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Concentração de Partículas de Vírus de Amostras Ambientais de Água e Efluentes Usando Floculação e Ultrafiltração de Leite Desnatado

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65058
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

Summary

A concentração de vírus a partir de amostras ambientais de água e efluentes é uma tarefa desafiadora, realizada principalmente para a identificação e quantificação de vírus. Embora vários métodos de concentração viral tenham sido desenvolvidos e testados, demonstramos aqui a eficácia da ultrafiltração e floculação de leite desnatado para vírus de RNA com diferentes tipos de amostras.

Abstract

A epidemiologia baseada em água e esgoto tem emergido como métodos alternativos para monitorar e prever o curso de surtos em comunidades. A recuperação de frações microbianas, incluindo vírus, bactérias e microeucariotos de amostras de águas residuárias e ambientais é uma das etapas desafiadoras nessas abordagens. Neste estudo, focamos na eficiência de recuperação dos métodos de ultrafiltração sequencial e floculação de leite desnatado (FMS) usando RNA blindado como vírus teste, que também é usado como controle por alguns outros estudos. A pré-filtração com filtros de disco de membrana de 0,45 μm e 0,2 μm foi aplicada para eliminar partículas sólidas antes da ultrafiltração para evitar o entupimento dos dispositivos de ultrafiltração. As amostras-teste, processadas pelo método de ultrafiltração sequencial, foram centrifugadas em duas velocidades diferentes. Uma maior velocidade resultou em menores taxas de recuperação e positividade do RNA blindado. Por outro lado, a FME resultou em taxas de recuperação e positividade relativamente consistentes do RNA blindado. Testes adicionais realizados com amostras de água ambientais demonstraram a utilidade da FME para concentrar outras frações microbianas. A partição de vírus em partículas sólidas pode ter um impacto nas taxas gerais de recuperação, considerando a etapa de pré-filtração aplicada antes da ultrafiltração de amostras de águas residuais. A FME com pré-filtração apresentou melhor desempenho quando aplicada em amostras de água ambientais devido às menores concentrações de sólidos nas amostras e, portanto, menores taxas de partição para sólidos. No presente estudo, a ideia de usar um método de ultrafiltração sequencial surgiu da necessidade de diminuir o volume final dos concentrados virais durante a pandemia de COVID-19, quando o fornecimento dos dispositivos de ultrafiltração comumente usados era limitado, e havia uma necessidade para o desenvolvimento de métodos alternativos de concentração viral.

Introduction

A determinação da concentração efetiva de microrganismos em amostras de águas superficiais e residuárias para análise de comunidades microbianas e estudos epidemiológicos é uma das etapas importantes para monitorar e prever o curso de surtos em comunidades 1,2. A pandemia de COVID-19, desdobrou a importância de melhorar os métodos de concentração. A COVID-19 surgiu no final de 2019 e, em março de 2023, ainda representa uma ameaça à saúde humana, à vida social e à economia. Estratégias eficazes de vigilância e controle para aliviar os impactos dos surtos de COVID-19 nas comunidades tornaram-se um importante tópico de pesquisa, à medida que novas ondas e variantes da COVID-19 têm surgido, além da rápida transmissão e disseminação do vírus, bem como casos assintomáticos não notificados e não diagnosticados 3,4,5. O uso da epidemiologia baseada em águas residuais para COVID-19 por organizações da sociedade civil, agências governamentais e serviços públicos ou privados tem sido útil para fornecer informações rápidas relacionadas a surtos e mitigar os impactos de surtos de COVID-19 6,7,8,9. No entanto, a concentração de SARS-CoV-2, um vírus de RNA envelopado, em amostras de águas residuais ainda apresenta desafios10. Por exemplo, um desses desafios é a partição do SARS-CoV-2 em sólidos de águas residuais, o que pode impactar a recuperação quando os sólidos são eliminados durante a concentração11. Se este for o caso, o foco da quantificação/avaliação deve ser nas fases sólida e aquosa das amostras de água ambiental, e não apenas na fase aquosa. Além disso, a escolha do método de concentração pode ser modificada com base em ensaios e análises a jusante. A concentração de partículas virais e patógenos a partir de amostras ambientais tornou-se um tópico de pesquisa urgente com desenvolvimentos nos campos de sequenciamento e microbioma.

Vários métodos de concentração de vírus têm sido aplicados no campo da concentração de vírus a partir de amostras ambientais de água e efluentes. Alguns métodos comumente utilizados são filtração, floculação de leite desnatado (FMS), adsorção/eluição e precipitação de polietilenoglicol12-17. Dentre eles, o SMF tem sido considerado um método barato e eficaz, testado com sucesso e aplicado na recuperação de vírus, incluindo o SARS-CoV-2, de águas residuárias e superficiais12,15,16,18. O procedimento SMF é uma abordagem relativamente nova que tem ganhado crescente reconhecimento entre muitos estudos ambientais como uma metodologia apropriada para recuperar simultaneamente uma ampla gama de microrganismos, como vírus, bactérias e protozoários, de todos os tipos de amostras de água, a saber, lodo, esgoto bruto, efluentes e amostras de efluentes19. Quando comparada a outras metodologias conhecidas para recuperar vírus de amostras ambientais, como ultrafiltração e eluição glicina-alcalina, abordagem baseada em liofilização ou ultracentrifugação e eluição glicina-alcalina, a FMM tem sido relatada como o método mais eficiente, com maiores taxas de recuperação e detecção viral18,20. No presente estudo, usamos o RNA blindado como um vírus de teste para avaliar a eficiência da recuperação dos métodos de concentração do vírus, incluindo testes para avaliar a recuperação do SARS-CoV-221,22.

Aqui, testamos amostras de águas residuais e ambientais para demonstrar a utilidade da SMF e de um método de ultrafiltração sequencial para concentrar frações microbianas para reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), metagenômica baseada em sequência e sequenciamento de amplicon profundo. O SMF é um método relativamente mais barato e ideal para um volume maior de amostras em comparação com os métodos de ultrafiltração. A ideia de usar um método de ultrafiltração sequencial surgiu da necessidade de diminuir o volume final dos concentrados virais durante a pandemia de COVID-19, quando o fornecimento dos dispositivos de ultrafiltração comumente usados era limitado, e havia a necessidade do desenvolvimento de métodos alternativos de concentração viral.

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Protocol

1. Comparação entre ultrafiltração seriada e floculação de leite desnatado para concentrar vírus em amostras de águas residuárias

  1. Preparo da amostra
    1. Coletar 2 L de amostras de águas residuais compostas (influentes) compostas proporcionais ao fluxo de 24 horas. As amostras foram coletadas nas três principais estações de tratamento de águas residuais (ETEs) em Winnipeg, Canadá, durante o verão e o outono de 2020 (Tabela 1).
    2. Transportar as amostras para o laboratório em frascos à prova de luz em uma caixa de gelo e processá-las dentro de 24 h. Coletar dados de características físico-químicas e biológicas de águas residuárias.
  2. Ensaios de concentração viral
    NOTA: Um método de ultrafiltração sequencial e um método de floculação orgânica, a saber, floculação de leite desnatado (SMF), foram aplicados para avaliar a eficiência de recuperação total de cada método usando RNA blindado como um vírus de teste23. Outros pesquisadores também usaram o RNA blindado como um vírus de controle para avaliar a recuperação de métodos de concentração para vírus envelopados, como a família Coronaviridae22,24,25,26.
    1. Para a adição de RNA blindado, definir os volumes de teste de águas residuais para os métodos de ultrafiltração e SMF como 140 mL e 500 mL, respectivamente. Usando um pipetador, spike 5 x 104 cópias de RNA blindado em seis amostras de águas residuais frescas coletadas em uma data e seis amostras de águas residuais frescas em outra data, para cada método de ultrafiltração; além disso, seis amostras de águas residuais armazenadas (a 4 °C) coletadas em uma terceira data posterior e processadas dias depois para SMF.
      NOTA: Cada um dos seis conjuntos de amostras coletados em datas diferentes foi composto por duas amostras de cada uma das três ETEs. Em nosso estudo, o primeiro conjunto de amostras de águas residuais doces foi coletado em 8 de julho de 2020, o segundo em 30 de setembro de 2020 e as amostras de águas residuais a serem armazenadas para SMF em 14 de outubro de 2020.
    2. Agitar durante 30 minutos a 4 °C para inocular e homogeneizar o ARN blindado nas amostras utilizando um agitador magnético.
    3. Remova todas as partículas ou células maiores que 0,2 μm e realize a ultrafiltração.
      1. Filtrar as amostras de águas residuais fortificadas (120 mL de cada amostra fortificada de 140 mL) através de pano de queijo e filtros de disco de membrana de baixa proteína, 0,45 μm e 0,2 μm, 47 mm, respectivamente, para remover partículas grandes, sedimentos, eucariotos e bactérias27. Processe as amostras filtradas usando os métodos de ultrafiltração descritos abaixo.
        OBS: As amostras de águas residuárias coletadas nos dias 8 de julho e 30 desetembro foram utilizadas paramétodos de ultrafiltração com 3.000 x g e 7.500 x g, respectivamente.
      2. Para ultrafiltração sequencial a 3.000 x g (UF-3k x g), concentrar um total de 120 mL da amostra teste coletada na primeira data a 3.000 x g por 30 min, carregando 60 mL da amostra duas vezes a aproximadamente 5 mL usando um dispositivo centrífugo da marca A, 30 kDa. Em seguida, concentrar o volume de 5 mL a 3.000 x g por 30 min usando um dispositivo centrífugo da marca B, 30 kDa, para 500-1.200 μL.
      3. Para ultrafiltração sequencial a 7.500 x g (UF-7,5k x g), altere a velocidade de centrifugação do dispositivo centrífugo marca B de 3.000 x g para 7.500 x g para obter volumes finais menores, conforme recomendações do fabricante, e mantenha a mesma velocidade de centrifugação do dispositivo centrífugo marca A.
        OBS: Os testes foram realizados com as amostras coletadas nodia 30 de setembro.
    4. Para SMF, execute as etapas descritas abaixo.
    5. Colocar as amostras de efluentes (500 mL cada) para concentrar diretamente usando o protocolo SMF16,18, sem pré-filtração com pano de queijo e filtros de disco de membrana de baixa ligação à proteína, conforme descrito a seguir.
    6. Dissolver 0,5 g de leite em pó desnatado em 50 mL de água do mar sintética para obter uma solução de leite desnatado a 1% (p/v) e ajustar cuidadosamente o pH da solução para 3,5 usando 1 N HCl.
      OBS: A acidificação faz com que os vírus se agreguem e precipitem fora da água devido à mudança em seu ponto isoelétrico16 e melhora a solubilidade do leite em pó28.
    7. Adicionar 5 mL de solução de leite desnatado a 500 mL de amostras de água residuária crua para obter uma concentração final de leite desnatado de 0,01% (p/v).
    8. Agitar as amostras durante 8 h à velocidade média e deixar que os flocos formados se contentem por mais 8 h à temperatura ambiente.
    9. Remova cuidadosamente os sobrenadantes usando pipetas sorológicas sem perturbar os flocos assentados. Transferir um volume final de 50 mL contendo os flocos para tubos de centrífuga e centrifugar a 8.000 x g por 30 min a 8 °C.
    10. Raspar cuidadosamente os pellets usando uma espátula esterilizada e ressuspender os pellets restantes nos tubos em 250 μL de tampão fosfato de sódio 0,2 M (pH 7,5) após a remoção do sobrenadante. Transfira os pellets raspados e ressuspensos para os mesmos tubos de minicentrífuga de 1,5 mL.
  3. Realizar extração de RNA viral de concentrados virais de amostras de águas residuais e ensaios de eficiência de recuperação usando um kit de extração de RNA com uma proporção de 25:24:1 de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico e β-mercaptoetanol, de acordo com as instruções do fabricante, para melhorar a eficiência da extração. Finalmente, eluir o RNA em 50 μL de tampão de eluição.
  4. Análise quantitativa em tempo real da reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR)
    1. Quantificar o RNA blindado usando diluições de dez vezes (7,8 x 10,4 a 7,8 cópias gênicas) de um DNA sintético de fita simples ou construção gBlock. Veja a Tabela 2 para os primers e conjuntos de sondas que detectam e quantificam o RNA Blindado.
    2. Projete conjuntos de primers e sondas usando a ferramenta de projeto de primer29 e tenha como alvo uma região de 95 pb (construção gBlock) dentro do genoma de RNA blindado.
    3. Obter curvas de calibração para cada execução de RT-qPCR. Inclua controles negativos em cada execução do qPCR. Execute padrões, amostras e controles que não sejam de modelo em triplicata.
    4. Preparar cada mistura de 10 μL RT-qPCR na seguinte ordem: 2,5 μL de mistura mestra 4x, 400 nM de cada primer, sonda de 200 nM e 2,5 μL de molde, bem como água destilada livre de DNAse/RNAse ultrapura.
    5. Realizar reações de ciclagem térmica a 50 °C por 5 min, seguidas por 45 ciclos de 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s em um sistema de PCR em tempo real. Se a TC foi <40, considere a amostra de RNA blindado positiva.
    6. Realizar testes de qPCR e RT-qPCR utilizando albumina de soro bovino com amostras brutas de esgoto para avaliar a possibilidade de inibidores ou contaminantes como os ácidoshúmicos 24. Não foram observadas diferenças significativas entre as amostras com e sem a enzima.
  5. Calcule as concentrações a partir da curva padrão. Calcule a porcentagem de eficiência de recuperação dividindo a concentração recuperada pela concentração cravada.
  6. Transforme números de cópias de genes usando a função log10 para análise. Execute um modelo linear geral usando uma ferramenta de análise estatística nos dados do qPCR. Aplicar o teste de Tukey para detectar diferenças entre os métodos e tratamentos. Considere-se um valor de p de 0,05 como um nível mínimo de significância para o teste.

2. Filtração e concentração de vírus de DNA e RNA para epidemiologia baseada em água

  1. Para a coleta de águas superficiais ambientais, colete 10 L de amostras de águas superficiais ambientais e use 10 L de amostras de água deionizada para controle de fundo. Conservar todas as amostras numa sala a 4 °C até ao processamento no prazo de 24 h após a colheita das amostras.
  2. Realizar concentração de vírus de amostras ambientais com SMF utilizando as etapas descritas abaixo.
    1. Realize a filtração de cápsulas e vácuo usando cápsulas de amostragem de água subterrânea de alta capacidade e filtros de disco de membrana de tamanhos de 0,45 μm, 0,2 μm e 0,1 μm para minimizar o ruído durante o sequenciamento metagenômico, de frações maiores, como micro-eucariotos e bactérias, a frações menores, como vírus.
    2. Preparar uma solução de leite desnatado pré-floculado a 1% em peso por volume em 1,32 L de água do mar sintética com 13,2 g de leite em pó desnatado. Ajustar o pH desta suspensão para 3,5 utilizando HCl 1 N.
  3. Ajustar o pH das amostras de águas superficiais ambientais para 3,5 usando HCl 1 N.
  4. Transferir 100 mL da solução de leite desnatado acidificado pré-floculado para 10 L de amostras de água ambiente acidificada (pH 3,5) (concentração final de leite desnatado de 0,01% [p/v]).
  5. Usando um agitador magnético e uma barra de agitação magnética, agite as amostras por 8 h à temperatura ambiente e deixe os flocos sedimentarem por gravidade por mais 8 h. Sem perturbar os flocos, remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma bomba de vácuo.
  6. Aliquot e balanceamento dos flocos restantes de acordo com o peso em tubos de centrífuga de 50 mL e girá-los para baixo a 8.000 x g por 30 min a 4 °C.
  7. Descarte o sobrenadante e dissolva a pelota resultante (que teoricamente contém vírus de interesse) em 200 μL de tampão fosfato de sódio 0,2 M.
  8. Tratar o pellet dissolvido com DNase I e RNase A, seguindo as instruções do fabricante, para eliminar o DNA livre e o RNA presentes que podem ser co-precipitados devido ao kit usado para extração de ácido nucleico. Inative o DNase I e RNase A seguindo as instruções do fabricante.
  9. Extraia ácidos nucleicos totais do pellet dissolvido usando um kit de extração de DNA/RNA, de acordo com as instruções do fabricante.
  10. Quantificar a quantidade total de DNA e RNA extraídos de amostras de efluentes usando um fluorômetro. Amostras com concentrações >1 ng/μL são consideradas ótimas para quantificação e sequenciamento de DNA.
  11. Realizar análise de qPCR para atingir vírus entéricos de interesse e sequenciamento de alto rendimento para identificar a estrutura da comunidade viral.

3. Precipitação direta e concentração de frações microbianas para epidemiologia baseada na água

  1. Coletar 2 L de amostras de água de cursos d'água protegidos e impactados. Se a amostra contiver uma quantidade considerável de detritos, use um pano de queijo para removê-los.
    NOTA: A coleta de uma duplicata biológica por amostra é altamente recomendada.
  2. Preparar uma solução de leite desnatado a 1% (p/v) dissolvendo 4,4 g de leite em pó desnatado em 440 ml de água do mar sintética. Ajustar o pH desta suspensão para 3,5 com HCl 1 N.
  3. Ajustar o pH das amostras de água doce para 3,5 utilizando HCl 1 N.
  4. Adicionar 20 mL de solução de leite desnatado às amostras de água doce de 2 L previamente ajustadas ao pH (concentração final de leite desnatado de 0,01% [p/v]). Agitar as amostras à temperatura ambiente durante 8 h.
  5. Deixe os flocos sedimentarem por gravidade por mais 8 h. Remova cuidadosamente os sobrenadantes com uma bomba peristáltica. Transfira os flocos sedimentados para um tubo centrífugo de 50 mL e gire-os para baixo a 8.000 x g por 30 min.
  6. Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender os pellets com 200 μL de tampão fosfato de sódio 0,2 M. Conservar as amostras a -20 °C ou proceder à selecção de ~ 0,5 g do floco para extracção de ADN microbiano utilizando o kit de isolamento de ácido nucleico de eleição, seguindo as instruções do fabricante.
  7. Determinar a concentração e pureza do ácido nucleico do DNA com um fluorômetro de alta sensibilidade. Amostras com concentrações >1 ng/μL devem ser ideais para quantificação e sequenciamento de DNA.

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Representative Results

Avaliação de métodos de concentração de RNA viral
Todas as seis amostras processadas com UF-3k x g foram positivas e resultaram em 13,38% ± 8,14% de recuperação (Figura 1). Apenas uma amostra foi positiva quando as amostras foram processadas com UF-7,5k x g. Todas as amostras processadas com FML foram positivas e resultaram em recuperação de 15,27% ± 2,65% (Figura 1). As taxas médias de recuperação de UF-3K x g e SMF foram significativa e consistentemente (p < 0,0001) maiores que UF-7,5K x g. Por outro lado, não houve diferença significativa (p = 0,6240) entre as taxas de recuperação de UF-3K x g e SMF. O aumento da velocidade de centrifugação do dispositivo centrífugo marca B de 3.000 x g para 7.500 x g resultou em menor recuperação, provavelmente devido à passagem do RNA blindado pelos filtros a uma taxa aumentada e à ligação das partículas de RNA blindado aos filtros a uma velocidade centrífuga aumentada. A eliminação de partículas sólidas por métodos de ultrafiltração pode explicar as menores taxas de recuperação dos métodos de ultrafiltração contra SMF, considerando o potencial de partição do RNA blindado para sólidos de águas residuárias30. Adicionalmente, os parâmetros físico-químicos e biológicos das águas residuárias (metadados) estão resumidos na Tabela 1. O teste de FME com águas superficiais (etapa 2) resultou em uma maior taxa de recuperação, 42,7% ± 15,1%, indicando que a partição dos vírus em partículas sólidas pode ter afetado significativamente a recuperação, considerando baixas concentrações de sólidos em águas superficiais.

Filtração seriada e concentração de vírus
A Tabela 3 resume os parâmetros de qualidade da água e os ácidos nucléicos extraídos de amostras ambientais de água coletadas em Winnipeg ao longo de três estações. O DNA foi quantificável em todos os locais de amostragem e ao longo das estações. A Figura 1 suplementar indica um mapa com as localizações ambientais das águas superficiais. Por outro lado, os valores de RNA estiveram em sua maioria abaixo do limite de detecção usando um fluorômetro (<0,025 ng/μL). Esses extratos de RNA foram amplificados aleatoriamente para gerar cDNA quantificável para sequenciamento de alto rendimento (Tabela 3).

Concentração de frações microbianas de amostras ambientais de água
A Figura 2 e a Figura 3 ilustram o fluxo de trabalho para a metodologia e concentração das frações microbianas das amostras de águas superficiais ambientais. A Tabela 4 contém a concentração média de DNA, o desvio padrão e as condições ambientais, como pH, temperatura, oxigênio dissolvido, pressão atmosférica, precipitação e horário de verão dos pontos de amostragem dos cursos d'água protegidos (florestais) e impactados (urbanos e agrícolas) analisados nesta pesquisa. As amostras foram coletadas mensalmente de abril de 2022 a outubro de 2022 em áreas urbanas e rurais ao redor da cidade de Portage la Prairie ao longo do rio Assiniboine em Manitoba, Canadá. A maior concentração de DNA foi observada no sítio florestal 1 e produziu 109,35-229,18 ng/μL. Por outro lado, a menor concentração de DNA microbiano foi recuperada do sítio agrícola 3 e apresentou concentração média de 19,83-22,05 ng/μL. A concentração média de DNA, desvio padrão e metadados de todas as amostras coletadas de abril a outubro de 2022 estão resumidos na Tabela 4. As concentrações de DNA obtidas foram ótimas para outras aplicações a jusante, que incluem PCR, qPCR e sequenciamento (dados não mostrados).

Figure 1
Figura 1: Porcentagem de recuperação e análise estatística para cada método para amostras de águas residuais. Abreviaturas: SMF = floculação do leite desnatado; UF-3K x g = ultrafiltração a 3.000 x g; UF-7,5K x g = ultrafiltração a 7.500 x g. Médias com asterisco (*) indicam diferenças significativas ao nível de 0,05 entre os tratamentos; n = 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Representação esquemática da metodologia utilizada para concentrar e quantificar vírus de corpos d'água urbanos de Manitoba que recebem efluentes de águas residuárias. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Resumo gráfico da concentração de vírus, bactérias e microeucariotos para quantificação e sequenciamento de DNA. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Localização de 11 amostras ambientais de água. As amostras foram coletadas ao longo dos rios Red e Assiniboine em Winnipeg, Manitoba, como indicado pelos pontos vermelhos. As três principais estações de tratamento de esgoto de Winnipeg são indicadas em azul como um dos locais visitados, embora nenhum evento de amostragem tenha ocorrido. As fontes dos dados são o Google Maps e o software Tableau. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela 1: Parâmetros de qualidade da água em amostras afluentes do NESTP, SESTP e WESTP. Abreviações: NESTP = Estação de Tratamento de Esgoto do Extremo Norte; SESTP = Estação de Tratamento de Esgoto do Extremo Sul; WESTP = Estação de Tratamento de Esgoto West End; DLM = milhões de litros por dia; ST = sólidos totais; SST = sólidos suspensos totais; DBO5 = demanda bioquímica de oxigênio em 5 dias; NH4-N = nitrogênio amoniacal; TP = fósforo total; COT = carbono orgânico total; TN = nitrogênio total. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Conjuntos de primers/sondas dos ensaios de RT-qPCR. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Parâmetros de qualidade da água dos rios Vermelho e Assiniboine durante a coleta de amostras na primavera em 16 de maio, verão em 27 de agosto e outono em 21 de novembro de 2021) e quantificação de fluorômetro de ácidos nucléicos totais (DNA e RNA). * O limite de detecção do kit de RNA é de 0,025 ng/μL; ^ Os números representam os valores do intervalo. Abreviações: DO = oxigênio dissolvido; DBO5= demanda bioquímica de oxigênio em 5 dias; TP = fósforo total. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Parâmetros de qualidade da água do rio Assiniboine durante a coleta de amostras (abril a outubro de 2022). Clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

Uma das etapas críticas neste estudo é a eliminação de partículas sólidas através da aplicação de uma etapa de pré-filtração com filtros de membrana de 0,2 μm e 0,45 μm. Considerando a partição de vírus em partículas sólidas, especialmente vírus envelopados, a pré-filtração pode causar uma perda significativa na recuperação viral30. Embora uma etapa de pré-filtragem para métodos de ultrafiltração seja quase sempre necessária para amostras ambientais e de águas residuais para evitar que os dispositivos de ultrafiltração entupam, a pré-filtragem para SMF pode ser necessária, dependendo do tipo de análise a jusante. Para estudos de PCR direcionados, a prefiltração pode não ser necessária. Por outro lado, a pré-filtração pode melhorar significativamente a metagenômica viral, uma vez que reduz o ruído de fundo em viromes de frações maiores, como microeucariotos e bactérias. Essa etapa é fundamental para o sequenciamento para que genomas maiores não enxameiem o sinal viral.

O volume de amostra que pode ser processado com ultrafiltração sequencial é limitado a 140 mL. Esta é uma limitação importante para amostras com baixas contagens de vírus. Por outro lado, a SMF pode processar volumes de amostra muito maiores, aumentando a probabilidade de recuperação de vírus.

As taxas de recuperação do SMF estão de acordo com outros estudos que enfocam a concentração de partículas virais de águas residuais. Artigos publicados anteriormente relataram taxas de recuperação semelhantes com uma variedade de vírus de teste. As taxas médias de recuperação relatadas nesses estudos variaram entre 3,4% e 14%13,31,32. A presente metodologia foi parte de outro estudo que investigou SARS-CoV-2 em águas residuais em relação aos números de casos em Winnipeg33. O método SMF descrito aqui também foi usado para rastrear o RNA do SARS-CoV-2 em lagoas de oxidação de comunidades rurais de Manitoba em nosso laboratório. A utilidade do método SMF também tem sido usada em combinação com filtração seriada (0,45 μm seguido por 0,2 μm e 0,1 μm) para caracterizar comunidades virais em amostras de água doce de ambientes urbanos usando sequenciamento de alto rendimento em nosso laboratório (descrito na segunda seção da metodologia). Finalmente, o método SMF também pode ser aplicado para direcionar a precipitação de comunidades microbianas, tais como microeucariotos, bactérias e vírus a partir de amostras de água ambientais, e posterior caracterização usando sequenciamento em amplicon profundo dos genes 18S rRNA e 16S rRNA, bem como o gene da proteína principal do capsídeo (g23) de grupos virais como vírus T4-like (Zambrano e Uyaguari-Díaz, dados não publicados). O método SMF permite concentrar as frações microbianas presentes nas amostras de água de grandes volumes de entrada (i.e., 10-40 L) para volumes relativamente menores (i.e., 1-5 mL). Como parte dessa metodologia, a água ultrapura também é incluída como controle negativo/de fundo. Uma vez que as frações microbianas estão concentradas para baixo, a extração de ácido nucleico pode ser conduzida usando kits de extração comerciais ou protocolos internos. A FME representa um método versátil, relativamente barato e fácil de concentrar frações microbianas ou partículas virais, sem diferenças significativas em comparação com as abordagens de ultrafiltração ou filtração tangencial em fluxo.

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Disclosures

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela NSERC Alliance Covid-19 Grant (Prêmio No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan e Uyaguari-Díaz). A MUD agradece ao Programa de Bolsas de Pesquisa da Universidade (Prêmio nº 325201). Tanto a JF quanto a JZA são apoiadas pelo programa de treinamento de pós-graduação Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY e JF receberam bolsas do programa Mitacs Acelerar. MUD e seus membros do laboratório (KY, JF, JZA) são apoiados pelo NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) e pela bolsa Research Manitoba New Investigator Operating (nº 5385). Agradecimentos especiais à cidade de Winnipeg, Manitoba. Esta pesquisa foi conduzida na Universidade de Manitoba. Gostaríamos de reconhecer que os campi da Universidade de Manitoba estão localizados nas terras originais dos povos Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota e Dene e na terra natal da Nação Métis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 Alfa Aesar J62041AP Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 66234 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 60043 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444432 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control Asuragen 49650 Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa Pall  OD030C65 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa Pall MCP010C46 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)  Nalgene 3119-0050PK Thermo Fisher Scientific
DNAse I Invitrogen 18047019 Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2 Invitrogen 12027 Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm Pall 12179 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution Thermo Fisher Scientific AC124210025 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit Applied biosystems A42358 Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water Promega P1197 Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump Masterflex, Cole-Parmer instrument 7553-20 Thermo Fisher Scientific
pH meter  Denver instrument RK-59503-25 Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Invitrogen 15593031 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit Qiagen Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A34322 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q33231 Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi Invitrogen Q33238 Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q32855 Thermo Fisher Scientific
RNAse A Invitrogen EN0531 Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit Qiagen 26000-50 Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder Difco (BD Life Sciences) DF0032173 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer Alfa Aesar Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater VWR  RC8363-1 RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4621 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4622 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol Gibco 21985023 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

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References

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Concentração de Partículas de Vírus de Amostras Ambientais de Água e Efluentes Usando Floculação e Ultrafiltração de Leite Desnatado
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Yanaç, K., Francis, J., Zambrano-Alvarado, J., Yuan, Q., Uyaguari-Díaz, M. Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration. J. Vis. Exp. (193), e65058, doi:10.3791/65058 (2023).

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