Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Konsentrasjon av viruspartikler fra vann- og avløpsvannprøver i omgivelsene ved bruk av skummetmelkflokkulering og ultrafiltrering

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65058
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

Summary

Viruskonsentrasjon fra miljøvann- og avløpsvannprøver er en utfordrende oppgave, utført primært for identifisering og kvantifisering av virus. Mens flere viruskonsentrasjonsmetoder er utviklet og testet, demonstrerer vi her effektiviteten av ultrafiltrering og skummetmelkflokkulering for RNA-virus med forskjellige prøvetyper.

Abstract

Vann- og avløpsbasert epidemiologi har dukket opp som alternative metoder for å overvåke og forutsi forløpet av utbrudd i lokalsamfunn. Gjenoppretting av mikrobielle fraksjoner, inkludert virus, bakterier og mikroeukaryoter fra avløpsvann og miljøvannprøver, er et av de utfordrende trinnene i disse tilnærmingene. I denne studien fokuserte vi på utvinningseffektiviteten av sekvensiell ultrafiltrering og skummet melkflokkulering (SMF) metoder ved bruk av pansret RNA som testvirus, som også brukes som kontroll av noen andre studier. Forfiltrering med 0,45 μm og 0,2 μm membranskivefiltre ble påført for å eliminere faste partikler før ultrafiltrering for å forhindre tilstopping av ultrafiltreringsenheter. Testprøver, behandlet med sekvensiell ultrafiltreringsmetode, ble sentrifugert med to forskjellige hastigheter. En økt hastighet resulterte i lavere utvinning og positivitetsrater av pansret RNA. På den annen side resulterte SMF i relativt konsistent utvinning og positivitetsrater av pansret RNA. Ytterligere tester utført med miljøvannprøver demonstrerte nytten av SMF for å konsentrere andre mikrobielle fraksjoner. Oppdeling av virus i faste partikler kan ha innvirkning på den totale utvinningsgraden, med tanke på forfiltreringstrinnet som ble brukt før ultrafiltrering av avløpsvannprøver. SMF med forfiltrering presterte bedre når den ble brukt på miljøvannprøver på grunn av lavere faste konsentrasjoner i prøvene og dermed lavere partisjoneringshastighet til faste stoffer. I denne studien oppsto ideen om å bruke en sekvensiell ultrafiltreringsmetode fra nødvendigheten av å redusere det endelige volumet av viruskonsentratene under COVID-19-pandemien, da tilførselen av de vanlige ultrafiltreringsenhetene var begrenset, og det var behov for utvikling av alternative virale konsentrasjonsmetoder.

Introduction

Bestemmelse av effektiv konsentrasjon av mikroorganismer i overflate- og avløpsvannprøver for mikrobiell samfunnsanalyse og epidemiologiske studier, er et av de viktige trinnene for å overvåke og forutsi utbruddsforløpet i samfunn 1,2. COVID-19-pandemien utfoldet viktigheten av å forbedre konsentrasjonsmetodene. COVID-19 dukket opp i slutten av 2019 og utgjør fra mars 2023 fortsatt en trussel mot menneskers helse, sosiale liv og økonomien. Effektive overvåkings- og kontrollstrategier for å lindre virkningene av COVID-19-utbrudd i lokalsamfunn har blitt et viktig forskningstema, ettersom nye bølger og varianter av COVID-19 har dukket opp i tillegg til den raske overføringen og spredningen av viruset, samt urapporterte og udiagnostiserte asymptomatiske tilfeller 3,4,5. Bruken av avløpsvannbasert epidemiologi for COVID-19 av sivilsamfunnsorganisasjoner, offentlige etater og offentlige eller private verktøy har vært nyttig for å gi rask utbruddsrelatert informasjon og redusere virkningen av COVID-19-utbrudd 6,7,8,9. Konsentrasjonen av SARS-CoV-2, et innkapslet RNA-virus, i avløpsvannprøver gir imidlertid fortsatt utfordringer10. For eksempel er en av disse utfordringene partisjonering av SARS-CoV-2 i faste stoffer i avløpsvann, noe som kan påvirke utvinningen når de faste stoffene elimineres under konsentrasjon11. Hvis dette er tilfelle, bør fokus for kvantifisering / vurdering være på både faste og vandige faser av miljøvannprøver, i stedet for bare den vandige fasen. Videre kan valg av konsentrasjonsmetode modifiseres basert på nedstrømstester og analyser. Konsentrasjonen av viruspartikler og patogener fra miljøprøver har blitt et presserende forskningstema med utviklingen innen sekvensering og mikrobiomfelt.

Ulike viruskonsentrasjonsmetoder har blitt brukt innen viruskonsentrasjon fra miljøvann og avløpsvannprøver. Noen vanlige metoder er filtrering, skummet melkeflokkulering (SMF), adsorpsjon/eluering og polyetylenglykolutfelling12-17. Blant dem har SMF blitt ansett som en billig og effektiv metode, vellykket testet og brukt for å gjenopprette virus, inkludert SARS-CoV-2, fra avløpsvann og overflatevann12,15,16,18. SMF-prosedyren er en relativt ny tilnærming som har fått økt anerkjennelse blant mange miljøstudier som en hensiktsmessig metode for samtidig å gjenvinne et bredt spekter av mikroorganismer som virus, bakterier og protozoer fra alle typer vannprøver, nemlig slam, rå kloakk, avløpsvann og avløpsprøver19. Sammenlignet med andre kjente metoder for å gjenopprette virus fra miljøprøver som ultrafiltrering og glycin-alkalisk eluering, lyofiliseringsbasert tilnærming eller ultrasentrifugering og glycin-alkalisk eluering, har SMF blitt rapportert som den mest effektive metoden med høyere viral utvinning og deteksjonsrater18,20. I denne studien brukte vi pansret RNA som et testvirus for å vurdere utvinningseffektiviteten av viruskonsentrasjonsmetoder, inkludert tester for å vurdere SARS-CoV-2-utvinning21,22.

Her testet vi avløpsvann og miljøvannprøver for å demonstrere nytten av SMF og en sekvensiell ultrafiltreringsmetode for å konsentrere mikrobielle fraksjoner for kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), sekvensbasert metagenomikk og dypamplikonsekvensering. SMF er en relativt billigere metode og optimal for et større prøvevolum sammenlignet med ultrafiltreringsmetoder. Ideen om å bruke en sekvensiell ultrafiltreringsmetode oppsto fra nødvendigheten av å redusere det endelige volumet av viruskonsentratene under COVID-19-pandemien, da tilførselen av de vanlige ultrafiltreringsenhetene var begrenset, og det var behov for utvikling av alternative virale konsentrasjonsmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sammenligning av seriell ultrafiltrering og skummetmelkflokkulering for å konsentrere virus i avløpsvannprøver

  1. Prøve forberedelse
    1. Samle 2 l av 24 timers strømningsproporsjonale komposittrå (påvirkende) avløpsvannprøver. Prøver ble samlet inn fra de tre store renseanleggene (WWTP) i Winnipeg i Canada sommeren og høsten 2020 (tabell 1).
    2. Transporter prøvene til laboratoriet i lystette flasker i en isboks og behandle dem innen 24 timer. Samle avløpsvann fysisk-kjemiske og biologiske egenskaper data.
  2. Analyser av viruskonsentrasjon
    MERK: En sekvensiell ultrafiltreringsmetode og en organisk flokkuleringsmetode, nemlig skummet melkeflokkulering (SMF), ble brukt for å vurdere total utvinningseffektivitet for hver metode ved bruk av pansret RNA som testvirus23. Andre forskere har også brukt pansret RNA som et kontrollvirus for å vurdere gjenoppretting av konsentrasjonsmetoder for innkapslede virus, som familien Coronaviridae22,24,25,26.
    1. For tilsetning av pansret RNA, sett avløpsvanntestvolumene for ultrafiltrerings- og SMF-metodene til henholdsvis 140 ml og 500 ml. Bruk en pipettor, pigg 5 x 104 kopier av pansret RNA i seks ferske avløpsvannprøver samlet på en dato og seks ferske avløpsvannprøver på en annen dato, for hver ultrafiltreringsmetode; Videre lagres seks lagrede (ved 4 °C) avløpsvannprøver samlet inn på en tredje, senere dato og behandlet dager senere for SMF.
      MERK: Hvert av de seks prøvesettene som ble samlet inn på forskjellige datoer, var sammensatt av to prøver fra hver av de tre renseanleggene. I vår studie ble det første settet med ferske avløpsvannprøver samlet inn 8. juli 2020, det andre 30. september 2020, og avløpsvannprøvene som skal lagres for SMF 14. oktober 2020.
    2. Rør i 30 minutter ved 4 °C for å inokulere og homogenisere pansret RNA i prøvene ved hjelp av en magnetomrører.
    3. Fjern alle partikler eller celler større enn 0,2 μm og utfør ultrafiltrering.
      1. Filtrer de piggete avløpsvannprøvene (120 ml fra hver 140 ml piggete prøve) gjennom osteklær og lavproteinbinding, henholdsvis 0,45 μm og 0,2 μm, 47 mm membranskivefiltre, for å fjerne store partikler, sedimenter, eukaryoter og bakterier27. Behandle de filtrerte prøvene ved hjelp av ultrafiltreringsmetodene beskrevet nedenfor.
        MERK: Avløpsvannprøvene samlet 8. juli og 30.september ble brukt til ultrafiltreringsmetoder med henholdsvis 3,000 xg og 7,500 x g.
      2. For sekvensiell ultrafiltrering ved 3,000 x g (UF-3k x g), konsentrer totalt 120 ml av testprøven samlet på første dato ved 3,000 x g i 30 minutter ved å laste 60 ml av prøven to ganger til ca. 5 ml ved hjelp av en merke A sentrifugalanordning, 30-kDa. Deretter konsentrerer du 5 ml volumet ved 3,000 x g i 30 minutter ved hjelp av en merke B sentrifugalenhet, 30-kDa, til 500-1,200 μL.
      3. For sekvensiell ultrafiltrering ved 7,500 x g (UF-7.5k x g), endre sentrifugalhastigheten for merkevaren B-sentrifugalanordningen fra 3,000 x g til 7,500 x g for å oppnå mindre endelige volumer, i henhold til produsentens anbefalinger, og hold sentrifugalhastigheten til merkevaren A sentrifugalanordning den samme.
        MERK: Testene ble kjørt med prøvene samlet inn 30.
    4. For SMF utfører du trinnene som er beskrevet nedenfor.
    5. Spike avløpsvannprøvene (500 ml hver) for å konsentrere seg direkte ved hjelp av SMF-protokollen16,18, uten forfiltrering med osteklær og membranskivefiltre med lav proteinbinding, som beskrevet nedenfor.
    6. Løs opp 0,5 g skummetmelkpulver i 50 ml syntetisk sjøvann for å oppnå en skummetmelkløsning på 1 % (w/v), og juster oppløsningens pH forsiktig til 3,5 ved bruk av 1 N HCl.
      MERK: Forsuring gjør at virus aggregerer og utfelles vann på grunn av endringen i deres isoelektriske punkt16 og forbedrer løseligheten av melkepulver28.
    7. Tilsett 5 ml skummetmelkoppløsning i 500 ml rå avløpsvannprøver for å oppnå en endelig konsentrasjon skummet melk på 0,01 % (w/v).
    8. Rør prøvene i 8 timer ved middels hastighet og la de dannede flokkene slå seg ned i ytterligere 8 timer ved romtemperatur.
    9. Fjern supernatantene forsiktig ved hjelp av serologiske pipetter uten å forstyrre de avgjorte flokkene. Overfør et endelig volum på 50 ml som inneholder flokkene til sentrifugerør og sentrifuge ved 8000 x g i 30 minutter ved 8 °C.
    10. Skrap forsiktig pellets med en sterilisert slikkepott, og resuspender de resterende pellets i rørene i 250 μL 0,2 M natriumfosfatbuffer (pH 7,5) etter at supernatanten er fjernet. Overfør de skrapte og resuspenderte pellets til de samme 1,5 ml minisentrifugerørene.
  3. Utfør viral RNA-ekstraksjon fra virale konsentrater av avløpsvannprøver og gjenvinningseffektivitetsanalyser ved hjelp av et RNA-ekstraksjonssett med et 25: 24: 1-forhold av fenol: kloroform: isoamylalkohol og β-merkaptoetanol, i henhold til produsentens instruksjoner, for å forbedre ekstraksjonseffektiviteten. Til slutt eluere RNA i 50 μL elueringsbuffer.
  4. Sanntidskvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) analyse
    1. Kvantifiser pansret RNA ved hjelp av ti ganger fortynninger (7,8 x 10,4 til 7,8 genkopier) av en syntetisk enkeltstrenget DNA- eller gBlock-konstruksjon. Se tabell 2 for primere og sondesett som oppdager og kvantifiserer pansret RNA.
    2. Design primer- og sondesett ved hjelp av primerdesignverktøyet29 og målrett mot en 95 bp-region (gBlock-konstruksjon) innenfor det pansrede RNA-genomet.
    3. Hent kalibreringskurver for hver RT-qPCR-kjøring. Inkluder negative kontroller i hver qPCR-kjøring. Kjør standarder, eksempler og ikke-malkontroller i tre eksemplarer.
    4. Forbered hver 10 μL RT-qPCR-blanding i følgende rekkefølge: 2,5 μL 4x masterblanding, 400 nM av hver primer, 200 nM sonde og 2,5 μL mal, samt ultrarent DNAse / RNAse-fritt destillert vann.
    5. Utfør termiske syklusreaksjoner ved 50 °C i 5 minutter, etterfulgt av 45 sykluser på 95 °C i 10 s og 60 °C i 30 s på et sanntids PCR-system. Hvis CT var <40, vurder prøven Armored RNA positiv.
    6. Utfør qPCR- og RT-qPCR-tester ved bruk av bovint serumalbumin med rå kloakkprøver for å vurdere muligheten for hemmere eller forurensninger som humussyrer24. Ingen signifikante forskjeller ble observert mellom prøver med og uten enzymet.
  5. Beregn konsentrasjonene fra standardkurven. Beregn utvinningseffektivitetsprosenten ved å dele den gjenvunnede konsentrasjonen med den piggete konsentrasjonen.
  6. Transformer genkopinumre ved hjelp av logg10-funksjonen for analyse. Kjør en generell lineær modell ved hjelp av et statistisk analyseverktøy på qPCR-dataene. Bruk Tukeys test for å oppdage forskjeller mellom metodene og behandlingene. Ta en p-verdi på 0,05 som minimum signifikansnivå for testen.

2. Filtrering og konsentrasjon av DNA- og RNA-virus for vannbasert epidemiologi

  1. For miljømessig overvannsinnsamling, samle 10 L miljømessige overflatevannprøver og bruk 10 L avioniserte vannprøver for bakgrunnskontroll. Oppbevar alle prøvene i et rom på 4 °C til de behandles innen 24 timer etter prøvetaking.
  2. Utfør konsentrasjon av virus fra miljøprøver med SMF ved å følge trinnene beskrevet nedenfor.
    1. Utfør kapsel- og vakuumfiltrering ved hjelp av høykapasitets grunnvannsprøvetakingskapsler og membranskivefiltre på 0,45 μm, 0,2 μm og 0,1 μm størrelser for å minimere støy under metagenomisk sekvensering, fra større fraksjoner som mikroeukaryoter og bakterier til mindre som virus.
    2. Tilbered en 1 volum volum forflettet skummetmelkløsning i 1,32 liter syntetisk sjøvann med 13,2 g skummetmelkpulver. Juster pH i denne suspensjonen til 3,5 ved bruk av 1 N HCl.
  3. Juster pH i de omgivende overflatevannprøvene til 3,5 ved bruk av 1 N HCl.
  4. Overfør 100 ml av den ferdigflokkulerte syrnede skummetmelkløsningen til 10 l syrnede (pH 3,5) miljøvannprøver (endelig skummetmelkkonsentrasjon på 0,01 % [w/v]).
  5. Bruk en magnetomrører og en magnetisk rørestang til å røre prøvene i 8 timer ved romtemperatur og la flokkene sedimentere ved tyngdekraften i ytterligere 8 timer. Uten å forstyrre flokkene, fjern forsiktig supernatanten ved hjelp av en vakuumpumpe.
  6. Aliquot og balanser de resterende flokkene i henhold til vekten i 50 ml sentrifugerør og spinner dem ned ved 8000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
  7. Kast supernatanten og oppløs den resulterende pelleten (som teoretisk inneholder virus av interesse) i 200 μL med 0,2 M natriumfosfatbuffer.
  8. Behandle den oppløste pelleten med DNase I og RNase A, i henhold til produsentens instruksjoner, for å eliminere fritt DNA og RNA tilstede som kan utfelles samtidig på grunn av settet som brukes til nukleinsyreekstraksjon. Deaktiver DNase I og RNase A ved å følge produsentens instruksjoner.
  9. Ekstraher totale nukleinsyrer fra den oppløste pelleten ved hjelp av et DNA / RNA-ekstraksjonssett, i henhold til produsentens instruksjoner.
  10. Kvantifisere den totale mengden ekstrahert DNA og RNA fra avløpsprøver ved hjelp av et fluorometer. Prøver med konsentrasjoner >1 ng / μL anses som optimale for DNA-kvantifisering og sekvensering.
  11. Utfør qPCR-analyse for å målrette enteriske virus av interesse og sekvensering av høy gjennomstrømning for å identifisere virussamfunnsstrukturen.

3. Direkte utfelling og konsentrasjon av mikrobielle fraksjoner for vannbasert epidemiologi

  1. Samle 2 l vannprøver fra beskyttede og berørte vassdrag. Hvis prøven inneholder en betydelig mengde rusk, bruk en osteklut for å fjerne dem.
    MERK: Det anbefales sterkt å samle inn et biologisk duplikat per prøve.
  2. Tilbered en skummetmelkløsning på 1 % (w/v) ved å løse opp 4,4 g skummetmelkpulver i 440 ml syntetisk sjøvann. Juster pH i denne suspensjonen til 3,5 med 1 N HCl.
  3. Juster pH i ferskvannsprøvene til 3,5 ved bruk av 1 N HCl.
  4. Tilsett 20 ml skummetmelkoppløsning i de tidligere pH-justerte ferskvannsprøvene på 2 l (endelig skummetmelkkonsentrasjon på 0,01 % [u/v]). Rør prøvene ved romtemperatur i 8 timer.
  5. La flokkene sedimentere ved tyngdekraften i ytterligere 8 timer. Fjern forsiktig supernatantene med en peristaltisk pumpe. Overfør de sedimenterte flokkene til et 50 ml sentrifugerør og spinn dem ned ved 8000 x g i 30 minutter.
  6. Kast supernatanten og resuspender pelletsene med 200 mikrol 0,2 M natriumfosfatbuffer. Oppbevar prøvene ved -20 °C eller velg ~0,5 g av flokken for mikrobiell DNA-ekstraksjon ved å bruke det valgte nukleinsyreisolasjonssettet, i henhold til produsentens instruksjoner.
  7. Bestem DNA-nukleinsyrekonsentrasjonen og renheten med et fluorometer med høy følsomhet. Prøver med konsentrasjoner >1 ng/μL bør være optimale for DNA-kvantifisering og sekvensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Evaluering av virale RNA-konsentrasjonsmetoder
Alle seks prøvene behandlet med UF-3k x g var positive og resulterte i en 13,38% ± 8,14% utvinning (figur 1). Bare en prøve var positiv når prøvene ble behandlet med UF-7.5k x g. Alle prøver behandlet med SMF var positive og resulterte i en 15,27% ± 2,65% utvinning (figur 1). Den gjennomsnittlige utvinningsgraden for UF-3K x g og SMF var signifikant og konsekvent (p < 0,0001) høyere enn UF-7.5K x g. På den annen side var det ingen signifikant forskjell (p = 0,6240) mellom utvinningsgraden av UF-3K x g og SMF. Å øke sentrifugeringshastigheten til merke B-sentrifugalenheten til 7,500 x g fra 3,000 x g resulterte i lavere utvinning, sannsynligvis på grunn av passasje av pansret RNA gjennom filtre med økt hastighet og binding av pansrede RNA-partikler på filtrene med økt sentrifugalhastighet. Eliminering av faste partikler med ultrafiltreringsmetoder kan forklare de lavere utvinningsgradene av ultrafiltreringsmetodene mot SMF, med tanke på potensiell partisjonering av pansret RNA til avløpsvannene30. I tillegg er fysisk-kjemiske og biologiske avløpsvannparametere (metadata) oppsummert i tabell 1. Testing av SMF med overflatevann (trinn 2) resulterte i en høyere utvinningsgrad, 42,7% ± 15,1%, noe som indikerer at oppdeling av virusene i faste partikler kan ha påvirket utvinningen betydelig med tanke på lave faste konsentrasjoner i overflatevann.

Seriell filtrering og konsentrasjon av virus
Tabell 3 oppsummerer vannkvalitetsparametrene og nukleinsyrer ekstrahert fra miljøvannprøver samlet inn i Winnipeg over tre sesonger. DNA var kvantifiserbart på alle prøvetakingssteder og på tvers av sesonger. Supplerende figur 1 viser et kart med miljømessige overvannsplasseringer. På den annen side var RNA-verdiene for det meste under deteksjonsgrensen ved bruk av et fluorometer (<0,025 ng / μL). Disse RNA-ekstraktene ble tilfeldig amplifisert for å generere kvantifiserbart cDNA for høykapasitetssekvensering (tabell 3).

Konsentrasjon av mikrobielle fraksjoner fra miljømessige vannprøver
Figur 2 og figur 3 viser arbeidsflyten for metodikk og konsentrasjon av mikrobielle fraksjoner fra miljømessige overvannsprøver. Tabell 4 inneholder gjennomsnittlig DNA-konsentrasjon, standardavvik og miljøforholdene, som pH, temperatur, oppløst oksygen, atmosfærisk trykk, nedbør og dagslystider for prøvetakingsstedene til de beskyttede (skogkledde) og påvirkede (urbane og landbruksmessige) vannveiene analysert i denne undersøkelsen. Prøver ble samlet inn månedlig fra april 2022 til oktober 2022 i urbane og landlige områder rundt byen Portage la Prairie langs Assiniboine-elven i Manitoba, Canada. Den høyeste DNA-konsentrasjonen ble observert i skogsområde 1 og ga 109,35-229,18 ng/μL. På den annen side ble den laveste mikrobielle DNA-konsentrasjonen gjenfunnet fra jordbruksstedet 3 og hadde en gjennomsnittlig konsentrasjon på 19,83-22,05 ng / μL. Gjennomsnittlig DNA-konsentrasjon, standardavvik og metadata for alle prøvene samlet inn fra april til oktober 2022 er oppsummert i tabell 4. DNA-konsentrasjonene som ble oppnådd var optimale for andre nedstrømsapplikasjoner, som inkluderer PCR, qPCR og sekvensering (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1: Prosent gjenvinning og statistisk analyse for hver metode for avløpsvannprøver. Forkortelser: SMF = skummet melkflokkulering; UF-3K x g = ultrafiltrering ved 3,000 x g; UF-7.5K x g = ultrafiltrering ved 7.500 x g. Midler med stjerne (*) indikerer signifikante forskjeller på 0,05-nivået på tvers av behandlinger; n = 6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk fremstilling av metodikken som brukes til å konsentrere og kvantifisere virus fra urbane vannforekomster i Manitoba som mottar avløpsvann. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Grafisk abstrakt av konsentrasjonen av virus, bakterier og mikroeukaryoter for DNA-kvantifisering og sekvensering. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Plassering av 11 miljøvannprøver. Prøver ble samlet langs elvene Red og Assiniboine i Winnipeg, Manitoba, som indikert av de røde prikkene. Winnipegs tre store kloakkrenseanlegg er angitt i blått som et av stedene som ble besøkt, selv om ingen prøvetakingshendelser skjedde. Kildene til dataene er Google maps og Tableau-programvare. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tabell 1: Vannkvalitetsparametere i innflytelsesrike prøver av NESTP, SESTP og WESTP. Forkortelser: NESTP = North End renseanlegg; SESTP = South End renseanlegg; WESTP = West End renseanlegg; MLD = millioner liter per dag; TS = totalt faste stoffer; TSS = totalt suspenderte faste stoffer; BOF5 = 5 dagers biokjemisk oksygenbehov; NH4-N = ammonium-nitrogen; TP = totalt fosfor; TOC = totalt organisk karbon; TN = totalt nitrogen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Primer-/sondesett med RT-qPCR-analyser. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Røde og Assiniboine elver vannkvalitetsparametere under prøveinnsamling om våren 16. mai, sommeren 27. augustog høsten 21. november 2021) og fluorometerkvantifisering av totale nukleinsyrer (DNA og RNA). * Deteksjonsgrensen for RNA-settet er 0,025 ng / μL; ^ Tall representerer områdeverdier. Forkortelser: DO = oppløst oksygen; BOF 5 =5 dagers biokjemisk oksygenbehov; TP = totalt fosfor. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Assiniboine vannkvalitetsparametere under prøveinnsamling (april til oktober 2022). Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et av de kritiske trinnene i denne studien er eliminering av faste partikler ved å påføre et forfiltreringstrinn med 0,2 μm og 0,45 μm membranfiltre. Med tanke på partisjonering av virus i faste partikler, spesielt innkapslede virus, kan forfiltrering forårsake et betydelig tap i viral utvinning30. Mens et forfiltreringstrinn for ultrafiltreringsmetoder nesten alltid er nødvendig for miljø- og avløpsvannprøver for å forhindre at ultrafiltreringsenheter tettes, kan det være nødvendig med forfiltrering for SMF, avhengig av typen nedstrømsanalyse. For målrettede PCR-studier kan det hende at prefiltrering ikke er nødvendig. På den annen side kan forfiltrering forbedre viral metagenomikk betydelig, siden det reduserer bakgrunnsstøyen i viromer fra større fraksjoner som mikroeukaryoter og bakterier. Dette trinnet er kritisk for sekvensering slik at større genomer ikke svermer virussignalet.

Prøvevolumet som kan behandles med sekvensiell ultrafiltrering er begrenset til 140 ml. Dette er en viktig begrensning for prøver med lavt virusantall. På den annen side kan SMF behandle mye større prøvevolumer, noe som øker sannsynligheten for å gjenopprette virus.

SMFs gjenvinningsgrad er i samsvar med andre studier som fokuserer på konsentrasjonen av viruspartikler fra avløpsvann. Tidligere publiserte artikler rapporterte lignende utvinningsgrad med en rekke testvirus. Den rapporterte gjennomsnittlige utvinningsgraden i disse studiene varierte mellom 3,4 % og 14 %13,31,32. Den nåværende metodikken var en del av en annen studie som undersøkte SARS-CoV-2 i avløpsvann i forhold til saksnummer i Winnipeg33. SMF-metoden beskrevet her har også blitt brukt til å screene for SARS-CoV-2 RNA i oksidasjonslaguner fra landlige samfunn i Manitoba i laboratoriet vårt. Nytten av SMF-metoden har også blitt brukt i kombinasjon med seriell filtrering (0,45 μm etterfulgt av 0,2 μm og 0,1 μm) for å karakterisere virussamfunn i ferskvannsprøver fra urbane omgivelser ved bruk av høykapasitetssekvensering i laboratoriet vårt (beskrevet i den andre delen av metodikken). Endelig kan SMF-metoden også brukes til å lede utfelling av mikrobielle samfunn, som mikroeukaryoter, bakterier og virus fra miljøvannprøver, og videre karakterisering ved hjelp av dyp-amplicon-sekvensering av 18S rRNA- og 16S rRNA-gener, samt det viktigste kapsidproteingenet (g23) av virale grupper som T4-lignende virus (Zambrano og Uyaguari-Díaz, upubliserte data). SMF-metoden gjør det mulig å konsentrere de mikrobielle fraksjonene som er tilstede i vannprøver fra store inngangsvolumer (dvs. 10-40 L) til relativt mindre volumer (dvs. 1-5 ml). Som en del av denne metodikken inngår også ultrarent vann som negativ/bakgrunnskontroll. Når de mikrobielle fraksjonene er konsentrert ned, kan nukleinsyreekstraksjon utføres ved hjelp av kommersielle ekstraksjonssett eller interne protokoller. SMF representerer en allsidig, relativt billig og enkel / hands-off metode for å konsentrere mikrobielle fraksjoner eller virale partikler, uten signifikante forskjeller sammenlignet med ultrafiltrering eller tangentiell strømningsfiltreringsmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold som kunne ha syntes å påvirke arbeidet rapportert i denne artikkelen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NSERC Alliance Covid-19 Grant (Award No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan og Uyaguari-Díaz). MUD ønsker å takke University Research Grants Program (Award No. 325201). Både JF og JZA støttes av Visual and Automated Disease Analytics (VADA) graduate training program. KY og JF mottok begge stipend fra Mitacs Accelerate-programmet. MUD og hans laboratoriemedlemmer (KY, JF, JZA) støttes av NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) og Research Manitoba New Investigator Operating grant (No 5385). Spesiell takk til byen Winnipeg, Manitoba. Denne forskningen ble utført ved University of Manitoba. Vi ønsker å erkjenne at University of Manitoba campusene ligger på de opprinnelige landene i Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota og Dene folk og på hjemlandet til Métis Nation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 Alfa Aesar J62041AP Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 66234 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 60043 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444432 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control Asuragen 49650 Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa Pall  OD030C65 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa Pall MCP010C46 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)  Nalgene 3119-0050PK Thermo Fisher Scientific
DNAse I Invitrogen 18047019 Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2 Invitrogen 12027 Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm Pall 12179 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution Thermo Fisher Scientific AC124210025 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit Applied biosystems A42358 Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water Promega P1197 Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump Masterflex, Cole-Parmer instrument 7553-20 Thermo Fisher Scientific
pH meter  Denver instrument RK-59503-25 Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Invitrogen 15593031 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit Qiagen Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A34322 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q33231 Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi Invitrogen Q33238 Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q32855 Thermo Fisher Scientific
RNAse A Invitrogen EN0531 Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit Qiagen 26000-50 Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder Difco (BD Life Sciences) DF0032173 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer Alfa Aesar Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater VWR  RC8363-1 RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4621 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4622 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol Gibco 21985023 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
  2. Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
  3. Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
  4. Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
  5. Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
  6. Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
  7. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  8. Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
  9. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
  10. Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
  11. Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
  12. Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
  13. Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
  14. Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
  15. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
  16. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  17. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
  18. Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  20. Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
  21. Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
  22. Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
  23. Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
  24. Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
  25. Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
  26. Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
  27. Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
  28. Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).
  29. Geneious. , Available from: https://www.geneious.com (2021).
  30. Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
  31. Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
  32. Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
  33. Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 193
Konsentrasjon av viruspartikler fra vann- og avløpsvannprøver i omgivelsene ved bruk av skummetmelkflokkulering og ultrafiltrering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yanaç, K., Francis, J.,… More

Yanaç, K., Francis, J., Zambrano-Alvarado, J., Yuan, Q., Uyaguari-Díaz, M. Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration. J. Vis. Exp. (193), e65058, doi:10.3791/65058 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter