Summary
환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 농도는 주로 바이러스의 식별 및 정량화를 위해 수행되는 어려운 작업입니다. 여러 바이러스 농축 방법이 개발되고 테스트되었지만, 여기서는 다양한 샘플 유형을 가진 RNA 바이러스에 대한 한외여과 및 탈지유 응집의 효과를 입증합니다.
Abstract
물 및 폐수 기반 역학은 지역 사회의 발병 과정을 모니터링하고 예측하는 대체 방법으로 부상했습니다. 폐수 및 환경 용수 샘플에서 바이러스, 박테리아 및 미세진핵생물을 포함한 미생물 분획을 회수하는 것은 이러한 접근 방식에서 어려운 단계 중 하나입니다. 본 연구에서는 Armored RNA를 테스트 바이러스로 사용하는 순차적 한외여과 및 탈지유 응집(SMF) 방법의 회수 효율에 초점을 맞췄으며, 이는 일부 다른 연구에서도 대조군으로 사용됩니다. 0.45μm 및 0.2μm 멤브레인 디스크 필터를 사용한 사전 여과를 적용하여 한외여과 장치의 막힘을 방지하기 위해 한외여과 전에 고체 입자를 제거했습니다. 순차적 한외여과 방법으로 처리된 테스트 샘플을 두 가지 다른 속도로 원심분리했습니다. 속도가 증가하면 Armored RNA의 회복률과 양성률이 낮아졌습니다. 반면에 SMF는 Armored RNA의 비교적 일관된 회복률과 양성률을 보였습니다. 환경 용수 샘플로 수행된 추가 테스트는 다른 미생물 분획을 농축하기 위한 SMF의 유용성을 입증했습니다. 바이러스를 고체 입자로 분할하는 것은 폐수 샘플의 한외여과 전에 적용된 사전 여과 단계를 고려할 때 전체 회수율에 영향을 미칠 수 있습니다. 사전 여과 기능이 있는 SMF는 샘플의 고체 농도가 낮고 따라서 고체에 대한 분배 속도가 낮기 때문에 환경 용수 샘플에 적용할 때 더 나은 성능을 보였습니다. 본 연구에서는 코로나19 팬데믹 기간 동안 일반적으로 사용되는 한외여과 장치의 공급이 제한되어 바이러스 농축액의 최종 부피를 줄여야 할 필요성에서 순차적 한외여과법을 사용한다는 아이디어가 생겨났고, 대체 바이러스 농축법의 개발이 필요했습니다.
Introduction
미생물 군집 분석 및 역학 연구를 위한 지표 및 폐수 샘플에서 미생물의 유효 농도를 결정하는 것은 군집 1,2에서 발병 과정을 모니터링하고 예측하기 위한 중요한 단계 중 하나입니다. COVID-19 대유행은 집중력 개선의 중요성을 전개했습니다. COVID-19는 2019년 말에 등장했으며 2023년 3월 현재 여전히 인간의 건강, 사회 생활 및 경제에 위협이 되고 있습니다. COVID-19의 새로운 유행과 변종이 바이러스의 급속한 전파 및 확산과 더불어 출현하고 보고되지 않고 진단되지 않은 무증상 사례가 발생함에 따라 지역사회에서 COVID-19 발병의 영향을 완화하기 위한 효과적인 감시 및 통제 전략이 중요한 연구 주제가 되었습니다 3,4,5. 시민 사회 단체, 정부 기관 및 공공 또는 민간 유틸리티에서 COVID-19에 대한 폐수 기반 역학을 사용하는 것은 신속한 발병 관련 정보를 제공하고 COVID-19 발병의 영향을 완화하는 데 도움이 되었습니다 6,7,8,9. 그러나 폐수 샘플에서 외피 RNA 바이러스인 SARS-CoV-2의 농도는 여전히 문제를 제기합니다10. 예를 들어, 이러한 문제 중 하나는 폐수 고형물에서 SARS-CoV-2를 분할하는 것인데, 이는 농도11 동안 고형물이 제거될 때 회수에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 경우 정량화/평가의 초점은 수성상만이 아닌 환경 용수 샘플의 고체상과 수성상 모두에 있어야 합니다. 또한 농축 방법의 선택은 다운스트림 테스트 및 분석을 기반으로 수정할 수 있습니다. 환경 샘플에서 바이러스 입자와 병원체의 농도는 시퀀싱 및 마이크로바이옴 분야의 발전과 함께 시급한 연구 주제가 되었습니다.
환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 농축 분야에서 다양한 바이러스 농축 방법이 적용되었습니다. 일반적으로 사용되는 몇 가지 방법은 여과, 탈지유 응집(SMF), 흡착/용출 및 폴리에틸렌 글리콜 침전12-17입니다. 그 중 SMF는 저렴하고 효과적인 방법으로 간주되어 폐수 및 지표수12,15,16,18에서 SARS-CoV-2를 포함한 바이러스를 성공적으로 테스트 및 회수하는 데 적용되었습니다. SMF 절차는 슬러지, 미처리 하수, 폐수 및 폐수 샘플과 같은 모든 유형의 물 샘플에서 바이러스, 박테리아 및 원생동물과 같은 광범위한 미생물을 동시에 회수하는 적절한 방법론으로 많은 환경 연구에서 인정을 받고 있는 비교적 새로운 접근 방식입니다19. 한외여과 및 글리신-알칼리 용출, 동결건조 기반 접근법 또는 초원심분리 및 글리신-알칼리 용출과 같은 환경 시료에서 바이러스를 회수하는 다른 알려진 방법론과 비교할 때, SMF는 더 높은 바이러스 회수율과 검출률을 가진 가장 효율적인 방법으로 보고되었다18,20. 본 연구에서는 SARS-CoV-2 회수 평가를 위한 테스트를 포함하여 바이러스 농축 방법의 회수 효율을 평가하기 위해 Armored RNA를 테스트 바이러스로 사용했습니다21,22.
여기에서 우리는 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR), 서열 기반 메타유전체학 및 심부 앰플리콘 시퀀싱을 위한 미생물 분획을 농축하기 위한 SMF 및 순차적 한외여과 방법의 유용성을 입증하기 위해 폐수 및 환경 용수 샘플을 테스트했습니다. SMF는 상대적으로 저렴한 방법이며 한외여과 방법에 비해 더 많은 양의 시료에 최적입니다. 순차적 한외여과법을 사용한다는 아이디어는 코로나19 팬데믹 기간 동안 일반적으로 사용되는 한외여과 장치의 공급이 제한되어 바이러스 농축액의 최종 부피를 줄여야 할 필요성에서 비롯되었으며, 대체 바이러스 농축 방법의 개발이 필요했습니다.
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Protocol
1. 폐수 샘플에서 바이러스를 농축하기 위한 연속 한외여과 및 탈지유 응집의 비교
- 시료 전처리
- 2L의 24시간 유량 비례 복합 원료(유입수) 폐수 샘플을 수집합니다. 샘플은 2020년 여름과 가을에 캐나다 위니펙에 있는 3개의 주요 폐수 처리장(WWTP)에서 수집되었습니다(표 1).
- 샘플을 아이스박스에 담아 차광병에 담아 실험실로 운반하고 24시간 이내에 처리합니다. 폐수 물리화학적, 생물학적 특성 데이터를 수집합니다.
- 바이러스 농도 분석
참고: Armored RNA를 테스트 바이러스로 사용하여 각 방법의 총 회수 효율을 평가하기 위해 순차적 한외여과법과 유기응집법, 즉 탈지유 응집법(SMF)을 적용했습니다23. 다른 연구자들은 또한 패밀리와 같은 외피 바이러스에 대한 농축 방법의 회복을 평가하기 위해 Armored RNA를 대조 바이러스로 사용했습니다 Coronaviridae22,24,25,26.- Armored RNA를 추가하려면 한외여과 및 SMF 방법에 대한 폐수 테스트 용량을 각각 140mL 및 500mL로 설정합니다. 피펫터를 사용하여 각 한외여과 방법에 대해 한 날짜에 수집된 6개의 신선한 폐수 샘플과 다른 날짜에 수집된 6개의 신선한 폐수 샘플에 Armored RNA의 5 x 104개 사본을 스파이크합니다. 또한, 스파이크 6은 세 번째, 이후 날짜에 수집된 (4°C에서) 폐수 샘플을 저장하고, SMF를 위해 며칠 후에 처리하였다.
참고: 서로 다른 날짜에 수집된 6개의 샘플 세트 각각은 3개의 WWTP 각각에서 2개의 샘플로 구성되었습니다. 본 연구에서는 2020 년 7 월 8 일에 첫 번째 신선한 폐수 샘플을 수집하고, 2020 년 9 월 30 일에 두 번째 폐수 샘플을 수집했으며, 2020 년 10 월 14 일에 SMF를 위해 저장할 폐수 샘플을 수집했습니다. - 4°C에서 30분 동안 교반하여 자기 교반기를 사용하여 샘플에 Armored RNA를 접종하고 균질화합니다.
- 0.2μm보다 큰 모든 입자 또는 세포를 제거하고 한외여과를 수행합니다.
- 스파이크 폐수 샘플(각 140mL 스파이크 샘플에서 120mL)을 각각 무명천 및 저단백질 결합, 0.45μm 및 0.2μm, 47mm 멤브레인 디스크 필터를 통해 여과하여 큰 입자, 퇴적물, 진핵생물 및 박테리아27. 후술하는 한외여과 방법을 사용하여 여과된 샘플을 처리한다.
참고: 7월 8일과 9월 30일에 수집된 폐수 샘플은 각각 3,000 x g 및 7,500 x g의 한외여과 방법에 사용되었습니다. - 3,000 x g (UF-3k x g)에서 순차적 한외 여과의 경우, 브랜드 A 원심 분리 장치, 30-kDa를 사용하여 샘플 60 mL를 약 5 mL에 두 번 로딩 하여 3,000 x g에서 30 분 동안 첫 번째 날짜에 수집 된 총 120 mL의 테스트 샘플을 농축합니다. 그런 다음 브랜드 B 원심 장치 30kDa를 사용하여 30분 동안 3,000 x g에서 5mL 부피를 500-1,200μL로 농축합니다.
- 7,500 x g (UF-7.5k x g)에서 순차적 한외여과의 경우, 제조사의 권장 사항에 따라 브랜드 B 원심분리 장치의 원심분리 속도를 3,000 x g에서 7,500 x g로 변경하여 더 작은 최종 부피를 얻고, 브랜드 A 원심분리 장치의 원심분리 속도를 동일하게 유지합니다.
참고 : 테스트는 9 월 30일에 수집 된 샘플로 실행되었습니다.
- 스파이크 폐수 샘플(각 140mL 스파이크 샘플에서 120mL)을 각각 무명천 및 저단백질 결합, 0.45μm 및 0.2μm, 47mm 멤브레인 디스크 필터를 통해 여과하여 큰 입자, 퇴적물, 진핵생물 및 박테리아27. 후술하는 한외여과 방법을 사용하여 여과된 샘플을 처리한다.
- SMF의 경우 아래에 설명된 단계를 수행합니다.
- 폐수 샘플(각각 500mL)을 스파이크하여 아래에 설명된 대로 무명천 및 저단백질 결합 멤브레인 디스크 필터로 사전 여과하지 않고 SMF 프로토콜16,18을 사용하여 직접 농축합니다.
- 탈지분유 0.5g을 합성 해수 50mL에 녹여 1%(w/v) 탈지유 용액을 얻고 1N HCl을 사용하여 용액의 pH를 3.5로 조심스럽게 조정합니다.
알림: 산성화는 등전점(16 )의 변화로 인해 바이러스가 응집되고 물 밖으로 침전되고 분유(28)의 용해도를 향상시킵니다. - 5mL의 탈지유 용액을 500mL의 원료 폐수 샘플에 추가하여 0.01%(w/v)의 탈지유의 최종 농도를 얻습니다.
- 샘플을 중간 속도로 8시간 동안 저어주고 형성된 플록이 실온에서 8시간 동안 더 침전되도록 합니다.
- 침전된 플록을 방해하지 않고 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 플록을 함유하는 50mL의 최종 부피를 원심분리 튜브로 옮기고 8°C에서 30분 동안 8,000 x g 로 원심분리합니다.
- 멸균된 주걱을 사용하여 펠릿을 조심스럽게 스크랩하고 상층액을 제거한 후 250μL의 0.2M 인산나트륨 완충액(pH 7.5)에 튜브에 남아 있는 펠릿을 다시 현탁합니다. 긁어내고 재현탁한 펠릿을 동일한 1.5mL 미니 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- Armored RNA를 추가하려면 한외여과 및 SMF 방법에 대한 폐수 테스트 용량을 각각 140mL 및 500mL로 설정합니다. 피펫터를 사용하여 각 한외여과 방법에 대해 한 날짜에 수집된 6개의 신선한 폐수 샘플과 다른 날짜에 수집된 6개의 신선한 폐수 샘플에 Armored RNA의 5 x 104개 사본을 스파이크합니다. 또한, 스파이크 6은 세 번째, 이후 날짜에 수집된 (4°C에서) 폐수 샘플을 저장하고, SMF를 위해 며칠 후에 처리하였다.
- 제조업체의 지침에 따라 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 및 β-메르캅토에탄올의 비율이 25:24:1인 RNA 추출 키트를 사용하여 폐수 샘플의 바이러스 농축액에서 바이러스 RNA 추출 및 회수 효율 분석을 수행하여 추출 효율을 향상시킵니다. 마지막으로 50μL의 용출 완충액에서 RNA를 용출합니다.
- 실시간 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석
- 합성 단일 가닥 DNA 또는 gBlock 구조체의 10배 희석액(7.8 x 10,4 - 7.8 유전자 사본)을 사용하여 Armored RNA를 정량화합니다. Armored RNA를 검출하고 정량화하는 프라이머 및 프로브 세트에 대해서는 표 2 를 참조하십시오.
- 프라이머 설계 도구29 를 사용하여 프라이머 및 프로브 세트를 설계하고 Armored RNA 게놈 내의 95bp 영역(gBlock 구조)을 표적으로 합니다.
- 각 RT-qPCR 실행에 대한 보정 곡선을 얻습니다. 각 qPCR 실행에 음성 대조군을 포함합니다. 표준, 샘플 및 템플릿이 아닌 컨트롤을 세 번 실행합니다.
- 각 10μL RT-qPCR 혼합물을 다음 순서로 준비합니다: 2.5μL의 4x 마스터 믹스, 400nM의 각 프라이머, 200nM 프로브 및 2.5μL의 주형, 초순수 DNAse/RNAse가 없는 증류수.
- Real-Time PCR 시스템에서 50°C에서 5분 동안 열 순환 반응을 수행한 후 95°C에서 10초 동안, 60°C에서 30초 동안 45회 사이클을 수행합니다. CT가 <40이면 샘플 Armored RNA 양성을 고려하십시오.
- 소혈청알부민을 하수검체와 함께 사용하여 qPCR 및 RT-qPCR 검사를 실시하여 휴믹산과 같은 억제제 또는 오염 물질의 가능성을 평가한다24. 효소가 있는 샘플과 없는 샘플 간에 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다.
- 표준 곡선에서 농도를 계산합니다. 회수 효율 백분율을 계산하여 회수된 농도를 스파이크 농도로 나눕니다.
- 분석을 위해 log10 함수를 사용하여 유전자 복제 수를 변환합니다. qPCR 데이터에 대한 통계 분석 도구를 사용하여 일반 선형 모델을 실행합니다. Tukey의 테스트를 적용하여 방법과 치료법 간의 차이를 감지합니다. p-값 0.05를 검정의 최소 유의 수준으로 간주합니다.
2. 수성 역학을 위한 DNA 및 RNA 바이러스의 여과 및 농축
- 환경 지표수 수집을 위해 10L의 환경 지표수 샘플을 수집하고 배경 제어를 위해 10L의 탈이온수 샘플을 사용합니다. 모든 샘플을 4°C 실내에 보관하여 샘플 수집 후 24시간 이내에 처리할 때까지 처리합니다.
- 아래 설명된 단계를 사용하여 SMF를 사용하여 환경 샘플에서 바이러스 농도를 수행합니다.
- 고용량 지하수 샘플링 캡슐과 0.45 μm, 0.2 μm, 0.1 μm 크기의 멤브레인 디스크 필터를 사용하여 캡슐 및 진공 여과를 수행하여 미세 진핵생물 및 박테리아와 같은 더 큰 분획에서 바이러스와 같은 더 작은 분획에 이르기까지 메타게놈 염기서열 분석 중 노이즈를 최소화합니다.
- 탈지유 13.2g과 함께 합성 해수 1.32L에 중량 1% 사전 응집 탈지유 용액을 준비합니다. 1N HCl을 사용하여 이 현탁액의 pH를 3.5로 조정합니다.
- 1N HCl을 사용하여 환경 지표수 샘플의 pH를 3.5로 조정합니다.
- 사전 응집된 산성화된 탈지유 용액 100mL를 10L 산성화된(pH 3.5) 환경 용수 샘플(최종 탈지유 농도 0.01%[w/v])에 옮깁니다.
- 마그네틱 교반기 및 마그네틱 교반 막대를 사용하여 실온에서 8시간 동안 샘플을 저어주고 플록이 추가로 8시간 동안 중력에 의해 침전되도록 합니다. 플록을 방해하지 않고 진공 펌프를 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
- 50mL 원심분리기 튜브에서 나머지 플록을 무게에 따라 분취하고 균형을 맞추고 4°C에서 30분 동안 8,000 x g 로 회전시킵니다.
- 상층액을 버리고 생성된 펠릿(이론적으로 관심 있는 바이러스 포함)을 200μL의 0.2M 인산나트륨 완충액에 용해시킵니다.
- 용해된 펠릿을 제조업체의 지침에 따라 DNase I 및 RNase A로 처리하여 핵산 추출에 사용되는 키트로 인해 공동 침전될 수 있는 유리 DNA 및 RNA를 제거합니다. 제조업체의 지침에 따라 DNase I 및 RNase A를 비활성화합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 DNA/RNA 추출 키트를 사용하여 용해된 펠릿에서 총 핵산을 추출합니다.
- 형광측정기를 사용하여 폐수 샘플에서 추출된 DNA와 RNA의 총량을 정량화합니다. 농도가 >1ng/μL인 샘플은 DNA 정량 분석 및 염기서열 분석에 최적인 것으로 간주됩니다.
- 관심 장내 바이러스를 표적으로 하는 qPCR 분석과 바이러스 군집 구조를 식별하기 위한 고처리량 염기서열 분석을 수행합니다.
3. 수성 역학을 위한 미생물 분획의 직접 침전 및 농도
- 보호되고 영향을 받는 수로에서 2L의 물 샘플을 수집합니다. 샘플에 상당한 양의 파편이 포함되어 있으면 무명천을 사용하여 제거하십시오.
참고: 샘플당 생물학적 복제본을 수집하는 것이 좋습니다. - 합성 해수 1mL에 탈지분유 4.4g을 녹여 440%(w/v) 탈지유 용액을 준비합니다. 이 현탁액의 pH를 1N HCl로 3.5로 조정합니다.
- 1N HCl을 사용하여 담수 샘플의 pH를 3.5로 조정합니다.
- 이전에 pH가 조정된 2L 담수 샘플에 탈지유 용액 20mL를 추가합니다(최종 탈지유 농도 0.01%[w/v]). 샘플을 실온에서 8시간 동안 저어줍니다.
- 플록이 중력에 의해 8시간 더 침전되도록 합니다. 연동 펌프로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 침전된 플록을 50mL 원심분리기 튜브로 옮기고 8,000 x g 에서 30분 동안 회전시킵니다.
- 상청액을 버리고 펠릿을 200μL의 0.2M 인산나트륨 완충액으로 재현탁합니다. 샘플을 -20°C에서 보관하거나 제조업체의 지침에 따라 선택한 핵산 분리 키트를 사용하여 미생물 DNA 추출을 위해 ~0.5g의 플록을 선택합니다.
- 고감도 형광측정기로 DNA 핵산 농도와 순도를 측정합니다. 농도가 >1ng/μL인 샘플은 DNA 정량 분석 및 염기서열 분석에 최적이어야 합니다.
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Representative Results
바이러스 RNA 농축 방법의 평가
UF-3k x g로 처리 된 6 개의 샘플 모두 양성이었고 13.38 % ± 8.14 %의 회수율을 보였다 (그림 1). 샘플을 UF-7.5k x g로 처리했을 때 단 하나의 샘플만 양성이었습니다. SMF로 처리된 모든 샘플은 양성이었고 15.27% ± 2.65%의 회수율을 보였습니다(그림 1). UF-3K x g 및 SMF의 평균 회수율은 UF-7.5K x g보다 유의하고 일관되게 (p < 0.0001) 높았다. 반면, UF-3K x g와 SMF의 회수율 사이에는 유의한 차이(p=0.6240)가 없었다. 브랜드 B 원심분리 장치의 원심분리 속도를 3,000 x g에서 7,500 x g로 증가시키면 회수율이 낮아졌는데, 이는 아마도 증가된 속도로 필터를 통과하는 Armored RNA와 증가된 원심 속도로 필터에 Armored RNA 입자가 결합하기 때문일 것입니다. 한외여과 방법으로 고체 입자를 제거하는 것은 폐수 고형물에 대한 Armored RNA의 잠재적인 분할을 고려할 때 SMF에 대한 한외여과 방법의 낮은 회수율을 설명할 수 있습니다(30). 또한, 물리화학적 및 생물학적 폐수 파라미터(메타데이터)는 표 1에 요약되어 있다. 지표수로 SMF를 테스트한 결과(2단계) 42.7% ± 15.1%의 더 높은 회수율이 나타났으며, 이는 바이러스를 고체 입자로 분할하는 것이 지표수의 낮은 고체 농도를 고려할 때 회수율에 상당한 영향을 미쳤을 수 있음을 나타냅니다.
바이러스의 연속 여과 및 농축
표 3은 3계절에 걸쳐 위니펙 내에서 수집된 환경 수질 샘플에서 추출한 수질 매개변수와 핵산을 요약한 것입니다. DNA는 모든 샘플링 위치와 계절에 따라 정량화할 수 있었습니다. 보충도 1 은 환경 지표수 위치를 갖는 지도를 나타낸다. 반면에, RNA 값은 형광계(<0.025ng/μL)를 사용한 검출 한계 미만이었습니다. 이러한 RNA 추출물은 고처리량 시퀀싱을 위해 정량화 가능한 cDNA를 생성하기 위해 무작위로 증폭되었습니다(표 3).
환경 용수 시료의 미생물 분획 농도
그림 2와 그림 3은 환경 지표수 샘플의 미생물 분획 농도 및 방법론에 대한 워크플로우를 보여줍니다. 표 4는 본 연구에서 분석된 보호된(숲) 및 영향을 받는(도시 및 농업) 수로의 샘플링 장소의 평균 DNA 농도, 표준 편차 및 pH, 온도, 용존 산소, 대기압, 강수량 및 일광 시간과 같은 환경 조건을 포함합니다. 샘플은 2022년 4월부터 2022년 10월까지 캐나다 매니토바의 아시니보인 강을 따라 포티지 라 프레리 시를 둘러싼 도시 및 농촌 지역에서 매월 수집되었습니다. 가장 높은 DNA 농도는 숲이 우거진 지역 1에서 관찰되었으며 109.35-229.18 ng/μL를 산출했습니다. 한편, 가장 낮은 미생물 DNA 농도는 농경지 3에서 회수되었으며 평균 농도는 19.83-22.05 ng/μL였다. 2022년 4월부터 10월까지 수집된 모든 샘플의 평균 DNA 농도, 표준 편차 및 메타데이터는 표 4에 요약되어 있습니다. 얻어진 DNA 농도는 PCR, qPCR 및 시퀀싱을 포함하는 다른 다운스트림 애플리케이션에 최적이었습니다(데이터는 표시되지 않음).
그림 1: 폐수 샘플에 대한 각 분석법에 대한 회수율 및 통계 분석. 약어: SMF = 탈지유 응집; UF-3K x g = 3,000 x g에서의 한외여과; UF-7.5K x g = 7,500 x g에서 한외여과. 별표(*)가 있는 평균은 처리 전반에 걸쳐 0.05 수준에서 유의한 차이를 나타냅니다. n = 6입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 폐수 유출물을 받는 매니토바의 도시 수역에서 바이러스를 농축하고 정량화하는 데 사용되는 방법론의 개략도. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DNA 정량화 및 염기서열 분석을 위한 바이러스, 박테리아 및 미세진핵생물의 농도에 대한 그래픽 요약. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1 : 11 개의 환경 용수 샘플의 위치. 샘플은 매니토바 주 위니펙의 레드 강과 아시니보인 강을 따라 수집되었으며, 빨간색 점으로 표시되었습니다. 위니펙의 3 대 하수 처리장은 샘플링 이벤트가 발생하지 않았음에도 불구하고 방문한 사이트 중 하나로 파란색으로 표시됩니다. 데이터 소스는 Google 지도와 Tableau 소프트웨어입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 유입수 샘플의 수질 매개변수 NESTP, SESTP 및 WESTP. 약어: NESTP = North End Sewage Treatment Plant; SESTP = 남쪽 끝 하수 처리장; WESTP = 웨스트 엔드 하수 처리장; MLD = 하루 백만 리터; TS = 총 고형물; TSS = 총 부유 물질; BOD5 = 5일 생화학적 산소 요구량; NH4-N = 암모늄-질소; TP = 총 인; TOC = 총 유기 탄소; TN = 총 질소. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: RT-qPCR 분석의 프라이머/프로브 세트. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 2021년 5월 16일 봄, 8월 27일 여름, 11월 21일 가을의 샘플 수집 중 Red 및 Assiniboine 강 수질 매개변수) 및 총 핵산(DNA 및 RNA)의 형광계 정량화. * RNA 키트의 검출 한계는 0.025ng/μL입니다. ^ 숫자는 범위 값을 나타냅니다. 약어: DO = 용존 산소; BOD5= 5일 생화학적 산소 요구량; TP = 총 인. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: 샘플 수집 중 Assiniboine 강 수질 매개변수(2022년 4월부터 10월까지). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구의 중요한 단계 중 하나는 0.2μm 및 0.45μm 멤브레인 필터로 사전 여과 단계를 적용하여 고체 입자를 제거하는 것입니다. 바이러스를 고체 입자, 특히 외피 바이러스로 분할하는 것을 고려할 때, 사전 여과는 바이러스 회수에 상당한 손실을 초래할 수 있다30. 한외여과 장치의 막힘을 방지하기 위해 환경 및 폐수 시료의 경우 한외여과 방법에 대한 사전 여과 단계가 거의 항상 필요하지만, 다운스트림 분석 유형에 따라 SMF에 대한 사전 여과가 필요할 수 있습니다. 표적 PCR 연구의 경우 사전 여과가 필요하지 않을 수 있습니다. 반면에, 사전 여과는 미세진핵생물 및 박테리아와 같은 더 큰 분획에서 나오는 바이러스체의 배경 소음을 감소시키기 때문에 바이러스 균유전체학을 크게 개선할 수 있습니다. 이 단계는 더 큰 게놈이 바이러스 신호를 떼지 않도록 시퀀싱에 중요합니다.
순차적 한외여과로 처리할 수 있는 시료량은 140mL로 제한됩니다. 이는 바이러스 수가 적은 샘플에 대한 중요한 제한 사항입니다. 반면에 SMF는 훨씬 더 많은 양의 샘플을 처리할 수 있어 바이러스를 복구할 확률이 높아집니다.
SMF의 회수율은 폐수에서 바이러스 입자의 농도에 초점을 맞춘 다른 연구와 일치합니다. 이전에 발표된 논문에서는 다양한 테스트 바이러스에서 유사한 회수율을 보고했습니다. 이 연구에서 보고된 평균 회수율은 3.4%에서 14% 사이였습니다13,31,32. 현재 방법론은 위니펙33의 사례 수와 관련하여 폐수에서 SARS-CoV-2를 조사하는 또 다른 연구의 일부였습니다. 여기에 설명 된 SMF 방법은 우리 실험실에서 매니토바 시골 지역의 산화 석호에서 SARS-CoV-2 RNA를 스크리닝하는 데에도 사용되었습니다. SMF 방법의 유용성은 또한 연속 여과(0.45μm, 0.2μm 및 0.1μm)와 함께 사용되어 우리 실험실에서 고처리량 시퀀싱을 사용하여 도시 환경의 담수 샘플에서 바이러스 군집을 특성화합니다(방법론의 두 번째 섹션에 설명됨). 마지막으로, SMF 방법은 환경 수질 샘플에서 미세진핵생물, 박테리아 및 바이러스와 같은 미생물 군집의 침전을 지시하고 18S rRNA 및 16S rRNA 유전자의 딥 앰플리콘 시퀀싱을 사용하여 추가 특성화에 적용할 수 있습니다. 뿐만 아니라 T4 유사 바이러스(Zambrano 및 Uyaguari-Díaz, 게시되지 않은 데이터). SMF 방법을 사용하면 물 샘플에 존재하는 미생물 분획을 큰 투입량(즉, 10-40L)에서 상대적으로 작은 부피(즉, 1-5mL)로 농축할 수 있습니다. 이 방법론의 일환으로 초순수도 네거티브/백그라운드 컨트롤로 포함됩니다. 미생물 분획이 농축되면 상업용 추출 키트 또는 사내 프로토콜을 사용하여 핵산 추출을 수행할 수 있습니다. SMF는 미생물 분획 또는 바이러스 입자를 농축하기 위한 다재다능하고 비교적 저렴하며 간편하고 손쉬운 방법을 나타내며 한외여과 또는 접선 유동 여과 접근법과 큰 차이가 없습니다.
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Disclosures
저자는 이 논문에 보고된 작업에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적인 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 NSERC Alliance Covid-19 Grant(수상 번호 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan 및 Uyaguari-Díaz). MUD는 대학 연구 보조금 프로그램 (수상 번호 325201)에 감사드립니다. JF와 JZA는 모두 VADA(Visual and Automated Disease Analytics) 대학원 교육 프로그램의 지원을 받습니다. KY와 JF는 모두 Mitacs Accelerate 프로그램에서 펠로우십을 받았습니다. MUD와 그의 실험실 구성원(KY, JF, JZA)은 NSERC-DG(RGPIN-2022-04508) 및 Research Manitoba New Investigator Operating Grant(No 5385)의 지원을 받습니다. 매니토바 주 위니펙 시에 특별한 감사를 드립니다. 이 연구는 매니토바 대학교에서 수행되었습니다. 우리는 매니토바 대학교 캠퍼스가 Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota 및 Dene 민족의 원래 땅과 Métis Nation의 고향에 위치하고 있음을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
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