Fabrikasjon av pulsatile polymere mikropartikler som innkapsler rabiesantigen

Summary

Denne metoden beskriver innkapsling av rabiesantigenet i biologisk nedbrytbare polymere mikropartikler med strukturelle og materielle egenskaper som muliggjør pulsatil frigjøring etter en forhåndsbestemt forsinkelse. Enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) vurdering av antigenet hentet fra partikkelkjernen bekrefter tilstedeværelsen av intakt trimerisk rabiesvirus glykoprotein gjennom partikkelfabrikasjon.

Abstract

De nåværende retningslinjene for rabies posteksponeringsprofylakse krever flere injeksjoner administrert over flere uker. Dette kan være uforholdsmessig belastende for de som bor i lav- og mellominntektsland (LMICs), hvor flertallet av dødelige eksponeringer for rabies forekommer. Ulike legemiddelleveringsstrategier har blitt utforsket for å kondensere vaksineregimer til en enkelt injeksjon ved å innkapsle antigener i polymere partikler. Imidlertid kan sterke stressorer under innkapslingsprosessen forårsake denaturering av det innkapslede antigenet. Denne artikkelen beskriver en metode for innkapsling av rabiesvirusantigenet (RABV) i polymere mikropartikler som utviser justerbar pulsatil frigjøring. Denne metoden, kalt Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED), genererer mikropartikler ved hjelp av myk litografi for å lage inverse polydimetylsiloksan (PDMS) former fra en multi-foton, 3D-trykt master mold. Poly (melkesyre-co-glykolsyre) (PLGA) filmer blir deretter kompresjonsstøpt inn i PDMS-formene for å generere åpne sylindere som er fylt med konsentrert RABV ved hjelp av en piezoelektrisk dispenseringsrobot. Disse mikrostrukturene blir deretter forseglet ved å varme opp toppen av partiklene, slik at materialet kan strømme og danne en kontinuerlig, ikke-porøs polymerbarriere. Etter fabrikasjon brukes en enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) som er spesifikk for påvisning av intakt trimerisk rabiesvirusglykoprotein, for å bekrefte høy utvinning av immunogent antigen fra mikropartiklene.

Introduction

Vaksinasjon er et ekstremt effektivt helseverktøy, etter å ha forhindret mer enn 37 millioner dødsfall mellom 2000 og 2019¹. Til tross for denne effektiviteten fortsetter vaksineforebyggende sykdommer å utgjøre en betydelig risiko for global helse, spesielt i lav- og mellominntektsland (LMICs) hvor høye forekomster av ikke- og undervaksinasjon bidrar til 1,5 millioner vaksineforebyggbare dødsfall årlig². Rabies er ikke noe unntak fra disse forskjellene. Til tross for sin status som den mest dødelige sykdommen som er kjent for menneskeheten, er nesten universelt dødelig, er rabies fullt behandlingsbar og er klassifisert som utryddet i mange høyinntektsland. I stedet bæres byrden av rabies uforholdsmessig av mennesker som bor i deler av Asia og Afrika, hvor sykdommen har ødeleggende utfall på mennesker og husdyr ^3,4.

Vaksinasjon er avgjørende for å håndtere den globale effekten av rabies⁵. Kostnaden for vaksinasjon forbyr utbredt implementering av preeksponeringsprofylakse (PrEP), med tanke på den generelle lave forekomsten av sykdommen. Videre er nytten av posteksponeringsprofylakse (PEP) i LMICs begrenset av sosioøkonomisk press på pasienter som søker helsetjenester. Logistiske faktorer, som reiseavstand til tilgangspunkter for helsetjenester, tapt lønn under behandling, behandlingskostnader, avtaler som forstyrrer daglige aktiviteter og glemsomhet, resulterer i PEP-etterlevelsesrater så lave som 60 %^6,7. Denne høye pasientslitasjen gir en mulighet for raffinering av tilnærminger for å løse hull i rabiesvaccinering for å bekjempe sykdommen.

Enkeltinjeksjon (SI) vaksinasjonssystemer som kontrollerer frigjøring av antigener har blitt utforsket som måter å oppnå full immunisering i en injeksjon. Eliminering av behovet for flere besøk til helsepersonell reduserer byrdene som hindrer enkeltpersoner i å søke tilstrekkelig omsorg. For å oppnå SI-vaksinasjon er et antigen vanligvis innkapslet i en biologisk nedbrytbar polymer matriks som ofte tar form av injiserbare mikropartikler. Når den er injisert, nedbryter polymeren og frigjør det sekvestrerte antigenet. Hittil har to primære frigjøringsstrategier blitt fulgt for å oppnå SI-vaksinasjon. I en tilnærming frigjøres antigenet kontinuerlig over en lengre periode. Selv om det er ment å øke immunogeniteten til en enkelt injeksjon, er det uklart om denne tilnærmingen er tilstrekkelig til å fremkalle en beskyttende immunrespons mot rabiesvirus (RABV) hos mennesker⁸. I den andre frigjøres antigenet etter en forhåndsbestemt forsinkelse for å etterligne et konvensjonelt og bevist prime-boost-vaksineregime. Spraytørking og emulsjon / løsningsmiddelfordampningsbaserte mikropartikkelfabrikasjonsmetoder viser den tidligere strategien, og har blitt brukt til å innkapsle både modellvaksiner⁹ og svært stabile antigener, som tetanustoksoid¹⁰. Imidlertid involverer disse innkapslingsmetodene stressorer, inkludert varme, løsningsmiddelinteraksjon og fysiske krefter, som kan denaturere antigener¹¹.

Partikler Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED) er en nylig utviklet fabrikasjonsmetode som kan brukes til å kapsle inn biologiske legemidler i biologisk nedbrytbare mikropartikler. Mikromolding brukes til å generere partikler som er fylt med flytende nyttelast og oppvarmet for å tillate polymeren å flyte og fullstendig innkapsle det sentrale lastdepotet i et sammenhengende lag av den biologisk nedbrytbare polymeren. Denne mikrostrukturen resulterer i pulsatil frigjøring av nyttelasten, etter en varighet som er avhengig av nedbrytningshastigheten til det polymere skallet¹². Dette manuskriptet demonstrerer innkapslingen av inaktivert RABV i mikropartikler sammensatt av poly (melkesyre-co-glykolsyre) (PLGA), en biologisk nedbrytbar polymer brukt i mange FDA-godkjente formuleringer¹³, ved bruk av PULSED-fabrikasjonsmetoden for å innkapsle stabilt RABV-antigen som evaluert av en enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). Ved å kombinere PLGA-partikler med forskjellig molekylvekt og / eller sluttgrupper, har denne tilnærmingen potensial til å etterligne det nåværende rabiesvaksinasjonstidsforløpet etter en enkelt injeksjon.

Protocol

1. Partikkelmester mold generasjon

MERK: 3D-utskriftsprosessen kan utføres med hvilken som helst 3D-skriver med tilstrekkelig romlig oppløsning; Den nåværende protokollen beskriver imidlertid prosessen for en multi-foton 3D-skriver.

1. Design mikropartikkelstrukturer ved hjelp av et dataassistert design (CAD) -program.
   MERK: Designspesifikasjonene er som følger: 308 partikler (diameter = 400 μm, høyde = 500 μm og veggtykkelse = 100 μm) er ordnet i en 22 til 14-matrise, med 600 μm avstand mellom dem. Designet inneholder også en firetagget stjerne og en femkantet stjerne som fiducials umiddelbart utenfor matrisen (tilleggsfigur 1).
2. Eksporter det endelige designet som en STL-fil (tilleggskodingsfil 1) og last opp filen til programvare som kan definere utskriftsparametrene som vist nedenfor. Deretter lagrer du den som en fil som er kompatibel med 3D-skriveren (se Materialfortegnelse).
   MERK: Skjæreavstand = 5 μm, klekkeavstand = 1 μm, skallkontur = 50 μm, antall basisskiver = 5 μm, stillas = hul, skannemodus = galvo, z-akse = mikroskop z-stasjon, skannehastighet = 100 000, effekt = 100.
3. Forbehandle et silisiumtrykksubstrat (se materialtabell) ved hjelp av en plasmarenseprosess (gass: O₂; effekt: 200 watt; temperatur: 25 ° C; strømning: 20; tid: 5 min), og senk deretter substratet umiddelbart i en løsning av 30 ml etanol og 60 μl 3- (trimetoksysilyl) propylmetakrylat i et glass petriskål. Dekk til med aluminiumsfolie og la det ruge over natten.
   MERK: Dette trinnet øker utskriftsvedheftet til underlaget, noe som er viktig under PDMS-separasjon (trinn 2.6).
4. Last opp utskriftsfilen til 3D-skriveren med flere fotoner, påfør utskriftsharpiksen på det behandlede underlaget, legg 10x-linsen (se materialfortegnelse) og skriv ut mikrostrukturene.
5. Når du er ferdig, senk trykket i propylenglykolmetyleter acetat (se materialfortegnelsen) i 45 minutter for å fjerne ueksponert fotoresist, og senk deretter trykket i isopropylalkohol i 5 minutter. Etterherding av hovedformen ved å utsette den for UV-lys ved 254 nm i 120 minutter.
   MERK: Hvis tilgjengelig, kan UV-lys i området 405 til 365 nm brukes i ~ 20 minutter for å etterherde de trykte strukturene.

2. Polydimetylsiloksan (PDMS) mugggenerering

1. Behandle overflaten av den 3D-printede hovedformen ved å plassere den i et vakuumkammer som inneholder et glassglass med 40 μL triklor (1H, 1H, 2H, 2H, -perfluoroktyl) (se materialtabell) silan tilsatt overflaten. Trekk vakuumet (relativt trykk: -20 tommer. Hg) i 1 time.
   MERK: Dette trinnet sikrer enkel separasjon ved demolding (trinn 2.6).
2. Mens hovedformoverflaten blir behandlet, bland grundig polydimetylsiloksan (PDMS) prepolymerbasen med PDMS-prepolymerherdemiddelet i et masseforhold på 9: 1 (minst 10 g materiale er nødvendig for hver hovedform). Når den er grundig blandet, overfør den uherdede PDMS til et 50 ml sentrifugerør og sentrifuge ved 300 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
3. Når overflatebehandlingen er fullført, plasser hovedformen i en aluminiumsfolieform og hell den uherdede PDMS på toppen av formen, slik at funksjonene er helt nedsenket. Plasser aluminiumsfoliefatet i et vakuumkammer og trekk vakuumet (relativt trykk: -20 tommer. Hg) i 1 time for å fjerne luftbobler.
4. Fjern aluminiumsfoliefatet fra vakuumkammeret. Plasser 800 μm avstandsstykker i enden av hovedformen og legg en ren glasssklie på hovedformen, pass på at du ikke introduserer luftbobler. Bruk bindeklips til å klemme formen og lysbildet sammen, og lokaliser klemkraften over avstandsstykkene (tilleggsfigur 2).
5. Plasser strukturen i en ovn satt til 120 ° C i minst 4 timer for å herde prepolymeren i PDMS-former.
6. Fjern strukturen fra ovnen, slipp bindeklipsene forsiktig og skill hovedformen forsiktig fra den herdede PDMS-formen ved hjelp av et barberblad.
   MERK: Den 3D-printede hovedformen kan brukes på nytt for å generere flere PDMS-former.

3. PLGA filmfabrikasjon

1. Vei ut 450 mg PLGA (se materialfortegnelse) og legg den på en 76 mm x 76 mm nonstick polymerplate innenfor et 250 μm tykt ringavlegg, med en indre diameter på 50,8 mm. Plasser en annen nonstick-polymerplate over PLGA og komprimer stakken mellom to aluminiumsblokker ved hjelp av en 101,6 mm c-klemme til fingertett.
   MERK: 502H PLGA ble brukt utelukkende i denne studien; Andre typer PLGA er imidlertid kompatible med denne prosessen.
2. Plasser den c-klemte enheten i en vakuumovn satt til 120 °C i 30 minutter under vakuum, med et relativt trykk på -30 tommer. Fjern deretter enheten og stram klemmen godt før du setter den tilbake i vakuumovnen i ytterligere 30 minutter.
   MERK: Hovedformålet med å bruke vakuum er å unngå PLGA-nedbrytning, som akselereres ved høye temperaturer.
3. Fjern enheten fra ovnen og la den avkjøles i 4 timer i en tørketromme.
4. Når den er avkjølt, løsne klemmen, fjern PLGA-filmen fra nonstick-polymerarkene og legg filmen i en merket petriskål. Oppbevar petriskålen i en tørketrommel for senere bruk.

4. Generering av PLGA-partikler

1. Behandle overflaten på PDMS-formen som beskrevet tidligere i trinn 2.1.
2. Bruk pinsett og/eller en skalpell, kutt ut og plasser en del av 250 μm PLGA-filmen, omtrent på størrelse med matrisen, på den behandlede PDMS-formen.
3. Overlegg et lysbilde med rent glassmikroskop på toppen av PLGA-filmen og PDMS-formen og klem komponentene sammen ved å plassere en fjærklemme rett over arrayet og PLGA-filmen.
4. Plasser den klemte formenheten i vakuumovnen satt til 120 °C, og trekk vakuumet med et relativt trykk på -30 tommer. Hg i 1 time.
   MERK: Tiden det tar å danne partiklene avhenger av PLGA, og kan variere fra 1-12 timer.
5. Fjern den klemte formenheten fra ovnen og la den passivt avkjøles ved romtemperatur i ca. 15 minutter, eller til den er avkjølt til berøring.
6. Bruk et barberblad, påfør forsiktig trykk mellom PDMS-formen og PLGA-partikkelgruppen for å skille de to. Oppbevar PLGA-partiklene i en tørkemaskin for fremtidig bruk.

5. Antigenkonsentrasjon og rensing

1. Tine én alikot av kommersielt tilgjengelig RABV-antigen (se materialfortegnelsen) ved romtemperatur.
2. Monter filtreringsoppsettet ved å plassere to sentrifugale spinnfiltre med en 100 kDa molekylvektgrense (MWCO; se materialfortegnelse) i to oppsamlingsrør.
3. Forvåt de to sentrifugalfiltrene ved å tilsette 500 μL UltraPure-vann.
4. Spinn filtrene ved 2,400 x g i 1 min i en stasjonær sentrifuge ved romtemperatur.
5. Fjern vannet fra både topp- og bunnrommene i filtreringsoppsettet ved hjelp av en 200 μL pipette.
   NOTAT: Ikke la det forwetted sentrifugeringsfilteret tørke ut.
6. Tilsett 400 μL destillert vann til det øverste rommet i hvert spinnfilter, tilsett deretter 100 μL av det tinte RABV-antigenet og bland med pipetten.
   MERK: Denne studien konsentrerte antigenet omtrent fem ganger og reduserte konsentrasjonen av hjelpestoffer <100 kDa med ~ 50 ganger.
7. Legg de to sentrifugale spinnfiltrene i en stasjonær sentrifuge, slik at filtrene vender mot sentrum av sentrifugen. Merk hvilken side av filteret som vender mot midten av sentrifugen.
   MERK: Hvis de er feilorientert, vil løsningene ikke bli filtrert / konsentrert riktig.
8. Sentrifuger filtrene ved 14 000 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
9. Hent filtrene fra sentrifugen. Oppsamlingsrørene vil inneholde filtratet, mens filtrene vil inneholde den konsentrerte prøven (tilleggsfigur 3A).
10. Fjern filtratet i oppsamlingsrørene ved hjelp av en pipette og kast.
11. Tilsett 450 μL filtrert destillert vann til hvert filter, og bland konsentrert prøve og vann ved å pipetere opp og ned seks ganger.
12. Sentrifuger de to spinnfiltrene en gang til ved 14 000 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Forsikre deg om at filtrene vender mot midten av sentrifugen i samme retning som i trinn 5.7.
13. Hent filterenhetene fra sentrifugen, og akkurat som før, fjern og kast filtratet fra hvert rør ved hjelp av en pipette.
14. Fjern sentrifugeringsfiltrene fra oppsamlingsrørene og sett lokk på filterhusene med toppen av oppsamlingsrørene (tilleggsfigur 3B).
15. Plasser bunnen av spinnfilterhuset direkte på en virvel og virvel ved 3000 o / min i 30 sekunder mens du holder filterhuset oppreist og i 45 ° vinkler (tilleggsfigur 3C).
    MERK: Dette trinnet er ment å resuspendere ethvert RABV-antigen som dannet en pellet under sentrifugeringsprosessen.
16. Fjern forsiktig hetten på oppsamlingsrørene fra spinnfilterhuset. Plasser filterhuset tilbake i de medfølgende oppsamlingsrørene og kjør et raskt spinn (2-3 s) for å samle opp volum som kan ha blitt fanget i lokket.
    MERK: Dette raske spinnet må utføres i en stasjonær mikrosentrifuge. Filtrene skal være tangentielle til sentrifugen, motsatt av forrige konfigurasjon, for å sikre at ingen løsning går tapt gjennom filtrene.
17. Inverter hver spinnfilterenhet til et nytt oppsamlingsrør som følger med sentrifugeringsfiltersettet (se materialfortegnelse), og sentrifuge i 2 minutter ved 1000 x g ved romtemperatur for å samle de konsentrerte prøvene.
18. Konsolider de konsentrerte prøvene fra de to oppsamlingsrørene i ett oppsamlingsrør. Mål og registrer det resulterende volumet.
    MERK: Den resulterende prøven vil ha 5x den opprinnelige antigenkonsentrasjonen som lager, ha en liten hjelpestoffkonsentrasjon (<100 kDa) omtrent 50 ganger lavere enn stambenet, og virke litt melkehvit. Det totale volumet skal være omtrent 44-48 μL.
19. Oppbevar det 5x konsentrerte, to ganger vaskede antigenet ved 4 °C til tidspunktet for dispensering, men ikke lenger enn 16 timer. Før du fyller partikler med denne løsningen, sentrifugerer røret ved 1000 x g i 1 min for å fjerne eventuelle bobler. Oppløsningen kan fortynnes med destillert vann for å oppnå den nominelle målkonsentrasjonen for dispensering.

6. Partikkelfylling

1. Vakuumfilter 500 ml avionisert vann gjennom et 0,22 μm vakuumfilter, og avgass deretter løsningen ved å påføre et vakuum (relativt trykk: -20 tommer. Hg) mens du er under sonikering i 20 minutter.
2. I løpet av denne tiden fester du piezodispenserkapillærene (PDC; se materialfortegnelse) til den piezoelektriske dispenseren.
3. Klargjør maskinen i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialfortegnelse), og plasser lysbildet med PLGA-partiklene i dispenseringsområdet.
4. Sett opp "Finn målreferansepunkter", kjør, og sett deretter opp "Target Substrate", i henhold til tilleggsfigur 4.
5. Legg 25 μL av det konsentrerte antigenet inn i kildeplaten og legg det inn i maskinen. Bruk PDC-ene til å aspirere 10 mikrol konsentrert antigen inn i påføringsspissen, vask utsiden av spissen og kalibrer deretter påføringsjusteringen (tilleggsfigur 5).
6. Skriv inn "Target Setup parameters" og klikk på Run (tilleggsfigur 6).
7. Når du er ferdig, fjern de fylte partiklene og kontroller at de er fylt under et stereoskop.
8. Gå direkte til neste trinn i protokollen.

7. Partikkelforsegling og høsting

1. Plasser en blokk i rustfritt stål (se Materialfortegnelse) på en kokeplate. Plasser to mikroskopglass på rustfritt stålblokken slik at de er parallelle. Forsikre deg om at blokken i rustfritt stål er i vater, slå deretter på kokeplaten og still inn temperaturen slik at overflatetemperaturen på det rustfrie stålet er 200 °C. Kontroller temperaturen på kokeplaten før forsegling.
2. Heng de fylte PLGA-partiklene over kokeplaten ved å plassere dem på de to glasslysbildene, og start deretter en timer umiddelbart i 18 s.
   MERK: Hvor lang tid og varme partikler må forsegle vil variere avhengig av de kjemiske egenskapene til PLGA som brukes til å lage partiklene. En tilpasset 3D-printet lysbildeholder kan brukes til å håndtere lysbildene på sikker avstand fra kokeplaten. STL-filen leveres som tilleggskodingsfil 2.
3. Når den er forseglet, fjern partikkelmatrisen fra kokeplaten og heng den over laboratoriebenken ved å plassere partikkelmatrisen på to separate glasslysbilder. La partiklene avkjøles i 1 min.
4. Når de er avkjølt, kan partiklene høstes ved hjelp av en skalpell mens du ser gjennom et stereoskop. Hold skalpellen med bladet i en 45° vinkel mot lysbildet og trykk på bunnen av partikkelen for å skille den fra glassglasset.
5. Når de er høstet, bruk skalpellen til å overføre partiklene til 0,5 ml lavproteinbindingsrør (se materialtabell). Fyll deretter rørene med 250 μL av en 1x fosfatbufferløsning (PBS) inneholdende 30 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) og 1 mg/ml glukose.
   MERK: 30 mg/ml BSA og 1 mg/ml glukoseoppløsning tilberedt i PBS vil opprettholde stabiliteten til RABV-antigenet.
6. Knus partiklene under et stereoskop ved hjelp av en pinsett med finspiss. Forsikre deg om at RABV-antigenet i kjernen av partikkelen er tilgjengelig for oppløsning i den omkringliggende løsningen. Oppbevar prøvene i et kjøleskap på 4 °C til antigenstyrken kan evalueres ved hjelp av en ELISA. Prøver må kjøres på en ELSIA innen 7 dager etter tilberedning.

8. Evaluering av antigenet av ELISA

FORSIKTIG: Ikke la mikroplatene tørke ut på noe tidspunkt. Stable alltid tallerkener, og dekk alltid den øvre platen med en plastforsegling, en tom plate eller et lokk for å unngå å tørke ut.

1. Klargjør bufferne som beskrevet i tilleggsfil 1.
2. Forbered 5 ml beleggoppløsning (karbonat-bikarbonatbuffer, pH 9,6) ved en konsentrasjon på 2,5 μg / ml ved å tilsette 25 μL beleggantistoff til 4975 μL beleggbuffer ved pH 9,4-9,6.
   MERK: 5 ml er nødvendig for å belegge 96 brønner med 50 μL hver (med ekstra volum for pipetteringstap). Øk totalvolumet med 5 ml for hver ekstra ELISA-plate som trengs.
3. Bruk en flerkanalspipett til å dispensere 50 μL av beleggløsningen i hver brønn på mikroplaten. Løsningen må brukes til belegg umiddelbart etter at den er tilberedt.
4. Trykk forsiktig langs platekantene på en hansket håndflate for å sikre at bunnen av hver brønn er jevnt dekket med væske.
5. Forsegl platen med selvklebende film og plasser den ved 37 °C i 1 time, før den deretter overføres til 4 °C over natten.
6. Hent platene fra kjølelager og vask dem tre ganger med 200 μL vaskebuffer i hver brønn.
7. Fjern vaskebufferen og dispenser 300 μL blokkeringsbuffer i hver brønn.
   FORSIKTIG: Når du kjører flere plater med de samme prøvene gjentatt på forskjellige plater, er det viktig å fortsette plate-for-plate (dvs. fylle plate 1 med materialet før du fortsetter til plate 2, og deretter til plate 3 og så videre). Ikke påfør materiale X på alle plater og deretter materiale Y osv., da dette vil øke risikoen for at brønner tørker ut. Etter det siste vasketrinnet skal vaskebufferen forbli i brønnene på platen og bare kastes umiddelbart før du legger prøver på platen. Et plast 96-brønns platelokk må brukes til å dekke alle brønner på ELISA-platen som ikke blir dispensert med en gang, og lokket flyttes sekvensielt for å avsløre flere brønner som skal fylles med materiale.
8. Forsegl platene med en selvklebende plastfilm (se materialfortegnelse) og legg dem i en inkubator i 60 ± 5 minutter ved 37 ± 2 °C.
9. Forbered standardkurven og testprøver som skal evalueres under denne inkubasjonen.
   MERK: Antigenet som evalueres må fortynnes i fortynningsvæskebuffer ved en anbefalt fortynning på 0,125 IE/ml, med et overskuddsvolum på minst 40 μL for å ta hensyn til pipetteringstap. Alle prøvene evalueres i duplikater (to tekniske replikater) på hver ELISA-plate. For standardkurven skal en todelt fortynningsserie for totalt åtte punkter inkluderes i kolonne 2 og 3 i hver ELISA-plate. En fortynningsserie kan utføres for alle andre prøver med et passende antall punkter basert på den forventede mengden antigen som evalueres. Selv om det er mindre strengt for høyere gjennomstrømning, kan en enkelt prøvefortynning brukes som et alternativ til pletteringen beskrevet ovenfor. Den forventede konsentrasjonen av en enkelt fortynning må imidlertid falle innenfor standard kurveområde.
10. I lavbindende protein 96-brønnsplater, eller lavbindende proteinrør (se materialtabell), utfør en todelt fortynningsserie av hver prøve langs kolonnene på platen.
11. Legg starten av fortynningsserien i rad A for hver respektive prøve ved dobbelt så mye som det endelige volumet som kreves (per plate kreves 100 μL prøve per brønn, så alle brønner i A2-A11 bør inneholde minst 240 μL av en prøve, med et ekstra volum på 40 μL for å ta hensyn til pipetteringstap).
12. Legg 120 μL fortynningsbuffer inn i alle andre brønner på den lavbindende proteinplaten, unntatt kolonne 1 og 12 (dvs. B2 til H11).
13. Bruk en flerkanalspipett lastet med 10 spisser, og utfør seriefortynning ved å overføre 120 μl prøve fra A2-A11 til B2-B11 og pipettere opp og ned flere ganger for å blande samtidig som du unngår sprut og bobler. Gjenta denne prosessen, flytt ned platen langs kolonnene til brønnene H2-H11. Kast det gjenværende 120 μL volumet aspirert fra den siste raden med brønner.
    MERK: Prøvene er nå klare for analyse. Hvis blokkeringsfasen ikke er fullført på dette tidspunktet, må du sørge for at prøvene holdes på is.
14. På slutten av inkubasjonstrinnet vaskes platene tre ganger med 200 μL vaskebuffer.
15. Bruk en flerkanalspipette til å overføre 100 μL fortynningsbuffer til kolonne 1 og 12 som "tomme felt".
16. Bruk en flerkanalspipette til å overføre 100 μL fra hver brønn i den lavbindende proteinplaten 96-brønn som inneholder prøvefortynninger til den vaskede ELISA-platen. Gjenta for alle ELISA-plater som kjøres.
17. Forsegl platene med en selvklebende plastfilm og legg dem i en inkubator i 60 ± 5 minutter ved 37 ± 2 °C.
18. Klargjør deteksjonsantistoffoppløsningen (se materialtabellen) ved en konsentrasjon på 0,2 μg/ml ved å tilsette 4,4 μl av antistoffoppløsningen til 10 995,6 μl fortynningsbuffer og bland godt ved å pipetere opp og ned.
    MERK: Totalt 11 ml er nødvendig for 96 brønner ved 100 μL hver (med ekstra volum for pipetteringstap). Øk totalvolumet med 11 ml for hver ekstra ELISA-plate som evalueres. Oppløsningen må brukes umiddelbart etter tilberedning.
19. På slutten av inkubasjonstrinnet vaskes platene fem ganger med 200 μL vaskebuffer.
20. Aspirer den gjenværende vaskebufferen og dispenser 100 μL av deteksjonsantistoffoppløsningen i hver brønn på mikroplaten ved hjelp av en flerkanalspipett.
21. Forsegl platene med en selvklebende plastfilm og legg dem i en inkubator i 60 ± 5 minutter ved 37 ± 2 °C.
22. Forbered konjugatet mot slutten av deteksjonsantistoffinkubasjonstrinnet ved å tilsette 4,4 μL streptapavidin-peroksidase-konjugatløsning (se materialtabell) til 10 995,6 μL vaskebuffer.
    MERK: Totalt 11 ml er nødvendig for 96 brønner ved 100 μL hver (med ekstra volum for flerkanalspipettering). Øk totalvolumet med 11 ml for hver ekstra ELISA-plate som evalueres.
23. Vask platene fem ganger med 200 μL vaskebuffer.
24. Aspirer den gjenværende vaskebufferen og dispenser 100 μL av konjugatoppløsningen til hver brønn.
25. Forsegl platene med en selvklebende plastfilm og legg dem i en 37 °C inkubator i 60 ± 5 minutter ved 37 ± 2 °C.
26. Forbered underlaget under det siste vasketrinnet i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse). Oppløs en tablett o-fenylendiamindihydroklorid (OPD; se materialfortegnelse) i 9 ml avionisert vann i mørket, og fyll deretter opp med 1 ml 10x stabil peroksidbuffer. Juster antall tabletter og totalt volum oppløsning (10 ml) i henhold til antall plater som vurderes.
27. Vask platene fem ganger med 200 μL vaskebuffer.
28. Dispenser 100 μL av substratet til hver brønn ved hjelp av en flerkanalspipettte.
29. Forsegl platene med en selvklebende plastfilm og la dem stå på benken i 10-20 min, beskyttet mot lys, ved bruk av aluminiumsfolie.
    MERK: Overvåk fargeutviklingen visuelt for å unngå metning.
30. Tilsett 50 μL stoppoppløsning til hver brønn og leseplaten umiddelbart for absorbans ved 492 nm og en referanseabsorbans på 620 nm.
31. Analyser dataene ved hjelp av den korrigerte absorbansavlesningen (avlesning ved 492 nm minus avlesningen ved 620 nm) og trekk gjennomsnittet av blankt fra alle prøver. Bruk en sigmoidal 4PL interpolasjonsmetode for å konvertere absorbansverdier til IE / ml. Til slutt, multipliser med 250 μL (totalt prøvevolum) for å konvertere til IE.
    MERK: Denne analysen kan gjøres ved hjelp av dataanalyseprogramvare.

Representative Results

Partikkelforsegling og fylling er to av de mest kritiske trinnene i denne protokollen. Partikler ble fylt med fluoresceinnatriumsalt for å demonstrere ideell fylling og noen vanlige feil. Fluoresceinnatriumsalt ble brukt i stedet for RABV-antigenet for enkel visualisering. Under fylling er det viktig å dispensere oppløsningen i bunnen av partikkelkjerner, og deretter la det være nok tid til at løsningsmidlet/vannet fordamper. Når det er fullført, forblir et depot av løsemiddelet i bunnen av partikkelkjernen (figur 1A). Når de er fylt, er det viktig å forsegle partiklene riktig. Figur 1B viser flere resultater (vellykkede og mislykkede) av forseglingsprosessen. Etter 12 s forseglingstid gjenstår en tydelig vei fra partikkelsenteret til utsiden av partikkelen, noe som viser en partikkel som ikke er helt forseglet. Omvendt, hvis den får forsegle i 36 s, smelter PLGA nesten helt, noe som resulterer i en mikrostruktur med en grunn profil. Den ideelle morfologien kan visualiseres når partikler er forseglet i 18 og 24 s, da de inneholder last helt innkapslet av polymeren samtidig som de opprettholder en partikkelstruktur. Figur 1C viser flere potensielle utfall etter fylling og forsegling. Under dispensering, hvis løsningsmidlet ikke når partikkelbunnen, etterlater det løsemiddel tørket i midten av partikkelkjernen (feil fylt); Selv om disse partiklene fortsatt kan tette, kan dårlig lasting av last begrense lasteeffektiviteten. Hvis partikler fylles med for mye last (overfylt), hemmes forseglingsprosessen, da lasten forhindrer PLGA i å strømme over åpningen. Når de er riktig fylt og forseglet, er partikler av denne geometrien små nok til å passe lett inn i en 19 G nål. Videre strømmet 10 partikler konsekvent gjennom en 19 G nål (100 % ± 0 %) når de ble injisert med en tyktflytende løsning som 2 % karboksymetylcellulose (tilleggsfigur 7).

Figur 1: Vanlige problemer med fyllings- og forseglingsprosessen . (A) Bilder viser fordampning av løsningsmiddel etter en fyllingssyklus, hvor partikler lastes med 6 nL 100 mg/ml fluoresceinnatriumsalt oppløst i vann. (B) Representative bilder av 502H PLGA-partikler fjernet fra forseglingsprosessen ved 0, 12, 18, 24 og 36 s. (C) Ulike utfall av forseglingsprosessen når partikler fylles riktig, feil eller overfylles. Bilder genereres ved at fokus stabler flere bilder og slår dem sammen ved hjelp av programvare for fokusstabling. Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Behandling av antigenet gjennom et spinnfilter før det legges inn i partiklene er viktig av to grunner. For det første tjener sentrifugeringen til å fjerne stamstoffer i vaksineløsningen, som kan begrense partikkelbelastningskapasiteten samtidig som RABV-antigenet beholdes. Den nåværende protokollen renser antigenet med omtrent 50 ganger. For det andre er antigenet også konsentrert under denne prosessen. Figur 2A viser mikrografi av intakte RABV-virioner i konsentrert antigenprøve. Dette antigenet er ca. 4,4 ganger mer konsentrert enn startløsningen (figur 2B). Mengden antigen som opprinnelig ble lastet inn i sentrifugalspinnfiltrene, kan endres for å modulere den endelige foldkonsentrasjonen som oppnås. For eksempel resulterer lasting av 40 μL stamantigen i en omtrentlig 1,75 ganger konsentrasjon. Tilleggsfigur 8 viser betydningen av vortexing (trinn 5.15) i konsentrasjonsprosessen. Forsømmelse av å virvel eller feilaktig vortexing prøvene begrenser konsentrasjonsprosessen.

Figur 2: Antigenkonsentrasjon. Konsentrasjonen av antigen ved sentrifugalfiltrering vist ved transmisjonselektronmikroskopi (A) og bekreftet av ELISA (B). Feilfelt angir standardavviket. Statistisk analyse gjøres ved hjelp av Tukeys flere sammenligningstester med enveis ANOVA. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3A viser konsentrert antigen fylt i uforseglede og forseglede partikler. Selv om en betydelig mengde antigen lastes inn i partiklene (0,0469 ± 0,0086 IE), utgjør dette materialet <90% av partikkelkapasiteten, noe som gir god plass til lasting av ytterligere antigen. Interessant nok inneholder uforseglede partikler bare 0,0396 ± 0,0077 IE, som bare utgjør 85% ± 16% av den totale mengden lastet. Selv om det er et statistisk ubetydelig tap, kan noe av RABV-antigenet ha denaturert under gjentatt rehydrering og tørking i fyllingsprosessen. Etter forsegling forblir 69% ± 5% av antigenet innkapslet i bioaktiv form. Selv om dette antyder at det oppstår betydelig tap under forseglingsprosessen på grunn av termisk stress, forblir det meste av det inaktiverte virale antigenet intakt (figur 3B). Co-innkapsling av stabiliserende hjelpestoffer sammen med antigenet er en mulig strategi for ytterligere å øke antigenstabiliteten gjennom fabrikasjonsprosessen, og har tidligere vært vellykket med andre inaktiverte virusantigener^14,15.

Figur 3: Bioaktivt RABV-antigen etter partikkelfabrikasjon . (A) Bilder viser uforseglede og forseglede partikler som inneholder RABV-antigenet. (B) Antigenstabilitet gjennom partikkelfabrikasjonsprosessen (n = 4). Lastkontroll genereres ved å dispensere antigenet direkte inn i løsningen. Feilfelt angir standardavviket. Skala bar = 200 μm. Statistisk analyse gjøres ved hjelp av Tukeys flere sammenligningstester med enveis ANOVA. *p < 0,05. Bilder genereres ved at fokus stabler flere bilder og slår dem sammen ved hjelp av programvare for fokusstabling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Partikkel-, fiducial- og array-dimensjoner. Figuren viser de geometriske egenskapene til den firetaggede stjernefiducialen (A), den sylindriske mikropartikkelen (B), den femkantede stjernefiducialen (C) og en rekke partikler med fiducials (D) vist i CAD-programvaren. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Denne figuren viser et tverrsnitt av strukturen plassert i ovnen for å herde PDMS-former. Pilene indikerer hvor bindemiddelklemmer er påført. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 3: Riktig teknikk for effektivt å gjenvinne konsentrert antigen. På slutten av det første spinnet beholdes den konsentrerte prøven sirklet i rødt (A) i filteret, mens filtratet samles i bunnen av oppsamlingsrøret (større ytre rør). For å resuspendere det pelleterte antigenet, er sentrifugalfilterenheten avkortet ved hjelp av oppsamlingsrøret (B) som forberedelse til vortexing. Ved virvel holdes tuppen av røret i kontakt med virvelputen og hettenden roteres rundt mens den opprettholder en 45° vinkel med virvelputen (C). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 4: Pre-run programmering piezoelektrisk dispenser. (A) Sett opp "Finn målreferansepunkter" ved å navigere fra "Hovedfanen" til Robotoppsett > Diverse >Div.-funksjonen > Finn målreferansepunkter. Bruk knappene uthevet i blått for å stille inn tillitsmerkene. Velg først Lær mal og tegn en boks rundt forvaltermerket av interesse, bekreft malens nøyaktighet ved å klikke på Søkemal, og lagre malen. Gjør dette for de fire- og femkantede stjernene, og lagre filnavnene i henhold til instruksjonene under Bruk to forskjellige malbilder. Deretter må du kontrollere at alle parametrene i de svarte boksene stemmer overens. Last inn den firekantede stjernefiducialen ved hjelp av Load Template (grønn boks). Lagre programmet "Finn målreferansepunkter" ved å velge Oppgaveliste (oransje boks). (B) Sett opp kjøringen ved å navigere til kategorien Robotoppsett > Oppgaver, og last deretter inn rekkefølgen av oppgaver som vises i den blå boksen ved å legge til oppgaver fra oppgavelisten (svart boks) ved hjelp av valgene Oppgave i Kjør (grønn boks). Til slutt lagrer du oppgaven (oransje boks). (C) Sett opp "Target Substrate" ved å navigere til Robot Setup > Target Substrate, og legg deretter til et mål (blå boks). (D) Skriv inn parametrene som vises her og velg Lagre (blå boks). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 5: Lasting av antigen og kalibrering av dipenseringsjustering. (A) Naviger til kategorien Dyseoppsett > Utfør oppgave og aspirer 10 μL av antigenet inn i dispenseringsspissen ved å velge TakeProbe10 uL (svart boks) og klikke på DO (svart boks). (B) Dette åpner et eget vindu. Velg brønnen det konsentrerte antigenet ble lastet inn i, og velg OK (blå boks). (C) Etter at antigenet har blitt aspirert, vask spissen ved å velge den blå boksen, og gjenta denne vasken to ganger til. Velg kameraet (svart boks) og bestem slippvolumet ved å velge slippvolum (grønn boks). Sørg for at det dannes et stabilt fall med et volumstandardavvik (%) <2 (oransje boks). (D) Hvis du følger disse trinnene, åpnes Snap Drop Cam; velg Bilde (blå boks) i rullegardinmenyen og velg Nozzle Head Camera Wizard. Dette åpner et nytt vindu. Utfør den neste sekvensen med trinn raskt. (E) Forsikre deg om at målet som er gjort i tilleggsfigur 4 er lastet, og velg deretter Flytt til mål (blå boks). Juster dråpene til 15 og velg Spot (svart boks). Når den er oppdaget, velger du umiddelbart Flytt (grønn boks). Forsikre deg om at Auto Find er valgt og slett partikkelstørrelse = 12, og klikk deretter på Start (oransje bokser). Hvis automatisk gjenkjenning mislykkes, gjentar du denne prosessen etter at du har flyttet til et annet område på lysbildet (lilla boks). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 6: Programmering av spotting-array og begynnelse av løpet. (A) Naviger til måloppsett > mål, og fyll deretter ut parametrene som vises i den blå boksen. (B) Deretter navigerer du til "Feltoppsett-fanen" og skriver inn 20 i nr. av dråpefelt (blå boks), velg en brønn (svart boks), og velg deretter mål / partikler å dispensere i (grønn boks). Ved å velge en annen brønn og velge målene / partiklene på nytt, utføres ytterligere fyllingssykluser i løpet av en enkelt kjøring. (C) På hovedskjermen må du sørge for at kjøringen og målet som er opprettet i tilleggsfigur 5 , er valgt. (D) Naviger til "Kjør-fanen" og velg Start Run (blå boks). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 7: Mikropartikkelinjiserbarhet. (AC) Fokus-stablet stereoskop bilder av mikropartikler fylt med fluorescein natriumsalt og forseglet i en 19 G nål. (D) Totalt 10 partikler ble injisert gjennom en 19 G kanyle ved bruk av en 2 % karboksymetylcelluloseoppløsning (n = 8). Skala bar = 1 mm. Feilfelt angir standardavvik. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 8: Potensielle problemer med antigenkonsentrasjon. Den røde linjen indikerer den forventede foldeøkningen i konsentrasjon. Feilfelt angir standardavvik. Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av Tukeys flere sammenligningstester med enveis ANOVA. p < 0,001, ****p < 0,0001. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Klargjøring av buffere og løsninger for RABV ELISA. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 1: STL-fil som inneholder partikkelmatrise. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 2: STL-fil som inneholder geometri for den tilpassede glideholderen som brukes til å tette partikler. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Det er mulig å endre partikkelgeometri for spesifikke behov; For sylindriske strukturer anbefaler forfatterne imidlertid å opprettholde et forhold på 5: 4: 1 av høyde: diameter: veggtykkelse beskrevet i protokollen. Dette sideforholdet sikrer at nok PLGA-materiale er til stede for å forsegle partiklene og forbli mekanisk robuste nok til håndtering. Partikkeldimensjoner og former kan enkelt endres under CAD-prosessen, slik at en myriade av geometrier kan genereres. Ved å kombinere fleksibiliteten til CAD med 3D-utskrift kan du raskt iterere mikropartikkeldesign. Selv om denne protokollen bruker en multi-foton 3D-skriver, kan enhver 3D-skriver med spesifikasjoner som kan skrive ut mikrostrukturdimensjonene i et passende materiale, brukes til å generere den første hovedformen. Videre har fotolitografi tidligere blitt brukt til å lage lignende strukturer i arrays mye større enn de som produseres i denne protokollen; Arbeidet, forsinkelsen med å bestille skreddersydde fotomasker og tilgjengeligheten av utstyr ville imidlertid bremse den iterative designprosessen¹⁶. Endelig kan masterformgenerering outsources til gebyr-for-service-selskaper hvis intern hovedformfabrikasjon ikke er mulig. Uansett hvilken 3D-skriver eller metode som brukes til å generere masterformene, er vedheft av utskriften til underlaget avgjørende for nedstrømstrinn. Spesielt, hvis vedheft er utilstrekkelig under PDMS-formgenerering, vil trykte partikler forbli fast i PDMS-formen, noe som krever manuell fjerning av de trykte partiklene og ødeleggelse av hovedformen.

Partikkelfylling er et annet kritisk aspekt å vurdere. Mikropartikler har begrenset fyllingskapasitet, så filtrering brukes ikke bare til å konsentrere RABV-antigenet, men også for å fjerne stamhjelpestoffer som ellers ville oppta en stor del av mikropartikkelkjernevolumet. Gitt den store størrelsen på RABV-antigenet (ca. 60 nm x 180 nm)¹⁷, er det imidlertid mulig å delvis pelletere ut antigenet under sentrifugeringstrinnene. Av denne grunn er det viktig å resuspendere antigenet ved pipettering eller vortexing etter sentrifugering for å oppnå høy utvinning av RABV-antigenet. En høykonsentrert løsning er ideell for dispensering, fordi den reduserer dispenseringssyklusene og dermed begrenser antigennedbrytningen under fylling. Viskositet er imidlertid en stor begrensning for piezoelektriske dispenseringsroboter som danner et stabilt fall, så det er kanskje ikke mulig eller tilrådelig å dispensere en løsning med svært høy konsentrasjon. Fortynning av fylleløsningen er den enkleste måten å oppnå en stabil dråpedannelse på, men antigenstabilitet over de ekstra fyllingssyklusene som trengs for å oppnå ønsket belastning og lengre tid som kreves for å fylle partikler, bør vurderes.

Begrensninger
Denne metoden krever høyt spesialisert utstyr for å produsere de første formene og et spesialisert fyllinstrument for mikropartikkelproduksjon. Selv om behovet for en 3D-skriver med en utskriftsoppløsning som er i stand til å generere de første masterformene, kan undergraves av en avgiftsbelagt tilnærming, er tilgjengeligheten til en piezoelektrisk dispenserrobot begrensende. Anskaffelse av en piezoelektrisk dispenserrobot krever en betydelig innledende forhåndsinvestering, ofte i størrelsesorden $ 80,000 til $ 200,000, avhengig av merke, gjennomstrømning og evner. Selv om flere andre fyllingsmetoder er potensielle alternativer, har disse metodene ikke blitt validert ved bruk av RABV-antigen¹².

Fremtidige applikasjoner
En betydelig andel innkapslet RABV-antigen forble stabilt gjennom forseglingsprosessen. I teorien, ved å inkorporere dette antigenet i partikler sammensatt av forskjellige typer PLGA som etterligner administrasjonstidslinjen for posteksponeringsprofylaksebehandling, kan alle doser administreres i en enkelt injeksjon. Eliminering av behovet for gjentatte sykehusbesøk for å administrere ytterligere doser vil forbedre pasientens etterlevelse, noe som resulterer i bedre behandlingsresultater. Videre, etter å ha demonstrert evnen til å beholde ELISA-reaktiviteten til det svært komplekse inaktiverte rabiesviruset, er det sannsynlig at andre antigener, inkludert subenhetsvaksiner, ville være kompatible med denne innkapslingsmetoden. Bruk av andre profylaktiske antigener med pulserende mikropartikler kan redde millioner av liv i LMICs ved å øke vaksinasjonsgraden for undervaksinerte befolkninger. For å oppnå dette må vaksiner imidlertid forbli stabile gjennom ikke bare innkapsling, men også frigjøring, noe som kan være utfordrende siden nyttelasten vil bli utsatt for forhøyede temperaturer og et potensielt surt mikromiljø på grunn av kroppsvarme og PLGA-nedbrytningsprodukter¹⁸. Fremtidig arbeid vil forfølge stabiliserende strategier for antigenet gjennom frigjøring, noe som vil åpne potensialet for en enkeltinjeksjonsvaksinasjonsplattform som er bredt anvendelig for å forhindre mange smittsomme sykdommer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm PES filter	Cole-Parmer+B4B2:B63	04396-26
0.25 mm Shims	McMaster Carr	98090A935
0.75 inch Binder Clips	Staples	480114
10 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309604
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Fisherbrand	13-678-11E
101.6 mm C-Clamp	Amazon	PT-SD-CP01A	Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens.
19 G needle	EXCELINT	26438
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Fisherbrand	13-678-11
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate	Millipore Sigma	M6514-25ML
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Eppendorf	22431081
50 mL Centrifuge Tubes	Corning	352098
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Fisherbrand	13-678-11F
Acetone	Fisher	AC268310010
Aluminum Block	McMaster Carr	9057K175
Aluminum Foil	VWR	89079-069
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa	Millipore Sigma	C82301
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100	Fisherbrand	13-678-11D
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated	Fisherbrand	14-388-100
Carboxymethyl Cellulose	Tokyo Chemical Industries	C0045
ClipTip 300, Filter, Racked	Fisherbrand	13-678-11
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube	Corning	3206
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube	Corning	3207
Describe	Nanoscribe		Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer.
Desiccator	Fisher Scientific	10529901	Or equivalent
Double-Sided Tape	Staples	649280
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium	Gibco	14200075
Ethanol	VWR	89370-084
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL	Fisherbrand	13-678-11E
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL	Fisherbrand	13-678-11F
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL	Fisherbrand	03-448-17
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL	Fisherbrand	FB14955202
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL	Fisherbrand	13-374-10
Fisherbrand Elite Pipette Kit	Fisherbrand	05-408-137
Fisherbrand Pipet Controller	Fisherbrand	FB14955202
Glass Petri Dish, 90 mm	VWR	470313-346
Glass Slides	Globe Scientific	1380-10
Helicon Focus 8	HeliconSoft		Software used to focus stack images
IP-Q Resin	Nanoscribe		Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple	Amazon	5053485896236	Or equivalent
Microscope Slide Box	Millipore Sigma	Z374385-1EA	Or equivalent
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective	Nanoscribe
NanoWrite	Nanoscribe		Software used to interface with nanoscrive 3D printer. Software provided with printer.
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate	Invitrogen	44-2404-21
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride)	Fisherbrand	02-707-432
Parafilm M Wrapping Film, 4 in.	Fisherbrand	13-374-10
PDC 60 with Type 3 Coating	Scienion	P-2020
PDMS Particle Molds	Rice University	n/a	N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array.
Petri Dish	Fisher Scientific	08-757-100D
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x)	Fisherbrand	02-707-430
Plastic Cups	Fisher Scientific	S04170
PLGA Film, 502H	Sigma	502H: 719897-1G
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate	Millipore Sigma	484431
Rabies Antigen	Chiron Behring and Bharat Biotech International		Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company.
Razor Blades	VWR	55411-050
Scalpel	VWR	21899-530 and 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60	Scienion		Or equivalent
Sealing Tape for 96-Well Plates	Thermo Scientific	15036
Silicon Wafer	University Wafer	1025
Spring Clamps	IRWIN	VGP58100
Stainless Steel Block	McMaster Carr	9083K12
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive	Fisherbrand	02-707-404
Sylgard 184	DOW	2646340
Teflon Sheet	McMaster Carr	9266K12	Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces.
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick	McMaster Carr	9266K81
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane	Sigma	448931-10G
Tweezers	Pixnor	ESD-16
UltraPure Distilled Water	Fisher Scientific	10977015
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker	UVP	95-0174-01	Or equivalent
Vacuum Desiccator	Bel-Art	F420100000	Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination.
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C	VWR	97027-664	Or equivalent
Vacuum, CRVpro4	Welch	3041-01	Or equivalent
Wooden Tongue Depressors	Electron Microscopy Sciences	72320