Summary
Концентрация вирусов в пробах воды и сточных вод окружающей среды представляет собой сложную задачу, выполняемую главным образом для идентификации и количественной оценки вирусов. Несмотря на то, что было разработано и протестировано несколько методов концентрации вирусов, мы демонстрируем здесь эффективность ультрафильтрации и флокуляции обезжиренного молока для РНК-вирусов с различными типами образцов.
Abstract
Эпидемиология, основанная на водных ресурсах и сточных водах, стала альтернативным методом мониторинга и прогнозирования хода вспышек в сообществах. Извлечение микробных фракций, включая вирусы, бактерии и микроэукариоты, из сточных вод и проб воды окружающей среды является одним из сложных шагов в этих подходах. В этом исследовании мы сосредоточились на эффективности восстановления методов последовательной ультрафильтрации и флокуляции обезжиренного молока (SMF) с использованием бронированной РНК в качестве тестового вируса, который также используется в качестве контроля в некоторых других исследованиях. Предварительная фильтрация мембранными дисковыми фильтрами 0,45 мкм и 0,2 мкм применялась для удаления твердых частиц перед ультрафильтрацией для предотвращения засорения ультрафильтрационных устройств. Испытуемые образцы, обработанные методом последовательной ультрафильтрации, центрифугировали на двух разных скоростях. Увеличение скорости привело к снижению уровня восстановления и положительности бронированной РНК. С другой стороны, SMF приводил к относительно последовательному восстановлению и положительным показателям бронированной РНК. Дополнительные тесты, проведенные с пробами воды из окружающей среды, продемонстрировали полезность SMF для концентрирования других микробных фракций. Разделение вирусов на твердые частицы может повлиять на общую скорость извлечения, учитывая стадию предварительной фильтрации, применяемую перед ультрафильтрацией проб сточных вод. SMF с предварительной фильтрацией показал лучшую эффективность при нанесении на пробы воды из окружающей среды из-за более низких концентраций твердых веществ в пробах и, следовательно, более низких скоростей разделения на твердые частицы. В настоящем исследовании идея использования метода последовательной ультрафильтрации возникла из-за необходимости снижения конечного объема вирусных концентратов в период пандемии COVID-19, когда поставки широко используемых ультрафильтрационных устройств были ограничены, и возникла необходимость в разработке альтернативных методов концентрации вируса.
Introduction
Определение эффективной концентрации микроорганизмов в пробах поверхностных и сточных вод для анализа микробных сообществ и эпидемиологических исследований является одним из важных шагов для мониторинга и прогнозирования течения вспышек в сообществах 1,2. Пандемия COVID-19 раскрыла важность совершенствования методов концентрации. COVID-19 возник в конце 2019 года и по состоянию на март 2023 года по-прежнему представляет угрозу для здоровья людей, социальной жизни и экономики. Эффективные стратегии эпиднадзора и контроля для смягчения последствий вспышек COVID-19 в сообществах стали важной темой исследований, поскольку в дополнение к быстрой передаче и распространению вируса появляются новые волны и варианты COVID-19, а также незарегистрированные и недиагностированные бессимптомные случаи 3,4,5. Использование эпидемиологии COVID-19 на основе сточных вод организациями гражданского общества, государственными учреждениями и государственными или частными коммунальными службами помогло быстро предоставить информацию, связанную со вспышками, и смягчить последствия вспышек COVID-19 6,7,8,9. Тем не менее, концентрация SARS-CoV-2, вируса РНК в оболочке, в образцах сточных вод по-прежнему создает проблемы10. Например, одной из таких проблем является разделение SARS-CoV-2 в твердых частицах сточных вод, что может повлиять на восстановление, когда твердые вещества удаляются во время концентрации11. Если это так, то при количественном определении/оценке основное внимание следует уделять как твердой, так и водной фазам проб воды в окружающей среде, а не только водной фазе. Кроме того, выбор метода концентрирования может быть изменен на основе последующих испытаний и анализов. Концентрация вирусных частиц и патогенов в образцах окружающей среды стала актуальной темой исследований с разработками в области секвенирования и микробиома.
Различные методы концентрации вируса применялись в области концентрации вируса в пробах воды и сточных вод окружающей среды. Некоторые часто используемые методы: фильтрация, флокуляция обезжиренного молока (SMF), адсорбция/элюирование и осаждение полиэтиленгликоля12-17. Среди них SMF считается дешевым и эффективным методом, успешно протестированным и применяемым для извлечения вирусов, включая SARS-CoV-2, из сточных и поверхностных вод12,15,16,18. Процедура SMF является относительно новым подходом, который получил все большее признание во многих экологических исследованиях в качестве подходящей методологии для одновременного извлечения широкого спектра микроорганизмов, таких как вирусы, бактерии и простейшие, из всех типов проб воды, а именно из проб ила, неочищенных сточных вод, сточных вод и сточных вод19. По сравнению с другими известными методологиями извлечения вирусов из образцов окружающей среды, такими как ультрафильтрация и глицин-щелочное элюирование, подход, основанный на лиофилизации, или ультрацентрифугирование и глицин-щелочное элюирование, SMF был признан наиболее эффективным методом с более высокими показателями восстановления и обнаружения вирусов18,20. В настоящем исследовании мы использовали бронированную РНК в качестве тестового вируса для оценки эффективности восстановления методами концентрации вируса, включая тесты для оценки восстановления SARS-CoV-221,22.
Здесь мы протестировали образцы сточных вод и воды окружающей среды, чтобы продемонстрировать полезность SMF и последовательного метода ультрафильтрации для концентрирования микробных фракций для количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), метагеномики на основе последовательностей и секвенирования с глубоким ампликоном. SMF является относительно более дешевым методом и оптимален для большего объема образцов по сравнению с методами ультрафильтрации. Идея использования метода последовательной ультрафильтрации возникла из-за необходимости уменьшить конечный объем вирусных концентратов во время пандемии COVID-19, когда поставки широко используемых ультрафильтрационных устройств были ограничены, и возникла необходимость в разработке альтернативных методов концентрации вируса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сравнение серийной ультрафильтрации и флокуляции обезжиренного молока для концентрирования вирусов в пробах сточных вод
- Пробоподготовка
- Соберите 2 л 24-часовых пропорциональных потоку композитных образцов неочищенных (приточных) сточных вод. Пробы были взяты с трех основных очистных сооружений (СОСВ) в Виннипеге, Канада, летом и осенью 2020 года (таблица 1).
- Транспортируйте образцы в лабораторию в светонепроницаемых бутылках в холодильнике и обрабатывайте их в течение 24 часов. Сбор данных о физико-химических и биологических характеристиках сточных вод.
- Анализы концентрации вируса
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод последовательной ультрафильтрации и метод органической флокуляции, а именно флокуляция обезжиренного молока (SMF), были применены для оценки общей эффективности восстановления каждого метода с использованием бронированной РНК в качестве тестового вируса23. Другие исследователи также использовали бронированную РНК в качестве контрольного вируса для оценки восстановления методов концентрации оболочечных вирусов, таких как семейство Coronaviridae22,24,25,26.- Для добавления бронированной РНК установите объемы испытаний сточных вод для методов ультрафильтрации и SMF как 140 мл и 500 мл соответственно. Используя пипеттор, добавьте 5 x 104 копий бронированной РНК в шесть образцов пресных сточных вод, собранных в одну дату, и шесть проб пресных сточных вод в другую дату для каждого метода ультрафильтрации; кроме того, в Spike six хранились (при 4 °C) пробы сточных вод, собранные на третью, более позднюю дату и обработанные через несколько дней для SMF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый из шести наборов проб, собранных в разные даты, состоял из двух проб с каждой из трех очистных сооружений. В нашем исследовании первый набор проб пресных сточных вод был собран 8 июля 2020 года, второй - 30 сентября 2020 года, а пробы сточных вод будут храниться для SMF - 14 октября 2020года. - Перемешивайте в течение 30 минут при 4 ° C, чтобы инокулировать и гомогенизировать бронированную РНК в образцах с помощью магнитной мешалки.
- Удалите все частицы или ячейки размером более 0,2 мкм и выполните ультрафильтрацию.
- Отфильтруйте образцы сточных вод с шипами (120 мл из каждого образца с шипами объемом 140 мл) через марлю и мембранные дисковые фильтры с низким содержанием белка размером 0,45 мкм и 0,2 мкм, 47 мм, соответственно, для удаления крупных частиц, отложений, эукариот и бактерий27. Обработайте отфильтрованные образцы, используя методы ультрафильтрации, описанные ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пробы сточных вод, собранные 8 июля и 30 сентября, были использованы для методов ультрафильтрации с 3 000 xg и 7 500 x g соответственно. - Для последовательной ультрафильтрации при 3000 x g (UF-3k x g) концентратируют в общей сложности 120 мл испытуемого образца, собранного в первый день при 3000 x g, в течение 30 мин, загружая 60 мл образца дважды примерно до 5 мл с использованием центробежного устройства марки А, 30 кДа. Затем сконцентрируйте объем 5 мл при 3,000 x g в течение 30 мин, используя центробежное устройство марки B, 30 кДа, до 500-1,200 мкл.
- Для последовательной ультрафильтрации при 7,500 x g (UF-7,5k x g) измените скорость центрифугирования для центробежного устройства марки B с 3,000 x g до 7,500 x g, чтобы получить меньшие конечные объемы, в соответствии с рекомендациями производителя, и сохраняйте скорость центрифугирования центробежного устройства марки A прежней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Испытания проводились с образцами, собранными 30сентября.
- Отфильтруйте образцы сточных вод с шипами (120 мл из каждого образца с шипами объемом 140 мл) через марлю и мембранные дисковые фильтры с низким содержанием белка размером 0,45 мкм и 0,2 мкм, 47 мм, соответственно, для удаления крупных частиц, отложений, эукариот и бактерий27. Обработайте отфильтрованные образцы, используя методы ультрафильтрации, описанные ниже.
- Для SMF-функции выполните действия, описанные ниже.
- Отсортируйте пробы сточных вод (по 500 мл каждая) для непосредственного концентрирования, используя протоколSMF 16,18, без предварительной фильтрации с помощью марли и мембранных дисковых фильтров с низким содержанием белка, как описано ниже.
- Растворите 0,5 г сухого обезжиренного молока в 50 мл синтетической морской воды для получения 1% (мас./об.) раствора обезжиренного молока и осторожно отрегулируйте рН раствора до 3,5, используя 1 N HCl.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подкисление приводит к тому, что вирусы агрегируются и выпадают в осадок из воды из-за изменения их изоэлектрической точки16 и улучшают растворимость сухого молока28. - Добавьте 5 мл раствора обезжиренного молока к 500 мл проб сырых сточных вод, чтобы получить конечную концентрацию обезжиренного молока 0,01% (мас. / об.).
- Перемешивайте образцы в течение 8 ч на средней скорости и дайте образовавшимся хлопьям отстояться еще 8 ч при комнатной температуре.
- Удалите надосадочную жидкость осторожно с помощью серологических пипеток, не повреждая осевшие хлопья. Конечный объем объемом 50 мл, содержащий хлопья, переносят в центрифужные пробирки и центрифугу при 8000 x g в течение 30 мин при 8 °C.
- Аккуратно утилизируйте гранулы стерилизованным шпателем и ресуспендируйте оставшиеся гранулы в пробирках в 250 мкл 0,2 М натрий-фосфатного буфера (pH 7,5) после удаления надосадочной жидкости. Переложите очищенные и ресуспендированные гранулы в те же мини-центрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
- Для добавления бронированной РНК установите объемы испытаний сточных вод для методов ультрафильтрации и SMF как 140 мл и 500 мл соответственно. Используя пипеттор, добавьте 5 x 104 копий бронированной РНК в шесть образцов пресных сточных вод, собранных в одну дату, и шесть проб пресных сточных вод в другую дату для каждого метода ультрафильтрации; кроме того, в Spike six хранились (при 4 °C) пробы сточных вод, собранные на третью, более позднюю дату и обработанные через несколько дней для SMF.
- Выполните экстракцию вирусной РНК из вирусных концентратов образцов сточных вод и анализы эффективности восстановления с использованием набора для экстракции РНК с соотношением фенол:хлороформ:изоамиловый спирт и β-меркаптоэтанол 25:24:1 в соответствии с инструкциями производителя для повышения эффективности экстракции. Наконец, разбавьте РНК в 50 мкл элюирующего буфера.
- Количественный анализ полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-кПЦР)
- Количественное определение бронированной РНК с использованием десятикратных разведений (7,8 x 10,от 4 до 7,8 копий генов) синтетической одноцепочечной ДНК или конструкции gBlock. В таблице 2 приведены праймеры и наборы зондов, которые обнаруживают и количественно определяют бронированную РНК.
- Проектируйте наборы праймеров и зондов с помощью инструмента29 проектирования праймеров и нацеливайтесь на область 95.н. (конструкция gBlock) в геноме бронированной РНК.
- Получение калибровочных кривых для каждого запуска ОТ-кПЦР. Включайте отрицательные элементы управления в каждый запуск qPCR. Выполняйте стандарты, примеры и элементы управления, не являющиеся шаблонами, в трех экземплярах.
- Приготовьте каждую смесь ОТ-кПЦР объемом 10 мкл в следующем порядке: 2,5 мкл 4-кратной основной смеси, 400 нМ каждого праймера, 200 нМ зонда и 2,5 мкл шаблона, а также сверхчистая дистиллированная вода, не содержащая ДНКазы/РНК.
- Выполняйте реакции термоциклирования при 50 ° C в течение 5 мин, а затем 45 циклов при 95 ° C в течение 10 с и 60 ° C в течение 30 с на системе ПЦР в реальном времени. Если КТ была <40, считайте, что образец бронированной РНК положительный.
- Проведите тесты кПЦР и ОТ-кПЦР с использованием бычьего сывороточного альбумина с образцами неочищенных сточных вод для оценки возможности ингибиторов или загрязняющих веществ, таких как гуминовые кислоты24. Существенных различий между образцами с ферментом и без него не наблюдалось.
- Рассчитайте концентрации по стандартной кривой. Рассчитайте процент эффективности извлечения, разделив извлеченную концентрацию на пиковую концентрацию.
- Преобразуйте количество копий генов, используя функцию log10 для анализа. Запустите общую линейную модель с помощью инструмента статистического анализа на данных qPCR. Примените тест Тьюки, чтобы обнаружить различия между методами и методами лечения. Примите p-значение 0,05 в качестве минимального уровня значимости для теста.
2. Фильтрация и концентрация ДНК- и РНК-вирусов для водной эпидемиологии
- Для сбора поверхностных вод окружающей среды соберите 10 л проб поверхностных вод окружающей среды и используйте 10 л проб деионизированной воды для фонового контроля. Храните все образцы в помещении при температуре 4 °C до обработки в течение 24 часов после отбора проб.
- Выполните концентрацию вирусов из образцов окружающей среды с помощью SMF, выполнив действия, описанные ниже.
- Выполняйте капсульную и вакуумную фильтрацию с использованием высокопроизводительных капсул для отбора проб подземных вод и мембранных дисковых фильтров размером 0,45 мкм, 0,2 мкм и 0,1 мкм, чтобы свести к минимуму шум во время метагеномного секвенирования, от более крупных фракций, таких как микроэукариоты и бактерии, до более мелких, таких как вирусы.
- Приготовьте 1%-ный раствор предварительно флокулированного обезжиренного молока по весу в 1,32 л синтетической морской воды с 13,2 г сухого обезжиренного молока. Отрегулируйте рН этой суспензии до 3,5, используя 1 Н HCl.
- Отрегулируйте рН проб поверхностных вод окружающей среды до 3,5, используя 1 Н HCl.
- Перенесите 100 мл предварительно флокулированного подкисленного раствора обезжиренного молока в 10 л подкисленного (рН 3,5) пробы воды из окружающей среды (конечная концентрация обезжиренного молока 0,01% [мас./об.]).
- Используя магнитную мешалку и магнитную мешалку, перемешивайте образцы в течение 8 часов при комнатной температуре и дайте хлопьям осаждаться под действием силы тяжести в течение дополнительных 8 часов. Не беспокоя хлопья, аккуратно удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумного насоса.
- Распределите и уравновесьте оставшиеся хлопья в соответствии с весом в центрифужных пробирках объемом 50 мл и открутите их при 8000 x g в течение 30 мин при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и растворите полученную гранулу (которая теоретически содержит интересующие вирусы) в 200 мкл 0,2 М фосфатного буфера натрия.
- Обработайте растворенную гранулу ДНКазой I и РНКазой А, следуя инструкциям производителя, чтобы удалить присутствующие свободные ДНК и РНК, которые могут быть осаждены из-за набора, используемого для экстракции нуклеиновых кислот. Инактивируйте ДНКазу I и РНКазу А, следуя инструкциям производителя.
- Извлеките общее количество нуклеиновых кислот из растворенной гранулы с помощью набора для экстракции ДНК / РНК в соответствии с инструкциями производителя.
- Количественно определите общее количество извлеченной ДНК и РНК из образцов сточных вод с помощью флуорометра. Образцы с концентрацией >1 нг/мкл считаются оптимальными для количественного определения и секвенирования ДНК.
- Выполните анализ кПЦР для нацеливания на интересующие кишечные вирусы и высокопроизводительное секвенирование для определения структуры вирусного сообщества.
3. Прямые осадки и концентрация микробных фракций для водной эпидемиологии
- Соберите 2 л проб воды из защищенных и пострадавших водных путей. Если образец содержит значительное количество мусора, используйте марлю для их удаления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется собирать биологический дубликат на образец. - Приготовьте 1% (мас./об.) раствор обезжиренного молока, растворив 4,4 г сухого обезжиренного молока в 440 мл синтетической морской воды. Отрегулируйте рН этой суспензии до 3,5 с 1 Н HCl.
- Отрегулируйте рН проб пресной воды до 3,5, используя 1 N HCl.
- Добавьте 20 мл раствора обезжиренного молока к предварительно скорректированным рН 2-литровым образцам пресной воды (конечная концентрация обезжиренного молока 0,01% [мас./об.]). Перемешивайте образцы при комнатной температуре в течение 8 часов.
- Дайте хлопьям осаждаться под действием силы тяжести еще 8 часов. Аккуратно удалите надосадочную жидкость с помощью перистальтического насоса. Перенесите осажденные хлопья в центрифужную пробирку объемом 50 мл и открутите их при 8000 x g в течение 30 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы с 200 мкл 0,2 М буфера фосфата натрия. Храните образцы при температуре -20 °C или приступайте к отбору ~ 0,5 г хлопьев для экстракции микробной ДНК с помощью выбранного набора для выделения нуклеиновых кислот, следуя инструкциям производителя.
- Определите концентрацию и чистоту нуклеиновых кислот ДНК с помощью высокочувствительного флуорометра. Образцы с концентрацией >1 нг/мкл должны быть оптимальными для количественного определения и секвенирования ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка методов концентрации вирусной РНК
Все шесть образцов, обработанных UF-3k x g, были положительными и привели к восстановлению 13,38% ± 8,14% (рис. 1). Только один образец был положительным, когда образцы были обработаны UF-7,5k x g. Все образцы, обработанные с помощью SMF, были положительными и привели к восстановлению на 15,27% ± 2,65% (рис. 1). Средние показатели извлечения UF-3K x g и SMF были значительно и последовательно (p < 0,0001) выше, чем UF-7,5K x g. С другой стороны, не было существенной разницы (p = 0,6240) между скоростями восстановления UF-3K x g и SMF. Увеличение скорости центрифугирования центробежного устройства марки B до 7,500 x g с 3,000 x g привело к более низкому извлечению, вероятно, из-за прохождения бронированной РНК через фильтры с повышенной скоростью и связывания частиц бронированной РНК с фильтрами с увеличенной центробежной скоростью. Удаление твердых частиц с помощью методов ультрафильтрации может объяснить более низкие скорости извлечения методов ультрафильтрации против SMF, учитывая потенциальное разделение бронированной РНК на твердые частицы30 сточных вод. Кроме того, физико-химические и биологические параметры сточных вод (метаданные) обобщены в таблице 1. Тестирование SMF с поверхностными водами (этап 2) привело к более высокой скорости восстановления, 42,7% ± 15,1%, что указывает на то, что разделение вирусов на твердые частицы могло значительно повлиять на восстановление, учитывая низкие концентрации твердых веществ в поверхностных водах.
Последовательная фильтрация и концентрация вирусов
В таблице 3 приведены параметры качества воды и нуклеиновые кислоты, извлеченные из проб воды из окружающей среды, собранных в Виннипеге за три сезона. ДНК поддавалась количественной оценке во всех местах отбора проб и в разные сезоны. На дополнительном рисунке 1 показана карта с расположением поверхностных вод в окружающей среде. С другой стороны, значения РНК были в основном ниже предела обнаружения с использованием флуорометра (<0,025 нг / мкл). Эти экстракты РНК были случайным образом амплифицированы для получения поддающейся количественной оценке кДНК для высокопроизводительного секвенирования (таблица 3).
Концентрация микробных фракций в пробах воды из окружающей среды
На рисунках 2 и 3 показан рабочий процесс методологии и концентрации микробных фракций из проб поверхностных вод окружающей среды. Таблица 4 содержит среднюю концентрацию ДНК, стандартное отклонение и условия окружающей среды, такие как pH, температура, растворенный кислород, атмосферное давление, осадки и дневное время на участках отбора проб охраняемых (лесных) и подвергшихся воздействию (городских и сельскохозяйственных) водных путей, проанализированных в этом исследовании. Образцы собирались ежемесячно с апреля 2022 года по октябрь 2022 года в городских и сельских районах, окружающих город Портаж-ла-Прери вдоль реки Ассинибойн в Манитобе, Канада. Наибольшая концентрация ДНК наблюдалась в лесном массиве 1 и составила 109,35-229,18 нг/мкл. С другой стороны, самая низкая концентрация микробной ДНК была извлечена на сельскохозяйственном участке 3 и имела среднюю концентрацию 19,83-22,05 нг/мкл. Средняя концентрация ДНК, стандартное отклонение и метаданные всех образцов, собранных с апреля по октябрь 2022 года, приведены в таблице 4. Полученные концентрации ДНК были оптимальными для других последующих применений, включая ПЦР, кПЦР и секвенирование (данные не показаны).
Рисунок 1: Процент извлечения и статистический анализ для каждого метода для проб сточных вод. Сокращения: SMF = флокуляция обезжиренного молока; UF-3K x g = ультрафильтрация при 3 000 x g; UF-7.5K x g = ультрафильтрация при 7 500 x g. Средние значения, отмеченные звездочкой (*), указывают на значительные различия на уровне 0,05 между видами лечения; n = 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схематическое изображение методологии, используемой для концентрирования и количественного определения вирусов из городских водоемов Манитобы, которые принимают сточные воды. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Графическая аннотация концентрации вирусов, бактерий и микроэукариот для количественного определения и секвенирования ДНК. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Расположение 11 проб воды в окружающей среде. Образцы были собраны вдоль рек Ред и Ассинибойн в Виннипеге, Манитоба, на что указывают красные точки. Три основные очистные сооружения Виннипега обозначены синим цветом как один из посещенных участков, хотя никаких случаев отбора проб не произошло. Источниками данных являются карты Google и программное обеспечение Tableau. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Таблица 1: Параметры качества воды в притоковых пробах NESTP, SESTP и WESTP. Аббревиатуры: NESTP = Станция очистки сточных вод Норт-Энд; SESTP = очистные сооружения Саут-Энда; WESTP = очистные сооружения Вест-Энда; МЛД = миллион литров в сутки; TS = общее количество твердых веществ; TSS = общее количество взвешенных твердых частиц; БПК5 = 5-дневная биохимическая потребность в кислороде; NH4-N = аммоний-азот; TP = общий фосфор; TOC = общий органический углерод; TN = общий азот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Наборы праймеров/зондов анализов ОТ-кПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Параметры качества воды в реках Ред и Ассинибойн при отборе проб весной 16 мая, летом 27 августа и осенью 21 ноября 2021 года) и количественном определении общего количества нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) с помощью флуорометра. * Предел обнаружения набора РНК составляет 0,025 нг/мкл; ^ Числа представляют значения диапазона. Сокращения: DO = растворенный кислород; БПК5= 5-дневная биохимическая потребность в кислороде; TP = общий фосфор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 4: Параметры качества воды в реке Ассинибойн во время отбора проб (апрель-октябрь 2022 г.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одним из важнейших этапов этого исследования является удаление твердых частиц путем применения этапа предварительной фильтрации с мембранными фильтрами 0,2 мкм и 0,45 мкм. Учитывая разделение вирусов на твердые частицы, особенно оболочечные вирусы, предварительная фильтрация может привести к значительным потерям в восстановлении вируса30. В то время как этап предварительной фильтрации для методов ультрафильтрации почти всегда необходим для проб окружающей среды и сточных вод, чтобы предотвратить засорение ультрафильтрационных устройств, предварительная фильтрация для SMF может потребоваться в зависимости от типа последующего анализа. Для целевых ПЦР-исследований предварительная фильтрация может не потребоваться. С другой стороны, предварительная фильтрация может значительно улучшить вирусную метагеномику, поскольку она снижает фоновый шум в виромах от более крупных фракций, таких как микроэукариоты и бактерии. Этот шаг имеет решающее значение для секвенирования, чтобы более крупные геномы не роились вирусным сигналом.
Объем образца, который может быть обработан с помощью последовательной ультрафильтрации, ограничен 140 мл. Это важное ограничение для образцов с низким количеством вирусов. С другой стороны, SMF может обрабатывать гораздо большие объемы образцов, увеличивая вероятность восстановления вирусов.
Показатели восстановления SMF согласуются с другими исследованиями, посвященными концентрации вирусных частиц в сточных водах. Ранее опубликованные статьи сообщали об аналогичных показателях восстановления с различными тестовыми вирусами. Сообщаемые средние показатели выздоровления в этих исследованиях варьировались от 3,4% до 14%13,31,32. Настоящая методология была частью другого исследования, посвященного изучению SARS-CoV-2 в сточных водах в связи с номерами случаев заболевания вВиннипеге 33. Описанный здесь метод SMF также использовался для скрининга РНК SARS-CoV-2 в окислительных лагунах сельских общин Манитобы в нашей лаборатории. Полезность метода SMF также использовалась в сочетании с последовательной фильтрацией (0,45 мкм с последующими 0,2 мкм и 0,1 мкм) для характеристики вирусных сообществ в образцах пресной воды из городских условий с использованием высокопроизводительного секвенирования в нашей лаборатории (описано во втором разделе методологии). Наконец, метод SMF также может быть применен для направления осаждения микробных сообществ, таких как микроэукариоты, бактерии и вирусы, из проб воды окружающей среды, и дальнейшей характеристики с использованием глубокого ампликонного секвенирования генов 18S рРНК и 16S рРНК, а также основного гена капсидного белка (g23) вирусных групп, таких как Т4-подобные вирусы (Zambrano и Uyaguari-Díaz, неопубликованные данные). Метод SMF позволяет концентрировать микробные фракции, присутствующие в пробах воды, от больших входных объемов (т.е. 10-40 л) до относительно меньших объемов (т.е. 1-5 мл). В рамках этой методики сверхчистая вода также включена в качестве отрицательного/фонового контроля. После того, как микробные фракции сконцентрированы, экстракция нуклеиновых кислот может быть проведена с использованием коммерческих наборов для экстракции или внутренних протоколов. SMF представляет собой универсальный, относительно дешевый и простой метод концентрирования микробных фракций или вирусных частиц без существенных отличий по сравнению с ультрафильтрацией или тангенциальной фильтрацией потоком.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом NSERC Alliance Covid-19 (награда No 431401363, 2020-2021 гг., доктора Юань и Уягуари-Диас). MUD благодарит Программу университетских исследовательских грантов (награда No 325201). И JF, и JZA поддерживаются программой обучения выпускников Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY и JF получили стипендии в рамках программы Mitacs Accelerate. MUD и его сотрудники лаборатории (KY, JF, JZA) поддерживаются NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) и грантом Research Manitoba New Investigator Operating (No 5385). Особая благодарность городу Виннипег, Манитоба. Это исследование было проведено в Университете Манитобы. Мы хотели бы признать, что кампусы Университета Манитобы расположены на исконных землях народов анишинабег, кри, оджи-кри, дакота и дене, а также на родине нации метисов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
References
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
- Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
- Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
- Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P.
- Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
- Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
- Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
- Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
- Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
- Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
- Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
- Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
- Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
- Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
- Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
- Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
- Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
- Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
- Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
- Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
- Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
- Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
- Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).
- Geneious. , Available from: https://www.geneious.com (2021).
- Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
- Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
- Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
- Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).
