Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hånd Disseksjon av Caenorhabditis elegans tarmene

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64120
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Colorado State University

Summary

Den nåværende protokollen beskriver en prosedyre for å isolere tarmene fra voksne Caenorhabditis elegans nematode ormer for hånd for innspill i genomikk, proteomikk, mikrobiom eller andre analyser.

Abstract

Caenorhabditis elegans tarm består av bare 20 celler, og er nexus av mange livsstøttende funksjoner, inkludert fordøyelse, metabolisme, aldring, immunitet og miljørespons. Kritiske interaksjoner mellom C. elegans-verten og dens miljø konvergerer i tarmen, hvor tarmmikrobiota konsentrerer seg. Derfor er evnen til å isolere tarmvev vekk fra resten av ormen nødvendig for å vurdere tarmspesifikke prosesser. Denne protokollen beskriver en metode for hånddissekering av voksne C. elegans tarmer. Prosedyren kan utføres i fluorescerende merkede stammer for enkelhet eller treningsformål. Når teknikken er perfeksjonert, kan tarmene samles fra umerkede ormer av enhver genotype. Denne mikrodisseksjonsmetoden tillater samtidig fangst av vertstarmvev og tarmmikrobiota, en fordel for mange mikrobiomstudier. Som sådan kan nedstrømsapplikasjoner for tarmpreparatene generert av denne protokollen inkludere, men er ikke begrenset til, RNA-isolasjon fra tarmceller og DNA-isolasjon fra fanget mikrobiota. Samlet sett gir hånddisseksjon av C. elegans tarmer en enkel og robust metode for å undersøke kritiske aspekter ved tarmbiologi.

Introduction

Caenorhabditis elegans nematodeorm, med bare 959 celler og en 4 dagers egg-til-egg livssyklus, er et ideelt modellsystem for mange genetikk-, genomikk- og utviklingsstudier 1,2. Den enkle genetiske screeningen fremover og omvendt, utbredelsen av konstruerte fluorescerende markører, kapasiteten til å utføre nukleotidspesifikk genomredigering og de mange samfunnsomfattende ressursene har alle bidratt til store funn og innsikt i C. elegans-systemet. En betydelig ulempe er imidlertid vanskeligheten med å skaffe rene populasjoner av celler, vev eller organer, som er små, skjøre og kan kobles sammen. Siden rene populasjoner av celler er viktige for genomikkanalyser som RNA-seq, ChIP-seq og ATAC-seq, har flere tilnærminger dukket opp for å oppnå rene preparater av C. elegans-celler, vev og organer. Her beskrives en metode for hånddissekering av tarmene, i store seksjoner, ut av voksne C. elegans ormer. De resulterende preparatene er egnet for nedstrøms genomikkanalyser (figur 1).

Finskala vevsdisseksjonsmetoden beskrevet her (figur 2) er bare én tilnærming. Andre alternative teknikker - som molekylær merking, disaggregering av ormer og rensing av celletyper av interesse med fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og post hoc-analyse - har også blitt brukt til å kartlegge de vevsspesifikke egenskapene til C. elegans molekylærbiologi. En fordel med hånddisseksjon over disse andre tilnærmingene er imidlertid at den kan brukes til samtidig å utforske funksjonene i C. elegans tarm og dens bakterielle innhold 3,4,5. Dette muliggjør 16S rRNA-gensekvensering og letter mikrobiomstudier i C. elegans-systemet. En viktig begrensning er imidlertid at tarmceller ikke isoleres individuelt.

Molekylær merking gir en celletypespesifikk tag til molekyler bare innenfor det angitte vevet eller cellene av interesse. Disse kodene kan deretter isoleres fra totale ormpreparater. På denne måten har vevsspesifikke promotorer som driver et merket polyA-bindende protein eller spleiset leder, aktivert vevsspesifikk transkriptomprofilering 6,7,8,9,10 og 3'UTR-kartlegging 11,12. Tilsvarende har vevsspesifikke transkripsjonsfaktorprofiler blitt utført ved bruk av ChIP-seq og DamID, der promotorspesifikke transkripsjonsfaktorvarianter ble lagt til med koder eller enzymfusjoner13,14.

FACS gjør det mulig å isolere celletyper av interesse fra dissosierte ormer basert på deres iboende cellulære egenskaper og fluorescerende egenskaper. Denne tilnærmingen har generert vevsspesifikke transkriptomer fra forskjellige organer 8,15,16 og individuelle nevroncelletyper 8,9,15,16,17,18 og har blitt brukt til å lage et uttrykkskart over hele C. elegans nervesystem 19,20 . FACS, og dens fetter fluorescensaktiverte kjernesortering (FANS), har også blitt brukt til å generere cellespesifikke kromatinprofiler21,22.

Endelig kan post-hoc-analyse utføres i enkeltcelleoppløsningsanalyser. I denne metoden undersøkes alle individuelle celler, celletypen til hver tilskrives i analysestadiet, og celletyper av interesse filtreres selektivt for videre studier. Post-hoc analyse har blitt brukt til å oppnå transkriptomer av utviklingsceller med både høy romlig og tidsmessig oppløsning i C. elegans embryoer 23,24,25,26,27 og L1 28 stadium ormer. Kromatintilgjengelighet har også blitt karakterisert ved bruk av ATAC-seq i stedet for RNA-seq ved hjelp av en lignende strategi29.

Hver tilnærming har sine fordeler og begrensninger. For C. elegans tarm er ormdisaggregering og FACS-isolering av tarmceller oppnåelig i embryo- og larvestadiene30, men er utfordrende hos voksne. Dette antas å skyldes tarmens store, endo-reduplikerte og sterkt adherente celler som gjør dem vanskelige å dissosiere uskadet. Hånddisseksjonsmetoden som er beskrevet her, omgår disse utfordringene, noe som muliggjør isolering av store deler av den voksne ormens tarm. Praksisen med å dissekere gonader fra samme stadium er utbredt og grei. Tarmdisseksjon ligner på gonaddisseksjon, men utføres mindre vanlig32. Protokollen som presenteres her er tilpasset fra en lengre, upublisert protokoll utviklet av Dr. James McGhee og Barb Goszczynski. Denne strømlinjeformede protokollen låner teknikker for å isolere blastomerer fra embryoer i tidlig stadium 23,33,34,35. Selv om hånddisseksjon ikke er mulig for å isolere de fleste celle- eller vevstyper i C. elegans, er den ideell for å isolere tarmene fra voksne ormer. Derfor kompletterer hånddisseksjon andre midler for å oppnå tarmspesifikke cellepreparater.

Protocol

CL2122 ormer ble brukt i denne studien. Ormene ble oppnådd gjennom Caenorhabditis Genetics Center (CGC, se materialtabell), finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Dyrking av ormer for disseksjon

  1. Dyrk en stor plate med blandede trinn CL2122 ormer for synkronisering etter standard dyrkingsprosedyrer (dvs. NGM-plater sådd med E. coli OP50) 36,37.
    MERK: Det tar vanligvis ~ 96 timer å nå maksimal eggleggingskapasitet.
    1. Embryo prep ormene innen 72-96 timers perioden. Etter embryoprepping, la embryoene klekkes i M9 (se tabell 1) i 48 timer. Dette vil gi en synkron populasjon av L1-trinns ormer.
      MERK: CL2122 ormer har en integrert transgen-GFP (grønt fluorescerende protein) drevet av tarmspesifikk mtl-2 (MeTaLlothionein 2) promotor38. Denne promotoren er spesifikk for tarmcellecytoplasma og gjør at tarmen kan visualiseres på et fluorescerende disseksjonsmikroskop. Når de er opplært, kan det hende at brukerne ikke finner fluorescensveiledning nødvendig.
  2. Plate synkronisert L1 ormer på minst to små plater. Dyrk ormer på NGM-plater med tilstrekkelig mat til de når voksenstadiet (identifisert ved tilstedeværelse av embryoer som er i stand til egglegging). Dette tar mellom 38-46 timer ved 20 °C.
    1. Pass på at det samme utviklingsstadiet høstes på tvers av replikasjoner og på tvers av komparative stammer.
      MERK: Hvor lang tid det tar å dyrke ormene er avhengig av belastningen, temperaturen, matkilden og utviklingsstadiet som er målrettet39. Andre stadier i nærheten av voksenstadiet kan også brukes, for eksempel L4 og eldre voksenstadier. For planlegging av mikrobiomeksperimenter kan forskjellige bakterielle matkilder utover den tradisjonelle matkilden (E. coli OP50) brukes til å dyrke ormer, for eksempel CeMbio-stammene4 eller et patogen av interesse40.

2. Tilberedning av stamløsninger og mikrokapillære pipetter

MERK: Tabell 1 gir detaljer om alle buffere og løsninger som brukes til denne studien.

  1. Forbered 50 ml eggsalter (aka eggbuffer) i et nukleasefritt konisk rør (se materialtabell). Når den er laget, oppbevares ved romtemperatur.
  2. Forbered 10 ml 100 mM levamisol stamløsning i et nukleasefritt konisk rør. Når de er tilberedt, lag 500 μL aliquots og oppbevar dem ved -20 ° C. Aliquots kan tines og oppbevares ved 4 °C i 1 uke av gangen.
  3. Klargjør 1 ml 20 mg/ml stamløsning av acetylert bovint serumalbumin (BSA) i et nukleasefritt mikrosentrifugerør. Når de er tilberedt, lag 50 μL engangs aliquots og oppbevar dem ved -20 ° C.
    MERK: Det er viktig å bruke den acetylerte versjonen av BSA fordi dette er den eneste formen for BSA som er nukleasefri. Ikke-acetylert BSA kan være en betydelig kilde til nukleaser og dermed føre til nedbrytning av prøver.
  4. Forbered minst fem 50 μm og 100 μm mikrokapillære pipetter hver ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Trekk først standard glasskapillærer (4 i lang og 1,2 mm ytre diameter) inn i en injeksjonsnålform ved hjelp av en nåltrekker (se materialtabell) og betingelser for "Adherent Cell, C. elegans, & Drosophila" fra Sutter Instruments Pipette Cookbook41 (Betingelser: Varme = Rampe + 5; Trekk = 100; Vel. = 75; Forsinkelse = 90; Trykk = 500; 2,5 mm x 2,5 mm boks).
    2. Deretter smi mikrokapillærpipetter til enten 50 μm (tre hakemerker som angitt av mikroforge okulær linjal under M5/0.1 målet) eller 100 μm (fem hakemerker under samme forhold) størrelse ved hjelp av en mikroforge (se Materialtabell). Disse størrelsene representerer den estimerte åpningsdiameteren til mikrokapillærpipetten (figur 3).
    3. Fest deretter et munnaspiratorrør til mikrokapillære pipetter.
      MERK: Aspiratorpipetter styres tradisjonelt ved munningpipettering, men mange moderne sikkerhetsprotokoller tillater ikke denne metoden. Som sådan kan brukerne kontrollere aspirasjon med munnaspiratorslangen ved å klemme slangen mellom fingeren og tommelen. I tillegg kan et sprøytefilter installeres i sugerrørsystemet for ekstra sikkerhet.

3. Eksperimentell forberedelse

  1. Forbered 5 ml disseksjonsbuffer i et nukleasefritt konisk rør. Oppbevares ved romtemperatur.
  2. Forbered 1 ml arbeidsacetylert BSA-løsning i et nukleasefritt mikrosentrifugerør. Hold på isen.
  3. Lag 350 μL arbeids levamisoloppløsning i et nukleasefritt mikrosentrifugerør. Forbered deg i tre eksemplarer (ett rør for ca 20 ormer). Hold på isen.
  4. Forbered chelateringsbuffer i et nukleasefritt mikrosentrifugerør (tabell 1). Lag i replikere (ett rør for ca 10 dissekerte ormer). Hold på isen. Bruk av chelateringsbuffer under hånddisseksjoner forbedrer RNA-kvalitet og kvantitet (figur 4).
  5. Forbered ett mikrosentrifugerrør per eksperimentell gruppe som inneholder 500 μL nukleinsyreisolasjonsreagens eller kit-spesifisert isolasjonsreagens (se materialtabell) i et nukleasefritt rør. Hold på isen. Dette røret vil bli brukt til å samle de endelige, isolerte tarmene for lagring eller senere bruk.
  6. Forbered ett M9-bad og ett disseksjonsbufferbad. For å gjøre det, få to sterile petriskåler med en diameter på 35 mm. Deretter legger du 2 ml M9 til en tallerken og 2 ml disseksjonsbuffer til den andre. Til slutt legger du til 100 μL arbeids-BSA-løsning til hvert bad. Virvle for å blande. Å legge BSA til badene vil forhindre at ormene fester seg til plasten.
  7. Forbered disseksjonsmatrisen. Få et 2-brønns konkavitetsskred (se materialtabell) og tilsett 150 μL arbeidslevamisolløsning til den første brønnen. Deretter legger du til 150 μL disseksjonsbuffer til den andre brønnen. Til slutt legger du til 20 μL fungerende BSA-løsning til hver brønn. Tilsetning av BSA til hver brønn vil forhindre at ormene fester seg til lysbildet.

4. Hånddisseksjon av C. elegans tarm

  1. Bruk en ormplukker til å flytte 20 voksne ormer fra NGM-platen inn i M9-badet (trinn 3.6). Dette vil vaske eksterne bakterier fra ormene.
  2. Flytt deretter alle 20 ormene fra M9-badet til disseksjonsbufferbadet (trinn 3.6). Dette vil ytterligere vaske bort eksterne bakterier og likevekte ormene i disseksjonsbufferen.
  3. Deretter flytter du grupper av ormer (dvs. i sett på 10) fra disseksjonsbufferbadet inn i brønnen som inneholder levamisoloppløsning (trinn 3.7).
    MERK: Levamisole vil midlertidig lamme ormene.
    1. Når ormebevegelsene avtar, flytt dem raskt fra levamisolbrønnen til brønnen som inneholder disseksjonsbufferen (trinn 3.7). Pass på at du ikke lammer ormene for mye.
      MERK: Antall ormer som flyttes i grupper inn i levamisol-løsningen kan variere basert på brukerens komfort. Dette gjelder også for antall ormer som først ble plukket inn i M9-badet og deretter flyttet inn i disseksjonsbufferbadet. Det er god praksis å ha flere ormer tilgjengelig for disseksjon, spesielt under trening, ettersom brukeren lærer og blir komfortabel med protokollen.
  4. La deretter ormene begynne å bevege seg litt i disseksjonsbufferen før du starter disseksjoner.
    MERK: Tarmene ekstruderer ikke godt fra altfor lammede ormer (dvs. ormer som ikke beveger seg i det hele tatt).
  5. Når du er klar, dissekerer ormene under et fluorescerende dissekeringsomfang ved hjelp av en hypodermisk nål (dvs. 27 G x 1/2 tommer) (se materialtabell) ved å lage ett kutt enten like bak svelget (figur 5Aa) eller like foran endetarmen (figur 5Ab). Dette vil produsere to store deler av tarmen, en fremre-midtre halvdel og en midtre bakre halvdelI. Fortsett dette mønsteret for resten av ormene, og hold antall tarmseksjoner oppnådd fra anterior-mid og mid-posterior seksjoner ekvivalent til ønsket totalt antall tarmer er anskaffet.
    MERK: Påføring av hypodermisk nål til en tom 1 ml sprøytesylinder kan hjelpe til med manipulering under hånddisseksjoner. Avhengig av brukerens komfort og erfaring, er det ikke uvanlig å lage et disseksjonskutt som ikke gir noe tarmfragment. Men med praksis blir dette langt mindre vanlig.
  6. Vent ca 1 min for tarmene å maksimalt ekstrudere fra kroppen. De har vanligvis en løkkeform og kan sitte fast på en del av gonadene (figur 5A). Mens du venter, tilsett 50 μL chelateringsbuffer i brønnen for å bidra til å redusere RNA-nedbrytning (figur 4).
  7. Mens du venter og for ytterligere å bidra til å lette tarmekstruderingen, bruk 100 μm mikrokapillærpipette festet til en munnaspirator og trekk tarmen / ormen inn og ut av pipetten (figur 5B). Dette vil også bidra til å frigjøre tarmen fra gonaden. Pass på at du ikke mister tarmen ved et uhell suger den helt opp i mikrokapillærpipetten.
    MERK: Brukeren kan veksle mellom 100 μm og 50 μm mikrokapillære pipetter for å frigjøre tarmen fra resten av kroppen og gonaden. Den mindre diameteråpningen på 50 μm mikrokapillærpipette kan gi en fordel for å fjerne klissete biter fra tarmen. Aspiratorpipetter styres tradisjonelt ved munningpipettering, men mange moderne sikkerhetsprotokoller tillater ikke denne metoden. Som sådan kan brukerne kontrollere aspirasjon med munnaspiratorslangen ved å klemme slangen mellom fingeren og tommelen. I tillegg kan et sprøytefilter installeres i sugerrørsystemet for ekstra sikkerhet.
  8. Når en tarm er tilstrekkelig ekstrudert, bruk 27 G hypodermisk nål for å kutte den bort fra resten av kroppen og eventuell gjenværende gonad. Størrelsen på tarmseksjonen isolert kan variere sterkt avhengig av høsterens erfaring, kuttets kvalitet og nivået av lammelse i ormen.
    MERK: Integriteten til tarm- og tarmfragmentene kan enkelt overvåkes gjennom hele protokollen via deres GFP-fluorescens.
  9. Bruk nå mikrokapillærpipetten til å aspirere tarmseksjonen og flytte den ut av brønnen og inn i mikrosentrifugerøret som inneholder nukleinsyreisolasjonsreagens eller kit-spesifisert isolasjonsreagens. Hold de isolerte tarmene i reagens på is og gjenta for de resterende tarmene.
    MERK: Flere tarmer kan tilsettes mikrosentrifugerøret som inneholder nukleinsyreisolasjonsreagens eller et annet kit-spesifisert isolasjonsreagens i løpet av dagen. Hold på isen. Hvis alle tarmene ikke kan isoleres på 1 dag, kan de som allerede er isolert og lagret i et nukleinsyreisolasjonsreagens (som bevarer nukleinsyrene) holdes ved -80 ° C til isolasjonene gjenopptas og / eller kan fullføres. Her er prøvene stabile på lang sikt (dvs. flere måneder til 1 år) og kan forbli til de er klare til å isolere nukleinsyrer. Tarmene kan høstes i vann eller en hvilken som helst kit-spesifikk lysisbuffer. Det må imidlertid tas hensyn til hvor lenge tarmene kan holde seg i en gitt buffer på is (eller annen ønsket temperatur) før man går videre til nedstrøms applikasjoner.

5. RNA-isolasjon fra dissekerte tarmer

  1. Homogeniser det oppkjøpte vevet som er lagret i nukleinsyreisolasjonsreagenset ved å utføre tre fryse / tine / hvirvelsykluser. For å gjøre det, bruk et 37 ° C perlebad og flytende nitrogen (eller andre sammenlignbare midler).
  2. Tilsett deretter 0,2 volumer fenol: kloroform: IAA-reagens (se materialtabell) til prøven og virvelen kort. For eksempel, for et startprøvevolum på 500 μL, vil 0,2 volumer kloroform være 100 μL.
  3. Rist røret for hånd i 20 s, og inkuber deretter ved romtemperatur i 3 minutter.
  4. Separer prøvefasene ved sentrifugering (10 000 x g, 18 min, 4 °C).
  5. Fjern den vandige fasen og overfør til et nytt nukleasefritt mikrosentrifugerør.
    MERK: Pass på at du ikke aspirerer eller forstyrrer grensesnittet.
  6. Deretter legger du til et likt volum 100% etanol til den vandige fasen og rister prøven for hånd i 20 s.
  7. Overfør 700 μL av prøven til spinnkolonnen (se Materialtabell). Deretter festes RNA til kolonnen med sentrifugering (≥8,000 x g, 30 s, RT [romtemperatur]). Kast gjennomstrømningen. Gjenta for ytterligere gjenværende prøve.
  8. Tilsett 350 μL RW1-buffer (se Materialtabell) i kolonnen for å vaske prøven. Deretter sentrifuger (≥8 000 x g, 30 s, RT) og kast gjennomstrømningen.
  9. Utfør DNA-fordøyelse på kolonnen. Legg til 80 μL DNase I i RDD-buffer (se Materialtabell) i eksempelkolonnen. Deretter ruger du i 15 minutter på RT.
  10. Deretter legger du til 350 μL RW1-buffer i kolonnen for å vaske prøven. Sentrifuge (≥8 000 x g, 30 s, RT) og overfør kolonnen til et nytt oppsamlingsrør. Kast gjennomstrømningen og det gamle oppsamlingsrøret. Denne vasken fjerner DNase.
  11. Legg til 500 μL RPE (se Materialtabell) i eksempelkolonnen. Deretter sentrifuger (≥8,000 x g, 30 s, RT) og kast gjennomstrømningen. Gjenta for en ny vask.
  12. Sentrifuge deretter i ytterligere 1 min for å tørke kolonnemembranen ytterligere (≥8,000 x g, 1 min, RT). Overfør deretter prøvekolonnen til et nytt nukleasefritt mikrosentrifugeoppsamlingsrør med lokk. Kast gjennomstrømningen og det gamle oppsamlingsrøret.
  13. Tilsett 14 μL nukleasefritt vann direkte til membranen i prøvekolonnen. Inkuber deretter prøven i 2 minutter ved RT. Deretter sentrifuge (≥8,000 x g, 1 min, RT) for å eluere RNA.
  14. Oppbevar prøven på is. Deretter vurderer du prøvens RNA-kvalitet og kvantitet ved hjelp av kommersielt tilgjengelige analysesett (se materialtabellen). Når du er ferdig, oppbevar prøven i en -80 ° C fryser.
    MERK: RNA er generelt stabilt ved -80 ° C i opptil 1 år uten nedbrytning.

Representative Results

Denne protokollen ble brukt til å isolere store deler av tarmen fra voksne C. elegans for hånd (figur 2). Den endelige tarmprøven for hver forsøksgruppe som vises, består av en lik samling av fremre-midtre og midtre bakre tarmseksjoner. Avhengig av det eksperimentelle spørsmålet, kan det imidlertid også omfatte en samling av bare fremre, midtre eller bakre tarmseksjoner. Samlet presenteres tre representative resultater for denne protokollen. Den første viser vellykket disseksjon og isolering av tarmene (figur 6). Den andre rapporterer resultatene av RNA-isolasjon fra isolerte tarmer (figur 7). Den tredje viser resultatene av mikrobiell overvåking fra isolerte tarmer (figur 8).

For det første resultatet viser figur 6A hvordan en ekstrudert tarm ser ut etter å ha gjort et primært snitt på stedet "a" i figur 5A i voksne CL2122 ormer. Ettersom CL2122-ormer har den tarmspesifikke mtl-2-promotoren smeltet sammen med GFP (mtl-2 p::GFP), vil isolerte tarmer lyse grønt under det fluorescerende dissekeringsomfanget. Den vellykkede disseksjonen av et tarmsegment er da vist i figur 6B. Denne tarmseksjonen er fri for synlige forurensninger som rusk fra gonaden eller. I motsetning til dette viser figur 6C tarmer som ikke er vellykket dissekert, da gonad og fortsatt er synlig festet til tarmsegmentet.

For det andre resultatet ble tarmene høstet inn i et nukleinsyreisolasjonsreagens og behandlet neste dag ved hjelp av en total RNA-ekstraksjonsprotokoll med lav inngang (se materialtabell). En siste tarmprøve på 60 totale tarmseksjoner fra fremre-midtre og midtre bakre seksjoner gir omtrent 15 ng total RNA av høy kvalitet (figur 7A). Denne mengden total tarm kan enkelt oppnås på en enkelt dag, men kan også brytes opp over flere dager om nødvendig. RNA-utbytter fra hånddisseksjon er mer effektive enn ormdisaggregering og FACS-isolering av tarmceller ved at hundretusener av tarmceller kreves for å oppnå tilsvarende mengder totalt RNA (figur 7B). Det er viktig at RNA-utbyttene generert ved hånddisseksjon er mer enn tilstrekkelige som inngang for kommersielle RNA-seq-bibliotekssett (dvs. NEBNext Ultra II og NEBNext Single Cell / Low Input), som kan ta så lite som 2 pg RNA.

For det tredje resultatet ble tarmene høstet i steril ddH20 og behandlet samme dag ved hjelp av et kommersielt mikrobielt DNA-isolasjonssett (se materialtabell). En endelig tarmprøve av 40 totale tarmseksjoner fra fremre-midtre og midtre bakre seksjoner gir rundt 0,009 pg av totalt mikrobielt DNA ved hjelp av en panbakteriell deteksjonsanalyse (se materialtabell) (figur 8). Disse mengdene er for lave for tradisjonelle kvantifiseringsmetoder og må ekstrapoleres fra qPCR-standardkurver. Ideelt sett bør brukerne målrette mot en endelig total mengde tarmer >40, da dette øker deteksjonsgrensen og grensen for signal-til-støy angående reagensforurensningsnivåer.

Når du vurderer eksperimentell design, er det alltid nødvendig å samle passende kontrollprøver. For transkriptomikkeksperimenter kan en egnet eksperimentell kontroll omfatte preparater av hele ormen samlet på samme måte som tarmene. Under disseksjon og isolering av tarmene fra C. elegans er det imidlertid vanlig å se biter av og gonad som klamrer seg til tarmseksjonene. Mens ideelt sett disse forurensende vev vil bli fjernet fra tarmen før lagring for nedstrøms bruk, kan ytterligere eksperimentelle kontroller inkluderer innsamling av leftover orm etter tarmen disseksjon og / eller samling av dissekerte gonader. For mikrobiomeksperimenter kan kontroller også omfatte preparater av hele ormen samlet på samme måte som tarmene, i tillegg til konvensjonelle positive (bakteriekultur) og negative (vann) kontroller.

Figure 1
Figur 1: Hånddisseksjon av tarmer fra voksne C. eleganer brukt til å generere vevsspesifikke preparater til bruk i en lang rekke nedstrøms omics-analyser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjema for hånddisseksjonsprotokollen. Denne protokollen ble brukt til å isolere store deler av tarmen fra voksne C. elegans for hånd. Tarmene kan isoleres for forskjellige nedstrømsanalyser. Vist her er bruk av tarmer for RNA-isolasjon og mikrobiell DNA-isolasjon. Bilde opprettet med BioRender.com. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Mikrokapillær pipettefabrikasjon. (A) En nytrukket, men uforfalsket mikrokapillærpipette vises gjennom det okulære stykket av en mikroforge. En okulær linjal brukes til å måle 50 μm størrelse mikrokapillære pipetter til en estimert indre diameter på tre hakemerker (vist, indikert med pil). (B) Unforged, 50 μm og 100 μm mikrokapillære pipetter vises under dissekeringsområdet sammen med en kalibreringslinjal med 1 div = 0,1 mm. (C) 50 μm og 100 μm mikrokapillære pipetter fra (B) vises igjen, men fra et annet synspunkt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Bruk av chelateringsbuffer (CB) under hånddisseksjon for å forbedre RNA-utbyttet. En total RNA-ekstraksjonsprotokoll med lav inngang genererte RNA-preparater fra navngitte vev. Representativ gelelektroforese kjører karakterisering av isolert total RNA-kvalitet (RIN, RNA-integritetsnummer) og kvantitet er vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Trinn for hånddisseksjon . (A) Disseksjonstrinnene beskrevet i protokollen er beskrevet her. I (1) visualiseres tarmen av ormen av GFP-fluorescens. Det primære snittstedet kan fordeles jevnt mellom ormene for å sikre jevn dekning over tarmens hele lengde. Alternativt kan enten "a" eller "b" primære snittsteder velges for å oppnå et anterior-mid eller mid-posterior intestinal fragmentspesifikt preparat. I (2) har tarmen ekstrudert, og tar på seg en løkkeform. I (3) blir tarmen først kuttet bort fra ormekroppen mens den forsøker å frigjøre den fra og gonad. Tarmen fjernes deretter fra gjenværende eller gonad som ikke kan fjernes. I (4) er en renset del av tarmen isolert og klar til lagring. (B) Et kritisk skritt er å løsne eventuelle klamrende rusk (dvs. gonad,) fra tarmen ved å føre det inn og ut av mikrokapillærpipetten som er formet på enden av munnaspiratoren. Skala barer = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representative resultater av hånddisseksjonstrinn. Et representativt bilde som viser (A) ekstrudering av tarmen fra ormen. Disse er ormer av CL2122-genotypen, som uttrykker GFP under tarmcellespesifikk mtl-2-promotor . To representative bilder viser (B) en rengjort og fullstendig isolert del av tarmen og (C) en isolert tarm med forurensende gonad- og kadavervev. Skala barer = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Representative resultater av total RNA-ekstraksjon fra isolerte tarmer . (A) Et representativt bilde av RNA-preparater løst ved agarosegelelektroforese er vist, som karakteriserer kvaliteten (RINs, RNA-integritet antall) og mengde isolerte totale RNAer. (B) En representativ gel av totalt RNA isolert fra tarmceller høstet fra L1-trinns ormer via fluorescensaktivert cellesortering (FACS) er vist for sammenligning. Ved 20 celler per tarm kan det utledes at hånddisseksjonsmetoden gir mer totalt RNA per tarm enn FACS-rensede tarmceller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Representative resultater for total mikrobiell DNA-ekstraksjon fra isolerte tarmer. Et kommersielt mikrobielt DNA-isolasjonssett genererte DNA-preparater fra tarmer, hele ormer og kontroller. En panbakteriell genanalyse ble brukt til å kvantifisere antall bakterier i prøvene. Et representativt bilde av (A) qPCR-forsterkningskurvene som genereres, (B) E. coli OP50-standardkurven som brukes til å kvantifisere prøvene, og (C) prøvene vises. I (B) er loggstartkonsentrasjonene av E. coli-standarder grafert mot deres C T-verdier. I (C) ble to replikasjoner (reps) av 40 hele ormer kuttet medialt, og 40 isolerte tarmseksjoner ble behandlet for mikrobiell gDNA-isolasjon. No-Template-Control (NTC) fra qPCR-kjøringen vises også. Y-aksen representerer eksempel på CT-verdier. Mengden DNA kvantifisert fra PCR vises som totale pikogrammer (pg) verdier over prøvelinjene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Sammensetninger av buffere og løsninger brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Denne artikkelen beskriver trinn-for-trinn-protokollen for hånddissekering av tarmene fra voksne C. elegans, som genererer rene preparater for nedstrøms analyser. Kritiske trinn i denne protokollen inkluderer (1) å sikre ikke å lamme ormene, (2) å gjøre nøyaktige disseksjonskutt, (3) smi mikropipetter av passende størrelse for disseksjon, og (4) sikre rask gjenoppretting av sunne tarmer under den endelige høsten. Av disse grunner må det utvises forsiktighet når ormer utsettes for levamisoloppløsningen, og hypodermiske nåler må oppdateres ofte for å sikre maksimal skarphet. Håndtering av tarmen ved hjelp av mikrokapillærpipetten og munnaspiratoren er et annet skritt som vil ta praksis. Riktig smidde mikropipetter av passende størrelse gjør også en betydelig forskjell i å isolere store deler av tarmen under disseksjoner, i tillegg til å redusere risikoen for å miste tarmene i mikropipetten. Nye protokollbrukere mister vanligvis tarmene på den indre kanten av mikrokapillærpipetten før de kan kastes ut i isolasjonsreagenset. Dette problemet kan endres med praksis og riktig smidde mikrokapillære pipetter.

Protokollen beskrevet her ble designet for bruk i voksne ormer. Foreløpige forsøk støtter at denne protokollen også er effektiv for bruk i L4 ormer og eldre voksne ormer. Effekten av denne protokollen er imidlertid ennå ikke evaluert i ormer i tidlig larvestadium. En begrensning av denne tilnærmingen er den lille mengden materiale det gir. Selv om mengdene er tilstrekkelige for RNA-seq og PCR, kan de ikke være tilstrekkelige for andre analyser. Som sådan må brukerne avgjøre om minimumskravet for en analyse kan samles inn med denne protokollen.

Vårt laboratorium bruker rutinemessig FACS for å rense tarmceller etter isolasjon 30, post-hoc analysemetoder for tarmcelleidentifikasjon, og denne hånddisseksjonsmetoden30,42. Hånddisseksjon har fordelen av å være mottagelig for bruk i voksne ormer når ormdisaggregering og celleisolasjon er mindre vellykket. Videre er effektiviteten og kvaliteten på totalt RNA ekstrahert fra hånddisseksjonspreparater høy, sannsynligvis fordi vevet raskt plukkes fra ormene og deretter raskt avsettes i et nukleinsyreisolasjonsreagens, noe som reduserer RNA-nedbrytning. En annen fordel med hånddisseksjonsmetoden er at den er billig, lett å lære og ikke krever spesialutstyr. Til slutt tillater denne tilnærmingen høsting og isolering av tarmbakterier fra orminnvoller, noe som muliggjør nedstrøms mikrobiomstudier.

Hånddisseksjonsprotokollen beskrevet her for å isolere tarmene fra voksne C. elegans representerer et kraftig verktøy for å studere ulike aspekter av C. elegans biologi . For eksempel, med en ren forberedelse av tarmene, kan forskere undersøke skjæringspunktet mellom immunitet, aldring, metabolisme og mikrobiomet.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi står i gjeld til pionerarbeidet til James McGhee og Barb Goszczynski, som opprinnelig utviklet tarmdisseksjonsmetoden som denne protokollen er tilpasset fra. Vårt arbeid støttes av en MIRA (R35) Award overvåket av National Institute of General Medical Sciences (National Institutes of Health, R35GM124877 til EON) og en NSF-CAREER Award overvåket av NSF MCB Div Of Molecular and Cellular Bioscience (Award # 2143849 til EON).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-420 Nuclease free BSA
CL2122 worm strain CGC (Caenorhabditis Genetics Center) CL2122 dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT.
Calcium Chloride Dihydrate Fisher C79 needed for making Egg Salts
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-108 Nuclease free conical tube needed for solution making.
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-103 Nuclease free conical tube needed for solution making.
Concavity slide (2-well) Electron Microscopy Sciences 71878-08 12-pk of 2-well concavity slides
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Millipore Sigma E3889 needed for making chelation buffer
Fluorescent Dissection Microscope Leica M205 FCA This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Millipore Sigma H4034 needed for making dissection buffer
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 for assesment of total RNA quality and quantity
HostZERO Microbial DNA Kit Zymo Research D4310 Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms
Hypodermic Needle (27G x 1/2") BD Scientific 305109 needed for hand dissection of intestines
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) Millipore Sigma L9756 used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines.
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) BD Scientific 309628 Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger.
Magnesium Chloride Hexahydrate Fisher M33 needed for making Egg Salts
Magnesium Sulfate Hpetahydrate Sigma-Aldrich 230391-500G needed for making M9 buffer
MF-900 Microforge Narishige MF-900 Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research.
1.7 mL Microtubes, Clear Olympus Plastics 22-282 Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage.
Mouth Aspirator Tube Millipore Sigma A5177 Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines.
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay Thermo Fisher A50137 Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR.
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instruments Model P-1000 Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging.
Petri Dish (35 x 10 mm) Genesee Scientific - Olympus Plastics 32-103 Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection.
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9730 Used in the isolation of total RNA
Potassium Chloride Millipore Sigma 529552 needed for making Egg Salts
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P0662-500G needed for making M9 buffer
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen Q33216 Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
Qubit RNA HS Assay Kit Invitrogen Q32852 Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2111 Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol.
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection
Sodium Chloride Fisher S271 needed for making Egg Salts
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S373-500 needed for making M9 buffer
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) Thermo Fisher 72302520 Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting.
4150 TapeStation System Agilent G2992AA Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix Applied Biosystems A52699 master mix used for qPCR
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred.
Worm Pick NA NA Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddel, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. C. elegans II. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  3. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  4. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  5. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  6. Roy, P. J., Stuart, J. M., Lund, J., Kim, S. K. Chromosomal clustering of muscle-expressed genes in Caenorhabditis elegans. Nature. 418 (6901), 975-979 (2002).
  7. Pauli, F., Liu, Y., Kim, Y. A., Chen, P. -J., Kim, S. K. Chromosomal clustering and GATA transcriptional regulation of intestine-expressed genes in C. elegans. Development. 133 (2), 287-295 (2005).
  8. Spencer, W. C., et al. A spatial and temporal map of C. elegans gene expression. Genome Research. 21 (2), 325-341 (2011).
  9. Spencer, W. C., et al. Isolation of specific neurons from C. elegans larvae for gene expression profiling. PLoS One. 9 (11), 112102 (2014).
  10. Ma, X., et al. Analysis of C. elegans muscle transcriptome using trans-splicing-based RNA tagging (SRT). Nucleic Acids Research. 44 (21), 156 (2016).
  11. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 4 (2015).
  12. Blazie, S. M., et al. Alternative polyadenylation directs tissue-specific miRNA targeting in Caenorhabditis elegans somatic tissues. Genetics. 206 (2), 757-774 (2017).
  13. Gómez-Saldivar, G., et al. et al.Tissue-specific transcription footprinting using RNA PoI DamID (RAPID) in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (4), 931-945 (2020).
  14. Katsanos, D., Barkoulas, M. Targeted DamID in C. elegans reveals a direct role for LIN-22 and NHR-25 in antagonizing the epidermal stem cell fate. Science Advances. 8 (5), 3141 (2022).
  15. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529 (7584), 92-96 (2015).
  16. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
  17. Mathies, L. D., et al. mRNA profiling reveals significant transcriptional differences between a multipotent progenitor and its differentiated sister. BMC Genomics. 20 (1), 427 (2019).
  18. Liang, X., Calovich-Benne, C., Norris, A. Sensory neuron transcriptomes reveal complex neuron-specific function and regulation of mec-2/ Stomatin splicing. Nucleic Acids Research. 50 (5), 2401-2416 (2021).
  19. Glenwinkel, L., et al. In silico analysis of the transcriptional regulatory logic of neuronal identity specification throughout the C. elegans nervous system. eLife. 10, 64906 (2021).
  20. Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  21. Charest, J., et al. Combinatorial action of temporally segregated transcription factors. Developmental Cell. 55 (4), 483-499 (2020).
  22. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Research. 22 (4), 766-777 (2012).
  23. Tintori, S. C., Nishimura, E. O., Golden, P., Lieb, J. D., Goldstein, B. A transcriptional lineage of the early C. embryo. Developmental Cell. 38 (4), 430-444 (2016).
  24. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  25. Hashimshony, T., Feder, M., Levin, M., Hall, B. K., Yanai, I. Spatiotemporal transcriptomics reveals the evolutionary history of the endoderm germ layer. Nature. 519 (7542), 219-222 (2015).
  26. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
  27. Warner, A. D., Gevirtzman, L., Hillier, L. W., Ewing, B., Waterston, R. H. The C. elegans embryonic transcriptome with tissue, time, and alternative splicing resolution. Genome Research. 29 (6), 1036-1045 (2019).
  28. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  29. Durham, T. J., et al. Comprehensive characterization of tissue-specific chromatin accessibility in L2 Caenorhabditis elegans nematodes. Genome Research. 31 (10), 1952-1969 (2021).
  30. King, D. C., et al. The transcription factor ELT-2 positively and negatively impacts direct target genes to modulate the Caenorhabditis elegans intestinal transcriptome. bioRxiv. , (2021).
  31. Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle analysis in the C. elegans germline with the thymidine analog EdU. Journal of Visualized Experiments. (140), e58339 (2018).
  32. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  33. Edgar, L. G., Wolf, N., Wood, W. B. Early transcription in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 120 (2), 443-451 (1994).
  34. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and manipulation of embryonic cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  35. Nishimura, E. O., Zhang, J. C., Werts, A. D., Goldstein, B., Lieb, J. D. Asymmetric transcript discovery by RNA-seq in C. elegans blastomeres identifies neg-1, a gene important for anterior morphogenesis. PLoS Genetics. 11 (4), 1005117 (2015).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  38. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).
  39. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook – Introduction to C. elegans Anatomy. WormAtlas. , (2006).
  40. Tan, M. -W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 715-720 (1999).
  41. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument Company. , Novato, CA. https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2018).
  42. Dineen, A., Nishimura, E. O., Goszczynski, B., Rothman, J. H., McGhee, J. D. Quantitating transcription factor redundancy: The relative roles of the ELT-2 and ELT-7 GATA factors in the C. elegans endoderm. Developmental Biology. 435 (2), 150-161 (2018).

Tags

Biologi utgave 187 C. elegans tarm hånddisseksjon mtl-2 mikrobiom transkriptomikk
Hånd Disseksjon av <em>Caenorhabditis elegans</em> tarmene
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. … More

Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. T. P., Osborne Nishimura, E. Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (187), e64120, doi:10.3791/64120 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter