Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Handdissektion av Caenorhabditis elegans tarmar

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64120
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Colorado State University

Summary

Detta protokoll beskriver ett förfarande för att isolera tarmar från vuxna Caenorhabditis elegans nematodmaskar för hand för inmatning i genomik, proteomik, mikrobiom eller andra analyser.

Abstract

Caenorhabditis elegans tarm består av endast 20 celler och är kopplingen mellan många livsuppehållande funktioner, inklusive matsmältning, metabolism, åldrande, immunitet och miljörespons. Kritiska interaktioner mellan C. elegans-värden och dess miljö konvergerar i tarmen, där tarmmikrobiota koncentreras. Därför är förmågan att isolera tarmvävnad bort från resten av masken nödvändig för att bedöma tarmspecifika processer. Detta protokoll beskriver en metod för handdissekering av vuxna C. elegans tarmar. Förfarandet kan utföras i fluorescerande märkta stammar för enkelhets- eller träningsändamål. När tekniken är fulländad kan tarmarna samlas in från omärkta maskar av vilken genotyp som helst. Denna mikrodissektionsmetod möjliggör samtidig fångst av värdens tarmvävnad och tarmmikrobiota, en fördel för många mikrobiomstudier. Som sådan kan nedströmsapplikationer för tarmpreparaten som genereras av detta protokoll inkludera men är inte begränsade till RNA-isolering från tarmceller och DNA-isolering från fångad mikrobiota. Sammantaget ger handdissektion av C. elegans tarmar en enkel och robust metod för att undersöka kritiska aspekter av tarmbiologi.

Introduction

Caenorhabditis elegans nematodmask, med bara 959 celler och en 4-dagars ägg-till-ägg-livscykel, är ett idealiskt modellsystem för många genetik-, genomik- och utvecklingsstudier 1,2. Lättheten av framåt- och omvänd genetisk screening, förekomsten av konstruerade fluorescerande markörer, förmågan att utföra nukleotidspecifik genomredigering och de många samhällsomfattande resurserna har alla bidragit till stora upptäckter och insikter i C. elegans-systemet. En signifikant nackdel är emellertid svårigheten att erhålla rena populationer av celler, vävnader eller organ, som är små, bräckliga och kan vara sammankopplade. Eftersom rena populationer av celler är viktiga för genomikanalyser som RNA-seq, ChIP-seq och ATAC-seq, har flera metoder uppstått för att erhålla rena preparat av C. elegans-celler, vävnader och organ. Här beskrivs en metod för handdissekering av tarmar, i stora delar, ur vuxna C. elegans-maskar. De resulterande preparaten är lämpliga för genomikanalyser nedströms (figur 1).

Den finskaliga vävnadsdissektionsmetoden som beskrivs här (figur 2) är bara ett tillvägagångssätt. Andra alternativa tekniker - såsom molekylär märkning, disaggregering av maskar och renande celltyper av intresse med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och post hoc-analys - har också framgångsrikt använts för att kartlägga de vävnadsspecifika egenskaperna hos C. elegans molekylärbiologi. En fördel med handdissektion jämfört med dessa andra tillvägagångssätt är dock att den kan användas för att samtidigt utforska funktionerna i C. elegans-tarmen och dess bakterieinnehåll 3,4,5. Detta möjliggör 16S rRNA-gensekvensering och underlättar mikrobiomstudier inom C. elegans-systemet. En viktig begränsning är dock att tarmcellerna inte är individuellt isolerade.

Molekylär märkning ger en celltypspecifik tagg till molekyler endast inom den angivna vävnaden eller cellerna av intresse. Dessa taggar kan sedan isoleras från totala maskpreparat. På detta sätt har vävnadsspecifika promotorer som driver ett taggat polyA-bindande protein eller skarvad ledare möjliggjort vävnadsspecifik transkriptomprofilering 6,7,8,9,10 och 3'UTR-kartläggning 11,12. På liknande sätt har vävnadsspecifika transkriptionsfaktorprofiler utförts med hjälp av ChIP-seq och DamID, där promotorspecifika transkriptionsfaktorvarianter bifogats med taggar eller enzymfusioner13,14.

FACS möjliggör isolering av celltyper av intresse från dissocierade maskar baserat på deras inneboende cellulära egenskaper och fluorescerande egenskaper. Detta tillvägagångssätt har genererat vävnadsspecifika transkriptom från olika organ 8,15,16 och enskilda neuronala celltyper 8,9,15,16,17,18 och har använts för att skapa en uttryckskarta över hela C. elegans nervsystem 19,20 . FACS, och dess kusin fluorescensaktiverade kärnor sortering (FANS), har också använts för att generera cellspecifika kromatinprofiler21,22.

Slutligen kan post-hoc-analys utföras i encellsupplösningsanalyser. I denna metod undersöks alla enskilda celler, celltypen för var och en tillskrivs i analyssteget och celltyperna av intresse filtreras selektivt för vidare studier. Post-hoc-analys har framgångsrikt använts för att erhålla transkriptom av utvecklande celler med både hög rumslig och tidsmässig upplösning i C. elegans embryon 23,24,25,26,27 och L1 28 stegmaskar. Kromatintillgänglighet har också karakteriserats med ATAC-seq istället för RNA-seq med en liknande strategi29.

Varje tillvägagångssätt har sina fördelar och begränsningar. För C. elegans-tarmen kan maskuppdelning och FACS-isolering av tarmceller uppnås i embryo- och larvstadierna30 men är utmanande hos vuxna. Detta tros bero på tarmens stora, endo-reduplicerade och starkt vidhäftande celler som gör dem svåra att dissociera oskadade. Handdissektionsmetoden som beskrivs här kringgår dessa utmaningar, vilket möjliggör isolering av stora delar av den vuxna maskens tarm. Bruket att handdissekera gonader från samma stadium är utbrett och enkelt. Tarmdissektion liknar gonaddissektion men utförs mindre vanligt32. Protokollet som presenteras här är anpassat från ett längre, opublicerat protokoll utvecklat av Dr. James McGhee och Barb Goszczynski. Detta strömlinjeformade protokoll lånar tekniker för att isolera blastomerer från embryon i tidigt stadium 23,33,34,35. Även om handdissektion inte är möjlig för att isolera de flesta cell- eller vävnadstyper i C. elegans, är den idealisk för att isolera tarmarna från vuxna maskar. Därför kompletterar handdissektion andra medel för att erhålla tarmspecifika cellpreparat.

Protocol

CL2122-maskar användes för den aktuella studien. Maskarna erhölls genom Caenorhabditis Genetics Center (CGC, se materialtabell), finansierat av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Odling av maskar för dissektion

  1. Odla en stor platta med CL2122-maskar med blandat stadium för synkronisering enligt standardodlingsprocedurer (dvs. NGM-plattor sådda med E. coli OP50)36,37.
    OBS: Det tar vanligtvis ~ 96 timmar att nå maximal äggläggningskapacitet.
    1. Embryo prep maskarna inom 72-96 h perioden. Efter embryoprepping, låt embryona kläckas i M9 (se tabell 1) i 48 timmar. Detta kommer att ge en synkron population av L1-stegmaskar.
      OBS: CL2122-maskar har en integrerad transgen-GFP (grönt fluorescerande protein) som drivs bort från tarmspecifika mtl-2 (MeTaLlothionein 2) promotor38. Denna promotor är specifik för tarmcellcytoplasman och gör att tarmen kan visualiseras på ett fluorescerande dissektionsmikroskop. När de väl har utbildats kanske användarna inte tycker att fluorescensvägledning är nödvändig.
  2. Platta synkroniserade L1-maskar på minst två små plattor. Växa maskar på NGM-plattor med tillräcklig mat tills de når vuxenstadiet (identifieras av närvaron av embryon som kan ägglägga). Detta tar mellan 38-46 timmar vid 20 °C.
    1. Var noga med att se till att samma utvecklingsstadium skördas över replikat och över jämförande stammar.
      OBS: Hur lång tid det tar att odla maskarna beror på den belastning, temperatur, matkälla och utvecklingsstadium som är mål39. Andra steg nära vuxenstadiet kan också användas, såsom L4 och äldre vuxna stadier. För planering av mikrobiomexperiment kan olika bakteriella matkällor utöver den traditionella matkällan (E. coli OP50) användas för att odla maskar, såsom CeMbio-stammarna4 eller en patogen av intresse40.

2. Beredning av stamlösningar och mikrokapillärpipetter

OBS: Tabell 1 innehåller detaljer om alla buffertar och lösningar som används för denna studie.

  1. Förbered 50 ml äggsalter (aka äggbuffert) i ett nukleasfritt koniskt rör (se materialtabell). När du är gjord, förvara vid rumstemperatur.
  2. Bered 10 ml 100 mM levamisol stamlösning i ett nukleasfritt koniskt rör. När de är beredda, gör 500 μl alikvoter och förvara dem vid −20 °C. Alikvoter kan tinas upp och förvaras vid 4 °C i 1 vecka i taget.
  3. Bered 1 ml 20 mg/ml stamacetylerat bovint serumalbumin (BSA) lösning i ett nukleasfritt mikrocentrifugrör. När de är beredda, gör 50 μl alikvoter för engångsbruk och förvara dem vid −20 °C.
    OBS: Det är viktigt att använda den acetylerade versionen av BSA eftersom detta är den enda formen av BSA som är nukleasfri. Icke-acetylerad BSA kan vara en betydande källa till nukleaser och därmed leda till nedbrytning av prover.
  4. Förbered minst fem 50 μm och 100 μm mikrokapillärpipetter var och en enligt stegen nedan.
    1. Dra först standardglaskapillärer (4 tum långa och 1,2 mm ytterdiameter) i en injektionsnålform med hjälp av en nåldragare (se materialtabell) och villkor för "Adherent Cell, C. elegans, & Drosophila" från Sutter Instruments Pipette Cookbook41 (Villkor: Värme = Ramp + 5; Dra = 100; = 75; Fördröjning = 90; tryck = 500; 2,5 mm x 2,5 mm låda).
    2. Smid sedan mikrokapillärpipetterna till antingen 50 μm (tre kryssmarkeringar som indikeras av mikroforge-okulärlinjalen under M5/0.1-målet) eller 100 μm (fem kryssmarkeringar under samma förhållanden) med hjälp av en mikroforge (se materialförteckning). Dessa storlekar representerar den uppskattade öppningsdiametern för mikrokapillärpipetten (figur 3).
    3. Fäst sedan ett munsugrör på mikrokapillärpipetterna.
      OBS: Aspiratorpipetter styrs traditionellt av munpipettering, men många moderna säkerhetsprotokoll tillåter inte denna metod. Som sådan, användare kan kontrollera aspiration med munnen aspirator slangar genom att klämma slangen mellan fingret och tummen. Dessutom kan ett sprutfilter installeras i munsugslangsystemet för ökad säkerhet.

3. Experimentell förberedelse

  1. Förbered 5 ml dissektionsbuffert i ett nukleasfritt koniskt rör. Förvaras i rumstemperatur.
  2. Förbered 1 ml arbetande acetylerad BSA-lösning i ett nukleasfritt mikrocentrifugrör. Håll dig på is.
  3. Gör 350 μl arbetande levamisolelösning i ett nukleasfritt mikrocentrifugrör. Förbered dig i tre exemplar (ett rör för ca 20 maskar). Håll dig på is.
  4. Bered keleringsbuffert i ett nukleasfritt mikrocentrifugrör (tabell 1). Gör i replikat (ett rör för cirka 10 dissekerade maskar). Håll dig på is. Användning av kelatbuffert under handdissektioner förbättrar RNA-kvalitet och kvantitet (figur 4).
  5. Bered ett mikrocentrifugrör per experimentgrupp som innehåller 500 μl nukleinsyraisoleringsreagens eller kitspecificerat isoleringsreagens (se materialförteckning) i ett nukleasfritt rör. Håll dig på is. Detta rör kommer att användas för att samla de slutliga, isolerade tarmarna för lagring eller senare användning.
  6. Förbered ett M9-bad och ett dissektionsbuffertbad. För att göra det, skaffa två sterila petriskålar med en diameter på 35 mm. Tillsätt sedan 2 ml M9 till en skål och 2 ml dissektionsbuffert till den andra. Slutligen tillsätt 100 μL fungerande BSA-lösning till varje bad. Virvla för att blanda. Att lägga till BSA i badet förhindrar att maskarna fastnar på plasten.
  7. Förbered dissektionsmatrisen. Skaffa en 2-brunns konkavitetsglas (se materialtabell) och tillsätt 150 μL arbetslevamisollösning till den första brunnen. Tillsätt sedan 150 μL dissektionsbuffert till den andra brunnen. Slutligen tillsätt 20 μL fungerande BSA-lösning till varje brunn. Att lägga till BSA i varje brunn förhindrar att maskarna fastnar på bilden.

4. Handdissektion av C. elegans-tarmen

  1. Använd en maskplockning och flytta 20 vuxna maskar från NGM-plattan till M9-badet (steg 3.6). Detta kommer att tvätta externa bakterier från maskarna.
  2. Flytta sedan alla 20 maskar från M9-badet till dissektionsbuffertbadet (steg 3.6). Detta kommer ytterligare att tvätta bort yttre bakterier och balansera maskarna i dissektionsbufferten.
  3. Flytta sedan partier av maskar (dvs. i uppsättningar om 10) från dissektionsbuffertbadet till den brunn som innehåller levamisollösning (steg 3.7).
    OBS: Levamisol kommer tillfälligt att förlama maskarna.
    1. När maskrörelserna har avtagit, flytta dem snabbt från levamisolbrunnen till brunnen som innehåller dissektionsbufferten (steg 3.7). Var försiktig så att du inte överförlamar maskarna.
      OBS: Antalet maskar som flyttas i omgångar till levamisolelösningen kan variera beroende på användarens komfort. Detta gäller också för antalet maskar som först plockades in i M9-badet och sedan flyttades in i dissektionsbuffertbadet. Det är bra att ha ytterligare maskar tillgängliga för dissektion, särskilt under träning, eftersom användaren lär sig och blir bekväm med protokollet.
  4. Låt sedan maskarna börja röra sig lite i dissektionsbufferten innan du börjar dissektionera.
    OBS: Tarmarna extruderar inte bra från alltför förlamade maskar (dvs maskar som inte rör sig alls).
  5. När du är klar, dissekera maskarna under ett fluorescerande dissekeringsomfång med hjälp av en hypodermisk nål (dvs. 27 G x 1/2 tum) (se materialtabell) genom att göra ett snitt antingen strax bakom svalget (figur 5Aa) eller precis framför ändtarmen (figur 5Ab). Detta kommer att producera två stora delar av tarmen, en främre-mitten hälften och en mitten av bakre halvanI. Fortsätt detta mönster för resten av maskarna och håll antalet tarmsektioner som erhållits från de främre-mellersta och mellersta bakre sektionerna ekvivalenta tills det önskade totala antalet tarmar förvärvas.
    OBS: Att fästa den hypodermiska nålen på en tom 1 ml sprutpipa kan hjälpa till att manipulera den under handdissektioner. Beroende på användarens komfort och erfarenhet är det inte ovanligt att göra ett dissektionssnitt som inte ger något tarmfragment. Men med övning blir detta mycket mindre vanligt.
  6. Vänta ca 1 min tills tarmarna maximalt extruderar från kroppen. De får vanligtvis en slingform och kan fastna på en del av gonaderna (figur 5A). Medan du väntar, tillsätt 50 μL keleringsbuffert till brunnen för att minska RNA-nedbrytningen (figur 4).
  7. Medan du väntar och för att ytterligare underlätta tarmsträngsprutning, använd den 100 μm mikrokapillärpipetten som är fäst vid en munsugare och dra tarmen / masken in och ut ur pipetten (figur 5B). Detta kommer också att bidra till att befria tarmarna från gonaden. Var försiktig så att du inte tappar tarmen genom att av misstag suga upp den helt i mikrokapillärpipetten.
    OBS: Användaren kan växla mellan 100 μm och 50 μm mikrokapillärpipetter för att frigöra tarmen från resten av kroppen och gonaden. Den mindre diameteröppningen av 50 μm mikrokapillärpipetten kan ge en fördel för att ta bort klibbiga bitar från tarmen. Aspiratorpipetter styrs traditionellt genom munpipettering, men många moderna säkerhetsprotokoll tillåter inte denna metod. Som sådan, användare kan kontrollera aspiration med munnen aspirator slangar genom att klämma slangen mellan fingret och tummen. Dessutom kan ett sprutfilter installeras i munsugslangsystemet för ökad säkerhet.
  8. När en tarm är tillräckligt extruderad, använd den 27 G hypodermiska nålen för att skära bort den från resten av kroppen och eventuell kvarvarande gonad. Storleken på den isolerade tarmsektionen kan variera mycket beroende på skördarens erfarenhet, skärets kvalitet och graden av förlamning i masken.
    OBS: Tarmens och tarmfragmentens integritet kan enkelt övervakas i hela protokollet via deras GFP-fluorescens.
  9. Använd nu mikrokapillärpipetten för att aspirera tarmsektionen och flytta den ut ur brunnen och in i mikrocentrifugröret som innehåller nukleinsyraisoleringsreagens eller kitspecificerat isoleringsreagens. Håll de isolerade tarmarna i reagens på is och upprepa för de återstående tarmarna.
    OBS: Flera tarmar kan tillsättas till mikrocentrifugröret som innehåller nukleinsyraisoleringsreagens eller ett annat kitspecificerat isoleringsreagens under hela dagen. Håll dig på is. Om alla tarmar inte kan isoleras på 1 dag kan de som redan är isolerade och lagrade i ett nukleinsyraisoleringsreagens (som bevarar nukleinsyrorna) hållas vid −80 ° C tills isoleringarna återupptas och / eller kan slutföras. Här är proverna stabila på lång sikt (dvs flera månader till 1 år) och kan förbli tills de är redo att isolera nukleinsyror. Tarmar kan skördas i vatten eller någon kitspecifik lysbuffert. Man måste dock ta hänsyn till hur länge tarmarna kan stanna i en viss buffert på is (eller annan önskad temperatur) innan man går vidare till nedströmsapplikationer.

5. RNA-isolering från dissekerade tarmar

  1. Homogenisera de förvärvade vävnaderna som lagras i nukleinsyraisoleringsreagenset genom att utföra tre frys- / tina / virvelcykler. För att göra det, använd ett 37 ° C pärlbad och flytande kväve (eller andra jämförbara medel).
  2. Tillsätt sedan 0,2 volymer fenol:kloroform:IAA-reagens (se materialförteckning) till provet och virveln kort. Till exempel, för en startprovvolym på 500 μL, skulle 0,2 volymer kloroform vara 100 μL.
  3. Skaka röret för hand i 20 s och inkubera sedan vid rumstemperatur i 3 minuter.
  4. Separera provfaserna genom centrifugering (10 000 x g, 18 min, 4 °C).
  5. Ta bort vattenfasen och överför till ett nytt nukleasfritt mikrocentrifugrör.
    OBS: Var försiktig så att du inte aspirerar eller stör gränssnittet.
  6. Tillsätt sedan en lika stor volym 100% etanol till vattenfasen och skaka provet för hand i 20 s.
  7. Överför 700 μl av provet till spinnkolonnen (se materialförteckning). Fäst sedan RNA på kolonnen med centrifugering (≥8 000 x g, 30 s, RT [rumstemperatur]). Kasta genomströmningen. Upprepa för ytterligare återstående prov.
  8. Tillsätt 350 μl RW1-buffert (se materialförteckning) i kolonnen för att tvätta provet. Centrifugera sedan (≥8 000 x g, 30 s, RT) och kassera genomströmningen.
  9. Utför DNA-matsmältning på kolonnen. Tillsätt 80 μL DNase I i RDD-buffert (se materialförteckning) i provkolumnen. Inkubera sedan i 15 minuter vid RT.
  10. Tillsätt sedan 350 μl RW1-buffert i kolonnen för att tvätta provet. Centrifugera (≥8 000 x g, 30 s, RT) och överför kolonnen till ett nytt uppsamlingsrör. Kassera genomströmningen och det gamla uppsamlingsröret. Denna tvätt tar bort DNase.
  11. Tillsätt 500 μl RPE (se materialförteckning) i provkolumnen. Centrifugera sedan (≥8 000 x g, 30 s, RT) och kassera genomströmningen. Upprepa för en andra tvätt.
  12. Centrifugera sedan i ytterligare 1 min för att ytterligare torka kolonnmembranet (≥8 000 x g, 1 min, RT). Överför sedan provkolonnen till ett nytt nukleasfritt mikrocentrifuguppsamlingsrör med lock. Kassera genomströmningen och det gamla uppsamlingsröret.
  13. Tillsätt 14 μl nukleasfritt vatten direkt till provkolonnens membran. Inkubera sedan provet i 2 minuter vid RT. Därefter centrifugera (≥8 000 x g, 1 min, RT) för att eluera RNA.
  14. Förvara provet på is. Därefter bedöma provets RNA-kvalitet och kvantitet med hjälp av kommersiellt tillgängliga analyssatser (se materialförteckningen). När du är klar förvarar du provet i en frys på −80 °C.
    OBS: RNA är i allmänhet stabilt vid −80 °C i upp till 1 år utan nedbrytning.

Representative Results

Detta protokoll användes för att isolera stora delar av tarmen från vuxna C. elegans för hand (figur 2). Det slutliga tarmprovet för varje experimentgrupp som visas består av en lika stor samling av främre-mellersta och mellersta bakre tarmsektioner. Beroende på den experimentella frågan kan den emellertid också omfatta en samling av endast främre, mellersta eller bakre tarmsektioner. Sammantaget presenteras tre representativa resultat för detta protokoll. Den första visar den framgångsrika dissektion och isolering av tarmarna (Figur 6). Den andra rapporterar resultaten av RNA-isolering från isolerade tarmar (figur 7). Den tredje visar resultaten av mikrobiell övervakning från isolerade tarmar (figur 8).

För det första resultatet visar figur 6A hur en extruderad tarm ser ut efter att ha gjort ett primärt snitt på plats "a" i figur 5A inom vuxna CL2122-maskar. Eftersom CL2122-maskar hyser den tarmspecifika mtl-2-promotorn smält till GFP (mtl-2 p::GFP) kommer isolerade tarmar att lysa grönt under det fluorescerande dissekeringsomfånget. Den framgångsrika dissektionen av ett tarmsegment visas sedan i figur 6B. Denna tarmsektion är fri från synliga föroreningar som skräp från gonaden eller slaktkroppen. Däremot visar figur 6C tarmar som inte framgångsrikt dissekeras, eftersom gonad och slaktkropp fortfarande är synligt fästa vid tarmsegmentet.

För det andra resultatet skördades tarmarna till ett nukleinsyraisoleringsreagens och bearbetades nästa dag med hjälp av ett låginmatat totalt RNA-extraktionsprotokoll (se materialförteckning). Ett slutligt tarmprov på 60 totala tarmsektioner från de främre-mellersta och mellersta bakre sektionerna ger ungefär 15 ng högkvalitativt totalt RNA (figur 7A). Denna mängd totala tarmar kan lätt erhållas på en enda dag men kan också brytas upp under flera dagar om det behövs. RNA-utbyten från handdissektion är effektivare än maskuppdelning och FACS-isolering av tarmceller genom att hundratusentals tarmceller krävs för att erhålla motsvarande mängder av totalt RNA (figur 7B). Det är viktigt att RNA-utbytena som genereras av handdissektion är mer än tillräckliga som indata för kommersiella RNA-seq-bibliotekssatser (dvs. NEBNext Ultra II och NEBNext Single Cell / Low Input), som kan ta så lite som 2 pg RNA.

För det tredje resultatet skördades tarmarna till sterilt ddH20 och bearbetades samma dag med hjälp av ett kommersiellt mikrobiellt DNA-isoleringskit (se materialtabell). Ett slutligt tarmprov på totalt 40 tarmsektioner från de främre-mellersta och mellersta bakre sektionerna ger cirka 0,009 pg totalt mikrobiellt DNA med hjälp av en panbakteriell detektionsanalys (se materialförteckning) (figur 8). Dessa kvantiteter är för låga för traditionella kvantifieringsmetoder och måste extrapoleras från qPCR-standardkurvor. Helst bör användarna rikta in sig på en slutlig total mängd tarmar >40 eftersom detta ökar detektionsgränsen och gränsen för signal-till-brus när det gäller reagenskontamineringsnivåer.

När man överväger experimentell design är det alltid nödvändigt att samla in lämpliga kontrollprover. För transkriptomikexperiment kan en lämplig experimentell kontroll innefatta preparat av hela masken som samlats in på samma sätt som tarmarna. Under dissektion och isolering av tarmar från C. elegans är det dock vanligt att se bitar av slaktkropp och gonad som klamrar sig fast vid tarmsektionerna. Även om dessa förorenande vävnader helst kommer att avlägsnas från tarmarna före lagring för användning nedströms, kan ytterligare experimentella kontroller inkludera insamling av kvarvarande maskkroppar efter tarmdissektion och / eller insamling av dissekerade gonader. För mikrobiomexperiment kan kontroller också inkludera preparat av hela masken som samlats in på samma sätt som tarmar, förutom konventionella positiva (bakteriekultur) och negativa (vatten) kontroller.

Figure 1
Figur 1: Handdissektion av tarmar från vuxna C. elegans som används för att generera vävnadsspecifika preparat för användning i en mängd olika nedströms omics-analyser. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Schema för handdissektionsprotokollet. Detta protokoll användes för att isolera stora delar av tarmen från vuxna C. elegans för hand. Tarmar kan isoleras för olika nedströmsanalyser. Här visas användningen av tarmar för RNA-isolering och mikrobiell DNA-isolering. Bild skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Tillverkning av mikrokapillärpipett. (A) En nydragen men oförfalskad mikrokapillärpipett visas genom den okulära biten av en mikroforge. En okulär linjal används för att mäta 50 μm mikrokapillärpipetter till en uppskattad innerdiameter på tre kryssmärken (visas, indikeras med pil). (B) Oförfalskade, 50 μm och 100 μm mikrokapillärpipetter visas under dissekeringsomfånget tillsammans med en kalibreringslinjal med 1 div = 0,1 mm. (C) 50 μm och 100 μm mikrokapillärpipetter från (B) visas igen men från en annan utsiktspunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Användning av keleringsbuffert (CB) under handdissektion för att förbättra RNA-utbytet. Ett lågt ingående totalt RNA-extraktionsprotokoll genererade RNA-preparat från namngivna vävnader. Representativa gelelektroforeskörningar som karakteriserar isolerad total RNA-kvalitet (RIN, RNA-integritetsnummer) och kvantitet visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: Steg för handdissektion. (A) De dissektionssteg som beskrivs i protokollet beskrivs här. I (1) visualiseras maskens tarm av GFP-fluorescens. Det primära snittstället kan fördelas jämnt mellan maskarna för att säkerställa jämn täckning över tarmens hela längd. Alternativt kan antingen "a" eller "b" primära snittställen väljas för att erhålla ett främre-mitten eller mitten av bakre tarmfragmentspecifikt preparat. I (2) har tarmen extruderat och fått en slingform. I (3) skärs tarmen först bort från maskkroppen medan man försöker befria den från slaktkroppen och gonaden. Tarmen avlägsnas sedan från eventuella kvarvarande slaktkroppar eller gonad som inte kan tas bort. I (4) är en rengjord del av tarmen isolerad och klar för lagring. (B) Ett kritiskt steg är att lossa allt klängande skräp (dvs. gonad, slaktkropp) från tarmen genom att föra det in och ut ur mikrokapillärpipetten som är formad i slutet av munsugen. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Representativa resultat av handdissektionssteg. En representativ bild som visar (A) extrudering av tarmen från masken. Dessa är maskar av CL2122-genotypen, som uttrycker GFP under den tarmcellspecifika mtl-2-promotorn . Två representativa bilder visar (B) en rengjord och helt isolerad del av tarmen och (C) en isolerad tarm med förorenande gonad- och slaktkroppsvävnader. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Representativa resultat av total RNA-extraktion från isolerade tarmar . (A) En representativ bild av RNA-preparat upplösta genom agarosgelelektrofores visas, som karakteriserar kvaliteten (RINs, RNA-integritetsnummer) och kvantiteten av isolerade totala RNA. (B) En representativ gel av totalt RNA isolerat från tarmceller skördade från L1-stegmaskar via fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) visas för jämförelse. Vid 20 celler per tarm kan man dra slutsatsen att handdissektionsmetoden ger mer totalt RNA per tarm än FACS-renade tarmceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Representativa resultat för total mikrobiell DNA-extraktion från isolerade tarmar. Ett kommersiellt mikrobiellt DNA-isoleringssats genererade DNA-preparat från tarmar, hela maskar och kontroller. En panbakteriell genanalys användes för att kvantifiera antalet bakterier i proverna. En representativ bild av (A) de genererade qPCR-förstärkningskurvorna, (B) E. coli OP50-standardkurvan som används för att kvantifiera proverna och (C) proverna visas. I (B) graferas loggstartkoncentrationerna av E. coli-standarder mot deras C T-värden. I (C) skars två replikat (reps) av 40 hela maskar medialt och 40 isolerade tarmsektioner bearbetades för mikrobiell gDNA-isolering. No-Template-Control (NTC) från qPCR-körningen visas också. Y-axeln representerar C-provets T-värden. Mängden DNA som kvantifierats från PCR visas som totala pikogram (pg) värden ovanför provstaplarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Sammansättningar av de buffertar och lösningar som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Denna artikel beskriver steg-för-steg-protokollet för handdissekering av tarmar från vuxna C. elegans, vilket genererar rena preparat för nedströmsanalyser. Kritiska steg i detta protokoll inkluderar (1) att säkerställa att inte överförlama maskarna, (2) göra exakta dissektionsskärningar, (3) smida mikropipetter av lämplig storlek för dissektion och (4) säkerställa snabb återhämtning av friska tarmar under den slutliga skörden. Av dessa skäl måste försiktighet iakttas när maskar utsätts för levamisollösningen, och de hypodermiska nålarna måste uppdateras ofta för att säkerställa maximal skärpa. Att hantera tarmen med hjälp av mikrokapillärpipetten och munsugen är ett annat steg som kommer att ta övning. Korrekt smidda mikropipetter av lämplig storlek gör också en väsentlig skillnad i att isolera stora delar av tarmen under dissektioner, förutom att minska risken för att förlora tarmarna i mikropipetten. Nya protokollanvändare förlorar vanligtvis tarmar på den inre kanten av mikrokapillärpipetten innan de kan matas ut i isoleringsreagenset. Detta problem kan ändras med övning och korrekt smidda mikrokapillärpipetter.

Protokollet som beskrivs häri var utformat för användning i vuxna maskar. Preliminära försök stöder att detta protokoll också är effektivt för användning i L4-maskar och äldre vuxna maskar. Effekten av detta protokoll har emellertid ännu inte utvärderats i tidiga larvstadiemaskar. En begränsning av detta tillvägagångssätt är den lilla mängd material det ger. Även om mängderna är tillräckliga för RNA-seq och PCR, kanske de inte är tillräckliga för andra analyser. Som sådan måste användarna avgöra om den minsta nödvändiga inmatningen för en analys kan samlas in med detta protokoll.

Vårt laboratorium använder rutinmässigt FACS för att rena tarmceller efter isolering 30, post-hoc-analysmetoder för identifiering av tarmceller och denna handdissektionsmetod30,42. Handdissektion har fördelen att den är mottaglig för användning i vuxna maskar när maskuppdelning och cellisolering är mindre framgångsrika. Dessutom är effektiviteten och kvaliteten på totalt RNA extraherat från handdissektionspreparat höga, troligen eftersom vävnaderna snabbt plockas från maskarna och sedan snabbt deponeras i ett nukleinsyraisoleringsreagens, vilket minskar RNA-nedbrytningen. En annan fördel med handdissektionsmetoden är att den är låg kostnad, lätt att lära sig och inte kräver specialutrustning. Slutligen möjliggör detta tillvägagångssätt skörd och isolering av tarmbakterier från masktarmar, vilket möjliggör nedströms mikrobiomstudier.

Handdissektionsprotokollet som beskrivs här för att isolera tarmar från vuxna C. elegans representerar ett kraftfullt verktyg för att studera olika aspekter av C. elegans biologi. Till exempel, med en ren beredning av tarmar, kan forskare undersöka skärningspunkten mellan immunitet, åldrande, metabolism och mikrobiomet.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi står i tacksamhetsskuld till James McGhees och Barb Goszczynskis pionjärarbete, som ursprungligen utvecklade tarmdissektionsmetoden från vilken detta protokoll anpassas. Vårt arbete stöds av en MIRA (R35) Award som övervakas av National Institute of General Medical Sciences (National Institutes of Health, R35GM124877 till EON) och ett NSF-CAREER Award som övervakas av NSF MCB Div Of Molecular and Cellular Bioscience (Award #2143849 till EON).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-420 Nuclease free BSA
CL2122 worm strain CGC (Caenorhabditis Genetics Center) CL2122 dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT.
Calcium Chloride Dihydrate Fisher C79 needed for making Egg Salts
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-108 Nuclease free conical tube needed for solution making.
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-103 Nuclease free conical tube needed for solution making.
Concavity slide (2-well) Electron Microscopy Sciences 71878-08 12-pk of 2-well concavity slides
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Millipore Sigma E3889 needed for making chelation buffer
Fluorescent Dissection Microscope Leica M205 FCA This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Millipore Sigma H4034 needed for making dissection buffer
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 for assesment of total RNA quality and quantity
HostZERO Microbial DNA Kit Zymo Research D4310 Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms
Hypodermic Needle (27G x 1/2") BD Scientific 305109 needed for hand dissection of intestines
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) Millipore Sigma L9756 used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines.
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) BD Scientific 309628 Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger.
Magnesium Chloride Hexahydrate Fisher M33 needed for making Egg Salts
Magnesium Sulfate Hpetahydrate Sigma-Aldrich 230391-500G needed for making M9 buffer
MF-900 Microforge Narishige MF-900 Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research.
1.7 mL Microtubes, Clear Olympus Plastics 22-282 Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage.
Mouth Aspirator Tube Millipore Sigma A5177 Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines.
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay Thermo Fisher A50137 Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR.
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instruments Model P-1000 Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging.
Petri Dish (35 x 10 mm) Genesee Scientific - Olympus Plastics 32-103 Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection.
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9730 Used in the isolation of total RNA
Potassium Chloride Millipore Sigma 529552 needed for making Egg Salts
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P0662-500G needed for making M9 buffer
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen Q33216 Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
Qubit RNA HS Assay Kit Invitrogen Q32852 Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2111 Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol.
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection
Sodium Chloride Fisher S271 needed for making Egg Salts
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S373-500 needed for making M9 buffer
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) Thermo Fisher 72302520 Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting.
4150 TapeStation System Agilent G2992AA Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix Applied Biosystems A52699 master mix used for qPCR
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred.
Worm Pick NA NA Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddel, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. C. elegans II. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  3. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  4. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  5. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  6. Roy, P. J., Stuart, J. M., Lund, J., Kim, S. K. Chromosomal clustering of muscle-expressed genes in Caenorhabditis elegans. Nature. 418 (6901), 975-979 (2002).
  7. Pauli, F., Liu, Y., Kim, Y. A., Chen, P. -J., Kim, S. K. Chromosomal clustering and GATA transcriptional regulation of intestine-expressed genes in C. elegans. Development. 133 (2), 287-295 (2005).
  8. Spencer, W. C., et al. A spatial and temporal map of C. elegans gene expression. Genome Research. 21 (2), 325-341 (2011).
  9. Spencer, W. C., et al. Isolation of specific neurons from C. elegans larvae for gene expression profiling. PLoS One. 9 (11), 112102 (2014).
  10. Ma, X., et al. Analysis of C. elegans muscle transcriptome using trans-splicing-based RNA tagging (SRT). Nucleic Acids Research. 44 (21), 156 (2016).
  11. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 4 (2015).
  12. Blazie, S. M., et al. Alternative polyadenylation directs tissue-specific miRNA targeting in Caenorhabditis elegans somatic tissues. Genetics. 206 (2), 757-774 (2017).
  13. Gómez-Saldivar, G., et al. et al.Tissue-specific transcription footprinting using RNA PoI DamID (RAPID) in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (4), 931-945 (2020).
  14. Katsanos, D., Barkoulas, M. Targeted DamID in C. elegans reveals a direct role for LIN-22 and NHR-25 in antagonizing the epidermal stem cell fate. Science Advances. 8 (5), 3141 (2022).
  15. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529 (7584), 92-96 (2015).
  16. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
  17. Mathies, L. D., et al. mRNA profiling reveals significant transcriptional differences between a multipotent progenitor and its differentiated sister. BMC Genomics. 20 (1), 427 (2019).
  18. Liang, X., Calovich-Benne, C., Norris, A. Sensory neuron transcriptomes reveal complex neuron-specific function and regulation of mec-2/ Stomatin splicing. Nucleic Acids Research. 50 (5), 2401-2416 (2021).
  19. Glenwinkel, L., et al. In silico analysis of the transcriptional regulatory logic of neuronal identity specification throughout the C. elegans nervous system. eLife. 10, 64906 (2021).
  20. Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  21. Charest, J., et al. Combinatorial action of temporally segregated transcription factors. Developmental Cell. 55 (4), 483-499 (2020).
  22. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Research. 22 (4), 766-777 (2012).
  23. Tintori, S. C., Nishimura, E. O., Golden, P., Lieb, J. D., Goldstein, B. A transcriptional lineage of the early C. embryo. Developmental Cell. 38 (4), 430-444 (2016).
  24. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  25. Hashimshony, T., Feder, M., Levin, M., Hall, B. K., Yanai, I. Spatiotemporal transcriptomics reveals the evolutionary history of the endoderm germ layer. Nature. 519 (7542), 219-222 (2015).
  26. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
  27. Warner, A. D., Gevirtzman, L., Hillier, L. W., Ewing, B., Waterston, R. H. The C. elegans embryonic transcriptome with tissue, time, and alternative splicing resolution. Genome Research. 29 (6), 1036-1045 (2019).
  28. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  29. Durham, T. J., et al. Comprehensive characterization of tissue-specific chromatin accessibility in L2 Caenorhabditis elegans nematodes. Genome Research. 31 (10), 1952-1969 (2021).
  30. King, D. C., et al. The transcription factor ELT-2 positively and negatively impacts direct target genes to modulate the Caenorhabditis elegans intestinal transcriptome. bioRxiv. , (2021).
  31. Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle analysis in the C. elegans germline with the thymidine analog EdU. Journal of Visualized Experiments. (140), e58339 (2018).
  32. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  33. Edgar, L. G., Wolf, N., Wood, W. B. Early transcription in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 120 (2), 443-451 (1994).
  34. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and manipulation of embryonic cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  35. Nishimura, E. O., Zhang, J. C., Werts, A. D., Goldstein, B., Lieb, J. D. Asymmetric transcript discovery by RNA-seq in C. elegans blastomeres identifies neg-1, a gene important for anterior morphogenesis. PLoS Genetics. 11 (4), 1005117 (2015).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  38. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).
  39. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook – Introduction to C. elegans Anatomy. WormAtlas. , (2006).
  40. Tan, M. -W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 715-720 (1999).
  41. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument Company. , Novato, CA. https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2018).
  42. Dineen, A., Nishimura, E. O., Goszczynski, B., Rothman, J. H., McGhee, J. D. Quantitating transcription factor redundancy: The relative roles of the ELT-2 and ELT-7 GATA factors in the C. elegans endoderm. Developmental Biology. 435 (2), 150-161 (2018).

Tags

Biologi utgåva 187 C. elegans tarm handdissektion mtl-2 mikrobiom transkriptomik
Handdissektion av <em>Caenorhabditis elegans</em> tarmar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. … More

Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. T. P., Osborne Nishimura, E. Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (187), e64120, doi:10.3791/64120 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter