत से चिपचिपे टुकड़ों को हटाने के लिए एक लाभ प्रदान कर सकता है। एस्पिरेटर पिपेट को पारंपरिक रूप से मुंह से पाइपिंग द्वारा नियंत्रित किया जाता है, लेकिन कई आधुनिक सुरक्षा प्रोटोकॉल इस विधि को अस्वीकार करते हैं। जैसे, उपयोगकर्ता उंगली और अंगूठे के बीच ट्यूबिंग को चुटकी मारकर मुंह की श्वास नली के साथ आकांक्षा को नियंत्रित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, अतिरिक्त सुरक्षा के लिए मुंह के एस्पिरेटर ट्यूबिंग सिस्टम के भीतर एक सिरिंज फिल्टर स्थापित किया जा सकता है।
  8. एक बार जब आंत पर्याप्त रूप से बाहर निकल जाती है, तो इसे शरीर के बाकी हिस्सों और किसी भी शेष गोनाड से काटने के लिए 27 जी हाइपोडर्मिक सुई का उपयोग करें। अलग किए गए आंत अनुभाग का आकार हार्वेस्टर के अनुभव, कट की गुणवत्ता और कीड़े में पक्षाघात के स्तर के आधार पर बहुत भिन्न हो सकता है।
    नोट: आंत और आंतों के टुकड़ों की अखंडता को उनके जीएफपी प्रतिदीप्ति के माध्यम से प्रोटोकॉल में आसानी से निगरानी की जा सकती है।
  9. अब, आंत अनुभाग को एस्पिरेट करने के लिए माइक्रोकेशिका पिपेट का उपयोग करें और इसे कुएं से बाहर ले जाएं और न्यूक्लिक एसिड अलगाव अभिकर्मक या किट-निर्दिष्ट अलगाव अभिकर्मक युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ले जाएं। पृथक आंतों को बर्फ पर अभिकर्मक में रखें और शेष आंतों के लिए दोहराएं।
    नोट: कई आंतों को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ा जा सकता है जिसमें न्यूक्लिक एसिड अलगाव अभिकर्मक या पूरे दिन एक अन्य किट-निर्दिष्ट अलगाव अभिकर्मक होता है। बर्फ पर रखें। यदि सभी आंतों को 1 दिन में अलग नहीं किया जा सकता है, तो जो पहले से ही अलग हैं और न्यूक्लिक एसिड अलगाव अभिकर्मक (जो न्यूक्लिक एसिड को संरक्षित करता है) में संग्रहीत हैं, उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है जब तक कि अलगाव फिर से शुरू न हो जाए और / या पूरा नहीं हो सकता। यहां, नमूने स्थिर दीर्घकालिक (यानी, कई महीनों से 1 वर्ष) हैं और न्यूक्लिक एसिड को अलग करने के लिए तैयार होने तक रह सकते हैं। आंतों को पानी या किसी भी किट-विशिष्ट लाइसिस बफर में काटा जा सकता है। हालांकि, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों पर जाने से पहले बर्फ (या अन्य वांछित तापमान) पर दिए गए बफर में आंतें कितनी देर तक रह सकती हैं, यह निर्धारित करते समय ध्यान दिया जाना चाहिए।

5. विच्छेदित आंतों से आरएनए अलगाव

  1. तीन फ्रीज / पिघलाव / भंवर चक्र ों का प्रदर्शन करके न्यूक्लिक एसिड अलगाव अभिकर्मक में संग्रहीत अधिग्रहित ऊतकों को समरूप करें। ऐसा करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस मोती स्नान और तरल नाइट्रोजन (या अन्य तुलनीय साधनों) का उपयोग करें।
  2. फिर, नमूने और भंवर में फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आईएए अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) के 0.2 वॉल्यूम जोड़ें। उदाहरण के लिए, 500 μL की प्रारंभिक नमूना मात्रा के लिए, क्लोरोफॉर्म के 0.2 वॉल्यूम 100 μL होंगे।
  3. ट्यूब को 20 सेकंड के लिए हाथ से हिलाएं, और फिर 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  4. सेंट्रीफ्यूजेशन (10,000 x g, 18 मिनट, 4 °C) द्वारा नमूना चरणों को अलग करें।
  5. जलीय चरण को हटा दें और एक नए न्यूक्लियस-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: ध्यान रखें कि इंटरफ़ेस को उत्तेजित या परेशान न करें।
  6. फिर, जलीय चरण में 100% इथेनॉल की समान मात्रा जोड़ें और नमूने को 20 सेकंड के लिए हाथ से हिलाएं।
  7. नमूने के 700 μL को स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। फिर, सेंट्रीफ्यूजेशन (≥8,000 x g, 30 s, RT [कमरे का तापमान]) के साथ कॉलम में आरएनए का पालन करें। प्रवाह के माध्यम से त्याग दें। किसी भी अतिरिक्त शेष नमूने के लिए दोहराएं।
  8. नमूना धोने के लिए कॉलम में 350 μL RW1 बफर ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। फिर, सेंट्रीफ्यूज (≥ 8,000 x g, 30 s, RT) और प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें।
  9. ऑन-कॉलम डीएनए पाचन करें। नमूना स्तंभ में आरडीडी बफर ( सामग्री की तालिका देखें) में DNase I का 80 μL जोड़ें। फिर, आरटी में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. फिर, नमूना धोने के लिए कॉलम में आरडब्ल्यू 1 बफर का 350 μL जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज (≥8,000 x g, 30 s, RT) और कॉलम को एक नए संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रवाह-माध्यम और पुराने संग्रह ट्यूब को छोड़ दें। यह धोने से DNase निकल जाता है।
  11. नमूना स्तंभ में RPE का 500 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। फिर, सेंट्रीफ्यूज (≥8,000 x g, 30 s, RT) और प्रवाह-माध्यम को छोड़ दें। दूसरे धोने के लिए दोहराएं।
  12. फिर, कॉलम झिल्ली को और सूखने के लिए अतिरिक्त 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज (≥8,000 x g, 1 मिनट, RT)। इसके बाद, नमूना कॉलम को ढक्कन के साथ एक ताजा न्यूक्लियस-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रवाह-माध्यम और पुराने संग्रह ट्यूब को छोड़ दें।
  13. नमूना स्तंभ की झिल्ली में सीधे न्यूक्लियस मुक्त पानी के 14 μL जोड़ें। फिर, आरटी पर 2 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, सेंट्रीफ्यूज (≥8,000 x g, 1 मिनट, RT) आरएनए को अलग करने के लिए।
  14. नमूने को बर्फ पर स्टोर करें। इसके बाद, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परख किट का उपयोग करके नमूने की आरएनए गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक बार पूरा हो जाने के बाद, नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
    नोट: आरएनए आम तौर पर गिरावट के बिना 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होता है।

Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग हाथ से वयस्क सी एलिगेंस से आंत के बड़े हिस्सों को अलग करने के लिए किया गया था (चित्रा 2)। दिखाए गए प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए अंतिम आंत का नमूना पूर्वकाल-मध्य और मध्य-पीछे की आंत वर्गों का एक समान संग्रह शामिल है। हालांकि, प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर, इसमें केवल पूर्ववर्ती, मध्य या पीछे की आंत वर्गों का संग्रह भी शामिल हो सकता है। सामूहिक रूप से, इस प्रोटोकॉल के लिए तीन प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं। पहला आंतों के सफल विच्छेदन और अलगाव को दर्शाता है (चित्रा 6)। दूसरा पृथक आंतों से आरएनए अलगाव के परिणामों की रिपोर्ट करता है (चित्रा 7)। तीसरा पृथक आंतों से माइक्रोबियल निगरानी के परिणामों को दर्शाता है (चित्रा 8)।

पहले परिणाम के लिए, चित्रा 6 ए प्रदर्शित करता है कि वयस्क सीएल 2122 कीड़े के भीतर चित्रा 5 ए में साइट "ए" पर प्राथमिक चीरा लगाने के बाद एक एक्सट्रूडेड आंत कैसी दिखती है। चूंकि सीएल 2122 कीड़े जीएफपी ( एमटीएल -2 पी: जीएफपी) से जुड़े आंत-विशिष्ट एमटीएल -2प्रमोटर को परेशान करते हैं, इसलिए फ्लोरोसेंट विच्छेदन दायरे के तहत पृथक आंतें हरे रंग की चमकेंगी। आंतों के खंड का सफल विच्छेदन तब चित्रा 6 बी में दिखाया गया है। यह आंत खंड गोनाड या शव से मलबे जैसे दिखाई देने वाले दूषित पदार्थों से मुक्त है। इसके विपरीत, चित्रा 6 सी आंतों को प्रदर्शित करता है जो सफलतापूर्वक विच्छेदित नहीं होते हैं, क्योंकि गोनाड और शव अभी भी आंतों के खंड से स्पष्ट रूप से जुड़े हुए हैं।

दूसरे परिणाम के लिए, आंतों को एक न्यूक्लिक एसिड अलगाव अभिकर्मक में काटा गया और अगले दिन कम इनपुट कुल आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करके संसाधित किया गया ( सामग्री की तालिका देखें)। पूर्वकाल-मध्य और मध्य-पश्चवर्ती वर्गों से 60 कुल आंत वर्गों का अंतिम आंत का नमूना उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए (चित्रा 7 ए) का लगभग 15 एनजी उत्पन्न करता है। कुल आंतों की यह मात्रा आसानी से एक ही दिन में प्राप्त की जा सकती है लेकिन जरूरत पड़ने पर कई दिनों तक टूट भी सकती है। हाथ विच्छेदन से आरएनए पैदावार आंतों की कोशिकाओं के कृमि विघटन और एफएसीएस अलगाव की तुलना में अधिक कुशल होती है जिसमें कुल आरएनए (चित्रा 7 बी) की अनुरूप मात्रा प्राप्त करने के लिए सैकड़ों हजारों आंतों की कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण रूप से, हाथ विच्छेदन द्वारा उत्पन्न आरएनए पैदावार वाणिज्यिक आरएनए-सेक लाइब्रेरी किट (यानी, एनईबीनेक्स्ट अल्ट्रा II और एनईबीनेक्स्ट सिंगल सेल / लो इनपुट) के लिए इनपुट के रूप में पर्याप्त से अधिक है, जो आरएनए के 2 पीजी जितना कम ले सकता है।

तीसरे परिणाम के लिए, आंतों को बाँझ डीडीएच20 में काटा गया और उसी दिन वाणिज्यिक माइक्रोबियल डीएनए अलगाव किट का उपयोग करके संसाधित किया गया ( सामग्री की तालिका देखें)। पूर्वकाल-मध्य और मध्य-पश्चवर्ती वर्गों से 40 कुल आंत वर्गों का अंतिम आंत का नमूना पैन-बैक्टीरियल डिटेक्शन परख ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके कुल माइक्रोबियल डीएनए के लगभग 0.009 पीजी का उत्पादन करता है (चित्रा 8)। ये मात्राएं पारंपरिक परिमाणीकरण विधियों के लिए बहुत कम हैं और इन्हें क्यूपीसीआर मानक वक्रों से निकाला जाना चाहिए। आदर्श रूप से, उपयोगकर्ताओं को आंतों की अंतिम कुल मात्रा >40 को लक्षित करना चाहिए क्योंकि इससे अभिकर्मक संदूषण स्तरों के बारे में सिग्नल-टू-शोर की पहचान सीमा और सीमा बढ़ जाती है।

प्रयोगात्मक डिजाइन पर विचार करते समय, उचित नियंत्रण नमूने एकत्र करना हमेशा आवश्यक होता है। ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स प्रयोगों के लिए, एक उपयुक्त प्रयोगात्मक नियंत्रण में आंतों के समान तरीके से एकत्र किए गए पूरे कीड़े की तैयारी शामिल हो सकती है। एलिगेंस से आंतों के विच्छेदन और अलगाव के दौरान, हालांकि, आंत के वर्गों से चिपके शव और गोनाड के टुकड़ों को देखना आम है। जबकि आदर्श रूप से इन दूषित ऊतकों को डाउनस्ट्रीम उपयोग के लिए भंडारण से पहले आंतों से हटा दिया जाएगा, अतिरिक्त प्रयोगात्मक नियंत्रणों में आंत विच्छेदन के बाद बचे हुए कीड़े के शवों का संग्रह और / या विच्छेदित गोनैड का संग्रह शामिल हो सकता है। माइक्रोबायोम प्रयोगों के लिए, नियंत्रण में पारंपरिक सकारात्मक (जीवाणु संस्कृति) और नकारात्मक (पानी) नियंत्रणों के अलावा आंतों के समान तरीके से एकत्र किए गए पूरे कीड़े की तैयारी भी शामिल हो सकती है।

Figure 1
चित्र 1: वयस्क C. एलिगेंस से आंतों का हाथ विच्छेदन विभिन्न प्रकार के डाउनस्ट्रीम ओमिक्स परखों में उपयोग के लिए ऊतक-विशिष्ट तैयारी उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: हाथ विच्छेदन प्रोटोकॉल के लिए योजना। इस प्रोटोकॉल का उपयोग हाथ से वयस्क सी एलिगेंस से आंत के बड़े हिस्सों को अलग करने के लिए किया गया था। आंतों को विभिन्न डाउनस्ट्रीम परखों के लिए अलग किया जा सकता है। यहां दिखाया गया है कि आरएनए अलगाव और माइक्रोबियल डीएनए अलगाव के लिए आंतों का उपयोग है। BioRender.com के साथ बनाई गई छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोकेशिका पिपेट निर्माण। (ए) एक ताजा खींचा गया लेकिन अनफोर्ग्ड माइक्रोकेपिलरी पिपेट को माइक्रोफोर्ज के ओकुलर टुकड़े के माध्यम से दिखाया जाता है। एक ओकुलर शासक का उपयोग 50 μm आकार के माइक्रोकेशिका पिपेट को तीन टिक चिह्नों (तीर द्वारा इंगित) के अनुमानित आंतरिक व्यास तक मापने के लिए किया जाता है। (B) 1 div = 0.1 mm के अंशांकन शासक के साथ विच्छेदन दायरे के तहत अनफोर्ग्ड, 50 μm और 100 μm माइक्रोकेशिका पिपेट को विच्छेदन दायरे के तहत दिखाया गया है। (C) (B) से 50 μm और 100 μm माइक्रोकेशिका पिपेट को फिर से दिखाया गया है लेकिन एक अलग सुविधाजनक बिंदु से। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: आरएनए उपज में सुधार के लिए हाथ विच्छेदन के दौरान चेलेशन बफर (सीबी) का उपयोग। एक कम इनपुट कुल आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल ने नामित ऊतकों से आरएनए तैयारी उत्पन्न की। प्रतिनिधि जेल वैद्युतकणसंचलन पृथक कुल आरएनए गुणवत्ता (आरआईएन, आरएनए अखंडता संख्या) और मात्रा को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: हाथ विच्छेदन चरण( A) प्रोटोकॉल में वर्णित विच्छेदन चरणों को यहां रेखांकित किया गया है। (1) में, कीड़े की आंत को जीएफपी प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना की जाती है। प्राथमिक चीरा साइट को आंत की पूरी लंबाई में कवरेज सुनिश्चित करने के लिए कीड़े के बीच समान रूप से वितरित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, या तो "ए" या "बी" प्राथमिक चीरा साइटों को पूर्वकाल-मध्य या मध्य-पीछे आंतों के टुकड़े-विशिष्ट तैयारी प्राप्त करने के लिए चुना जा सकता है। (2) में, आंत को एक लूप आकार लेते हुए बाहर निकाला गया है। (3) में, आंत को पहले कीड़े के शरीर से काट दिया जाता है, जबकि इसे शव और गोनाड से मुक्त करने का प्रयास किया जाता है। आंत को तब किसी भी शेष शव या गोनाड से हटा दिया जाता है जिसे हटाया नहीं जा सकता है। (4) में, आंत का एक साफ खंड अलग है और भंडारण के लिए तैयार है। (बी) एक महत्वपूर्ण कदम आंत से किसी भी चिपकने वाले मलबे (यानी, गोनैड, शव) को मुंह के एपिरेटर के अंत में बने माइक्रोकेशिका पिपेट के अंदर और बाहर पारित करके हटाना है। स्केल पट्टियाँ = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: हाथ विच्छेदन चरणों के प्रतिनिधि परिणाम। एक प्रतिनिधि छवि जो (ए) कीड़े से आंत के एक्सट्रूज़न को दिखाती है। ये सीएल 2122 जीनोटाइप के कीड़े हैं, जो आंतों के सेल-विशिष्ट एमटीएल -2 प्रमोटर के तहत जीएफपी व्यक्त करते हैं। दो प्रतिनिधि छवियां (बी) आंत के एक साफ और पूरी तरह से पृथक खंड और (सी) एक पृथक आंत को दूषित गोनाड और शव ऊतकों के साथ दिखाती हैं। स्केल पट्टियाँ = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: पृथक आंतों से कुल आरएनए निष्कर्षण के प्रतिनिधि परिणाम। (A) अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा हल की गई आरएनए तैयारी की एक प्रतिनिधि छवि दिखाई गई है, जो गुणवत्ता (आरआईएन, आरएनए अखंडता संख्या) और पृथक कुल आरएनए की मात्रा को दर्शाती है। (बी) फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) के माध्यम से एल 1 चरण कीड़े से काटे गए आंतों की कोशिकाओं से पृथक कुल आरएनए का एक प्रतिनिधि जेल तुलना के लिए दिखाया गया है। प्रति आंत 20 कोशिकाओं पर, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि हाथ विच्छेदन विधि एफएसीएस-शुद्ध आंतों की कोशिकाओं की तुलना में प्रति आंत अधिक कुल आरएनए उत्पन्न करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: पृथक आंतों से कुल माइक्रोबियल डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रतिनिधि परिणाम। एक वाणिज्यिक माइक्रोबियल डीएनए अलगाव किट ने आंतों, पूरे कीड़े और नियंत्रण से डीएनए तैयारी उत्पन्न की। नमूनों में बैक्टीरिया की संख्या को निर्धारित करने के लिए एक पैन-बैक्टीरियल जीन परख का उपयोग किया गया था। (ए) उत्पन्न क्यूपीसीआर प्रवर्धन वक्रों की एक प्रतिनिधि छवि, (बी) नमूनों को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले ई कोलाई ओपी 50 मानक वक्र, और (सी) नमूने दिखाए गए हैं। (बी) में, ई कोलाई मानकों की लॉग प्रारंभिक सांद्रता को उनकेसीटी मानों के खिलाफ ग्राफ किया जाता है। (सी) में, 40 पूरे कीड़े के दो प्रतिकृति (प्रतिनिधि) को औसत दर्जे से काटा गया था, और माइक्रोबियल जीडीएनए अलगाव के लिए 40 अलग आंतों के वर्गों को संसाधित किया गया था। QPCR रन से नो-टेम्पलेट-कंट्रोल (NTC) भी दिखाया गया है। वाई-अक्ष नमूना सी टी मानों का प्रतिनिधित्व करताहै । पीसीआर से परिमाणित डीएनए की मात्रा को नमूना सलाखों के ऊपर कुल पिकोग्राम (पीजी) मूल्यों के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले बफर और समाधानों की रचनाएं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह लेख वयस्क सी एलिगेंस से आंतों को हाथ से विच्छेदित करने के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जिससे डाउनस्ट्रीम परख के लिए शुद्ध तैयारी उत्पन्न होती है। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में (1) यह सुनिश्चित करना शामिल है कि कीड़े को अधिक लकवाग्रस्त न किया जाए, (2) सटीक विच्छेदन कटौती करना, (3) विच्छेदन के लिए उचित आकार के माइक्रो-पिपेट बनाना, और (4) अंतिम फसल के दौरान स्वस्थ आंतों की शीघ्र वसूली सुनिश्चित करना। इन कारणों से, कीड़े को लेवमिसोल समाधान में उजागर करते समय सावधानी बरतनी चाहिए, और अधिकतम तीखेपन को सुनिश्चित करने के लिए हाइपोडर्मिक सुइयों को अक्सर ताज़ा करने की आवश्यकता होती है। माइक्रोकेशिका पिपेट और मुंह के श्वासयंत्र का उपयोग करके आंत को संभालना एक और कदम है जो अभ्यास करेगा। उचित आकार के ठीक से जाली माइक्रो-पिपेट भी सूक्ष्म-पिपेट के भीतर आंतों को खोने के जोखिम को कम करने के अलावा विच्छेदन के दौरान आंत के बड़े हिस्सों को अलग करने में पर्याप्त अंतर बनाते हैं। नए प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता आमतौर पर माइक्रोकेशिका पिपेट के आंतरिक किनारे पर आंतों को खो देते हैं, इससे पहले कि उन्हें अलगाव अभिकर्मक में बाहर निकाला जा सके। इस समस्या को अभ्यास के साथ संशोधित किया जा सकता है और ठीक से जाली माइक्रोकेशिका पिपेट।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क कीड़े में उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया था। प्रारंभिक परीक्षण समर्थन करते हैं कि यह प्रोटोकॉल एल 4 कीड़े और पुराने वयस्क कीड़े में उपयोग के लिए भी प्रभावी है। हालांकि, प्रारंभिक लार्वा चरण कीड़े में इस प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता का अभी तक मूल्यांकन नहीं किया गया है। इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि इससे मिलने वाली सामग्री की छोटी मात्रा है। हालांकि मात्रा आरएनए-सेक और पीसीआर के लिए पर्याप्त है, लेकिन वे अन्य परखों के लिए पर्याप्त नहीं हो सकते हैं। जैसे, उपयोगकर्ताओं को यह निर्धारित करने की आवश्यकता है कि क्या परख के लिए न्यूनतम आवश्यक इनपुट को इस प्रोटोकॉल के साथ आसानी से एकत्र किया जा सकता है।

हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से अलगाव30 के बाद आंतों की कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एफएसीएस का उपयोग करती है, आंतों की कोशिका पहचान के लिए पोस्ट-हॉक विश्लेषण विधियां, और यह हाथ विच्छेदन विधि30,42। हाथ विच्छेदन में वयस्क कीड़े में उपयोग के लिए उत्तरदायी होने का लाभ होता है जब कृमि विघटन और कोशिका अलगाव कम सफल होते हैं। इसके अलावा, हाथ विच्छेदन की तैयारी से निकाले गए कुल आरएनए की दक्षता और गुणवत्ता अधिक है, संभवतः क्योंकि ऊतकों को कीड़े से तेजी से तोड़ा जाता है और फिर जल्दी से न्यूक्लिक एसिड अलगाव अभिकर्मक में जमा किया जाता है, जिससे आरएनए क्षरण कम हो जाता है। हाथ विच्छेदन विधि का एक और लाभ यह है कि यह कम लागत, सीखने में आसान है, और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। अंत में, यह दृष्टिकोण कृमि आंतों से आंत बैक्टीरिया की फसल और अलगाव की अनुमति देता है, जिससे डाउनस्ट्रीम माइक्रोबायोम अध्ययन सक्षम होता है।

वयस्क सी एलिगेंस से आंतों को अलग करने के लिए यहां वर्णित हाथ विच्छेदन प्रोटोकॉल सी एलिगेंस जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। उदाहरण के लिए, आंतों की शुद्ध तैयारी के साथ, शोधकर्ता प्रतिरक्षा, उम्र बढ़ने, चयापचय और माइक्रोबायोम के बीच चौराहे की जांच कर सकते हैं।

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम जेम्स मैकघी और बारब गोस्ज़िन्स्की के अग्रणी काम के ऋणी हैं, जिन्होंने शुरू में आंत विच्छेदन विधि विकसित की थी जिससे इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है। हमारे काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, आर 35 जीएम 124877 टू ईओएन) द्वारा देखरेख में एक मीरा (आर 35) पुरस्कार और एनएसएफ एमसीबी डिवीजन ऑफ मॉलिक्यूलर एंड सेलुलर बायोसाइंस (ईओएन को पुरस्कार # 2143849) द्वारा देखरेख में एक एनएसएफ-करियर पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-420 Nuclease free BSA
CL2122 worm strain CGC (Caenorhabditis Genetics Center) CL2122 dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT.
Calcium Chloride Dihydrate Fisher C79 needed for making Egg Salts
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-108 Nuclease free conical tube needed for solution making.
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-103 Nuclease free conical tube needed for solution making.
Concavity slide (2-well) Electron Microscopy Sciences 71878-08 12-pk of 2-well concavity slides
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Millipore Sigma E3889 needed for making chelation buffer
Fluorescent Dissection Microscope Leica M205 FCA This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Millipore Sigma H4034 needed for making dissection buffer
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 for assesment of total RNA quality and quantity
HostZERO Microbial DNA Kit Zymo Research D4310 Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms
Hypodermic Needle (27G x 1/2") BD Scientific 305109 needed for hand dissection of intestines
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) Millipore Sigma L9756 used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines.
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) BD Scientific 309628 Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger.
Magnesium Chloride Hexahydrate Fisher M33 needed for making Egg Salts
Magnesium Sulfate Hpetahydrate Sigma-Aldrich 230391-500G needed for making M9 buffer
MF-900 Microforge Narishige MF-900 Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research.
1.7 mL Microtubes, Clear Olympus Plastics 22-282 Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage.
Mouth Aspirator Tube Millipore Sigma A5177 Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines.
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay Thermo Fisher A50137 Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR.
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instruments Model P-1000 Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging.
Petri Dish (35 x 10 mm) Genesee Scientific - Olympus Plastics 32-103 Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection.
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9730 Used in the isolation of total RNA
Potassium Chloride Millipore Sigma 529552 needed for making Egg Salts
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P0662-500G needed for making M9 buffer
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen Q33216 Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
Qubit RNA HS Assay Kit Invitrogen Q32852 Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2111 Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol.
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection
Sodium Chloride Fisher S271 needed for making Egg Salts
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S373-500 needed for making M9 buffer
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) Thermo Fisher 72302520 Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting.
4150 TapeStation System Agilent G2992AA Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix Applied Biosystems A52699 master mix used for qPCR
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred.
Worm Pick NA NA Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddel, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. C. elegans II. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  3. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  4. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  5. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  6. Roy, P. J., Stuart, J. M., Lund, J., Kim, S. K. Chromosomal clustering of muscle-expressed genes in Caenorhabditis elegans. Nature. 418 (6901), 975-979 (2002).
  7. Pauli, F., Liu, Y., Kim, Y. A., Chen, P. -J., Kim, S. K. Chromosomal clustering and GATA transcriptional regulation of intestine-expressed genes in C. elegans. Development. 133 (2), 287-295 (2005).
  8. Spencer, W. C., et al. A spatial and temporal map of C. elegans gene expression. Genome Research. 21 (2), 325-341 (2011).
  9. Spencer, W. C., et al. Isolation of specific neurons from C. elegans larvae for gene expression profiling. PLoS One. 9 (11), 112102 (2014).
  10. Ma, X., et al. Analysis of C. elegans muscle transcriptome using trans-splicing-based RNA tagging (SRT). Nucleic Acids Research. 44 (21), 156 (2016).
  11. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 4 (2015).
  12. Blazie, S. M., et al. Alternative polyadenylation directs tissue-specific miRNA targeting in Caenorhabditis elegans somatic tissues. Genetics. 206 (2), 757-774 (2017).
  13. Gómez-Saldivar, G., et al. et al.Tissue-specific transcription footprinting using RNA PoI DamID (RAPID) in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (4), 931-945 (2020).
  14. Katsanos, D., Barkoulas, M. Targeted DamID in C. elegans reveals a direct role for LIN-22 and NHR-25 in antagonizing the epidermal stem cell fate. Science Advances. 8 (5), 3141 (2022).
  15. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529 (7584), 92-96 (2015).
  16. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
  17. Mathies, L. D., et al. mRNA profiling reveals significant transcriptional differences between a multipotent progenitor and its differentiated sister. BMC Genomics. 20 (1), 427 (2019).
  18. Liang, X., Calovich-Benne, C., Norris, A. Sensory neuron transcriptomes reveal complex neuron-specific function and regulation of mec-2/ Stomatin splicing. Nucleic Acids Research. 50 (5), 2401-2416 (2021).
  19. Glenwinkel, L., et al. In silico analysis of the transcriptional regulatory logic of neuronal identity specification throughout the C. elegans nervous system. eLife. 10, 64906 (2021).
  20. Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  21. Charest, J., et al. Combinatorial action of temporally segregated transcription factors. Developmental Cell. 55 (4), 483-499 (2020).
  22. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Research. 22 (4), 766-777 (2012).
  23. Tintori, S. C., Nishimura, E. O., Golden, P., Lieb, J. D., Goldstein, B. A transcriptional lineage of the early C. embryo. Developmental Cell. 38 (4), 430-444 (2016).
  24. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  25. Hashimshony, T., Feder, M., Levin, M., Hall, B. K., Yanai, I. Spatiotemporal transcriptomics reveals the evolutionary history of the endoderm germ layer. Nature. 519 (7542), 219-222 (2015).
  26. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
  27. Warner, A. D., Gevirtzman, L., Hillier, L. W., Ewing, B., Waterston, R. H. The C. elegans embryonic transcriptome with tissue, time, and alternative splicing resolution. Genome Research. 29 (6), 1036-1045 (2019).
  28. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  29. Durham, T. J., et al. Comprehensive characterization of tissue-specific chromatin accessibility in L2 Caenorhabditis elegans nematodes. Genome Research. 31 (10), 1952-1969 (2021).
  30. King, D. C., et al. The transcription factor ELT-2 positively and negatively impacts direct target genes to modulate the Caenorhabditis elegans intestinal transcriptome. bioRxiv. , (2021).
  31. Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle analysis in the C. elegans germline with the thymidine analog EdU. Journal of Visualized Experiments. (140), e58339 (2018).
  32. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  33. Edgar, L. G., Wolf, N., Wood, W. B. Early transcription in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 120 (2), 443-451 (1994).
  34. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and manipulation of embryonic cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  35. Nishimura, E. O., Zhang, J. C., Werts, A. D., Goldstein, B., Lieb, J. D. Asymmetric transcript discovery by RNA-seq in C. elegans blastomeres identifies neg-1, a gene important for anterior morphogenesis. PLoS Genetics. 11 (4), 1005117 (2015).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  38. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).
  39. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook – Introduction to C. elegans Anatomy. WormAtlas. , (2006).
  40. Tan, M. -W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 715-720 (1999).
  41. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument Company. , Novato, CA. https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2018).
  42. Dineen, A., Nishimura, E. O., Goszczynski, B., Rothman, J. H., McGhee, J. D. Quantitating transcription factor redundancy: The relative roles of the ELT-2 and ELT-7 GATA factors in the C. elegans endoderm. Developmental Biology. 435 (2), 150-161 (2018).

Tags

एलिगेंस आंत हाथ विच्छेदन एमटीएल -2 माइक्रोबायोम ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स
<em>केनोरहाब्डिस एलिगेंस आंतों का</em> हाथ विच्छेदन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. … More

Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. T. P., Osborne Nishimura, E. Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (187), e64120, doi:10.3791/64120 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter