Fremstilling af pulserende polymere mikropartikler, der indkapsler rabiesantigen

Summary

Denne metode beskriver indkapslingen af rabiesantigenet i bionedbrydelige polymere mikropartikler med strukturelle og materielle egenskaber, der muliggør pulserende frigivelse efter en forudbestemt forsinkelse. Vurdering af enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) af antigenet udtaget fra partikelkernen bekræfter tilstedeværelsen af intakt trimerisk rabiesvirusglycoprotein gennem partikelfabrikation.

Abstract

De nuværende retningslinjer for rabiesprofylakse efter eksponering kræver flere injektioner administreret over flere uger. Dette kan være uforholdsmæssigt byrdefuldt for dem, der bor i lav- og mellemindkomstlande (LMIC'er), hvor størstedelen af dødelige eksponeringer for rabies forekommer. Forskellige lægemiddelleveringsstrategier er blevet undersøgt for at kondensere vaccineregimer til en enkelt injektion ved at indkapsle antigener i polymere partikler. Imidlertid kan hårde stressorer under indkapslingsprocessen forårsage denaturering af det indkapslede antigen. Denne artikel beskriver en metode til indkapsling af rabiesvirus (RABV) antigen i polymere mikropartikler, der udviser justerbar pulsatil frigivelse. Denne metode, kaldet partikler ensartet flydende og forseglet til indkapslingsmedicin (PULSED), genererer mikropartikler ved hjælp af blød litografi til at skabe inverse polydimethylsiloxan (PDMS) forme fra en multi-foton, 3D-trykt masterform. Poly (mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA) film komprimeres derefter i PDMS-formene for at generere åbne cylindre, der er fyldt med koncentreret RABV ved hjælp af en piezoelektrisk dispenseringsrobot. Disse mikrostrukturer forsegles derefter ved opvarmning af toppen af partiklerne, hvilket gør det muligt for materialet at strømme og danne en kontinuerlig, ikke-porøs polymerbarriere. Efter fremstillingen anvendes et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), der er specifikt til påvisning af intakt trimerisk rabiesvirusglycoprotein, til at bekræfte den høje genopretning af immunogent antigen fra mikropartiklerne.

Introduction

Vaccination er et ekstremt effektivt sundhedsværktøj, der har forhindret mere end 37 millioner dødsfald mellem 2000 og 2019¹. På trods af denne effektivitet udgør sygdomme, der kan forebygges ved vaccination, fortsat en betydelig risiko for den globale sundhed, især i lav- og mellemindkomstlande (LMIC'er), hvor høje arbejdsløsheds- og undervaccinationsrater bidrager til 1,5 millioner dødsfald, der kan forebygges ved vaccination, årligt². Rabies er ingen undtagelse fra disse forskelle. På trods af sin status som den mest dødelige sygdom, menneskeheden kender, er næsten universelt dødelig, er rabies fuldt behandlet og klassificeres som udryddet i mange højindkomstlande. I stedet bæres byrden af rabies uforholdsmæssigt af mennesker, der bor i dele af Asien og Afrika, hvor sygdommen har ødelæggende resultater for mennesker og husdyr ^3,4.

Vaccination er afgørende for håndteringen af rabies' globale virkninger⁵. Omkostningerne ved vaccination forbyder udbredt implementering af profylakse før eksponering (PrEP) i betragtning af den samlede lave forekomst af sygdommen. Desuden er nytten af profylakse efter eksponering (PEP) i LMIC'er begrænset af socioøkonomisk pres på patienter, der søger sundhedspleje. Logistiske faktorer, såsom rejseafstand til sundhedsadgangspunkter, tabt arbejdsfortjeneste under behandling, behandlingsomkostninger, aftaler, der forstyrrer daglige aktiviteter og glemsomhed, resulterer i PEP-overholdelse så lave som 60%^6,7. Denne høje patientnedslidningsrate giver mulighed for at forfine tilgange til at afhjælpe huller i rabiesvaccination for at bekæmpe sygdommen.

Enkeltinjektionsvaccinationssystemer (SI), der styrer frigivelsen af antigener, er blevet undersøgt som måder at opnå fuld immunisering i en injektion. Eliminering af behovet for flere besøg hos en sundhedsudbyder mindsker de byrder, der forhindrer enkeltpersoner i at søge tilstrækkelig pleje. For at opnå SI-vaccination indkapsles et antigen typisk i en biologisk nedbrydelig polymermatrix, der ofte har form af injicerbare mikropartikler. Når den er injiceret, nedbrydes polymeren og frigiver det sekvestrerede antigen. Til dato er to primære frigivelsesstrategier blevet forfulgt for at opnå SI-vaccination. I en tilgang frigives antigenet kontinuerligt over en længere periode. Selv om hensigten er at forbedre immunogeniciteten af en enkelt injektion, er det uklart, om denne fremgangsmåde er tilstrækkelig til at fremkalde et beskyttende immunrespons mod rabiesvirus (RABV) hos mennesker⁸. I den anden frigives antigenet efter en forudbestemt forsinkelse for at efterligne et konventionelt og bevist prime-boost-vaccineregime. Spraytørring og emulsion / opløsningsmiddelfordampningsbaserede mikropartikelfabrikationsmetoder udviser den tidligere strategi og er blevet brugt til med succes at indkapsle både modelvacciner⁹ og meget stabile antigener, såsom stivkrampetoksoid¹⁰. Disse indkapslingsmetoder involverer imidlertid stressorer, herunder varme, opløsningsmiddelinteraktion og fysiske kræfter, der kan denaturere antigener¹¹.

Partikler ensartet flydende og forseglet til indkapslingsmedicin (PULSED) er en nyligt udviklet fabrikationsmetode, der kan anvendes til at indkapsle biologiske lægemidler i biologisk nedbrydelige mikropartikler. Mikrostøbning bruges til at generere partikler, der er fyldt med en flydende nyttelast og opvarmet for at tillade polymeren at reflow og fuldt ud indkapsle det centrale lager af last inden for et sammenhængende lag af den biologisk nedbrydelige polymer. Denne mikrostruktur resulterer i pulserende frigivelse af nyttelasten efter en varighed, der afhænger af nedbrydningshastigheden af den polymere skal¹². Dette manuskript demonstrerer indkapslingen af inaktiveret RABV i mikropartikler sammensat af poly(mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA), en biologisk nedbrydelig polymer, der anvendes i mange FDA-godkendte formuleringer¹³, ved hjælp af PULSED-fabrikationsmetoden til at indkapsle stabilt RABV-antigen som evalueret ved et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). Ved at kombinere PLGA-partikler med forskellige molekylvægt- og/eller slutgrupper har denne tilgang potentialet til at efterligne det nuværende rabiesvaccinationsforløb efter en enkelt injektion.

Protocol

1. Partikelmester skimmelgenerering

BEMÆRK: 3D-udskrivningsprocessen kan udføres med enhver 3D-printer med tilstrækkelig rumlig opløsning; Den nuværende protokol beskriver dog processen for en multi-photon 3D-printer.

1. Design mikropartikelstrukturer ved hjælp af et computerstøttet design (CAD) program.
   BEMÆRK: Designspecifikationerne er som følger: 308 partikler (diameter = 400 μm, højde = 500 μm og vægtykkelse = 100 μm) er arrangeret i et 22 x 14 array med 600 μm afstand mellem dem. Designet indeholder også en firetakket stjerne og en femtakket stjerne som fiducials umiddelbart uden for arrayet (supplerende figur 1).
2. Eksporter det endelige design som en STL-fil (supplerende kodningsfil 1), og upload filen til software, der er i stand til at definere udskriftsparametrene som vist nedenfor. Gem den derefter som en fil, der er kompatibel med 3D-printeren (se Materialetabel).
   BEMÆRK: Udskæringsafstand = 5 μm, skraveringsafstand = 1 μm, skalkontur = 50 μm, basisskiveantal = 5 μm, stillads = hul, scanningstilstand = galvo, z-akse = mikroskop z-drev, scanningshastighed = 100.000, effekt = 100.
3. Forbehandle et siliciumtryksubstrat (se materialetabel) ved hjælp af en plasmarensningsproces (gas:_O2; effekt: 200 watt; temperatur: 25 °C; flow: 20; tid: 5 min), og nedsænk derefter straks substratet i en opløsning af 30 ml ethanol og 60 μl 3-(trimethoxysilyl) propylmethacrylat i en petriglasskål. Dæk med aluminiumsfolie og lad det inkubere natten over.
   BEMÆRK: Dette trin øger printvedhæftningen til underlaget, hvilket er vigtigt under PDMS-adskillelse (trin 2.6).
4. Upload udskriftsfilen til multifoton 3D-printeren, påfør printharpiksen på det behandlede substrat, ilæg 10x-objektivet (se materialetabellen), og udskriv mikrostrukturerne.
5. Når du er færdig, nedsænkes udskriften i propylenglycolmethyletheracetat (se materialetabel) i 45 minutter for at fjerne ueksponeret fotoresist, og nedsænk derefter udskriften i isopropylalkohol i 5 min. Efterhærd masterformen ved at udsætte den for UV-lys ved 254 nm i 120 min.
   BEMÆRK: Hvis det er tilgængeligt, kan UV-lys i området 405 til 365 nm bruges i ~ 20 minutter til efterhærdning af de trykte strukturer.

2. Polydimethylsiloxan (PDMS) skimmelgenerering

1. Behandl overfladen af den 3D-printede masterform ved at placere den i et vakuumkammer, der indeholder et glasglas med 40 μL Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H, -perfluoroctyl) (se materialetabel) silan tilsat overfladen. Træk vakuumet (relativt tryk: -20 tommer. Hg) i 1 time.
   BEMÆRK: Dette trin sikrer nem adskillelse ved afskærmning (trin 2.6).
2. Mens masterformoverfladen behandles, blandes polydimethylsiloxan (PDMS) præpolymerbasen grundigt med PDMS-præpolymerhærdningsmidlet i et masseforhold på 9: 1 (mindst 10 g materiale er nødvendigt for hver masterform). Når det er grundigt blandet, overføres det uhærdede PDMS til et 50 ml centrifugerør og centrifugeres ved 300 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
3. Når overfladebehandlingen er afsluttet, skal du placere masterformen i en aluminiumsfolieskål og hælde den uhærdede PDMS oven på formen, hvilket sikrer, at funktionerne er helt nedsænket. Anbring aluminiumsfolieskålen i et vakuumkammer, og træk vakuumet (relativt tryk: -20 tommer. Hg) i 1 time for at fjerne luftbobler.
4. Fjern aluminiumsfolieskålen fra vakuumkammeret. Placer 800 μm afstandsstykker i enderne af masterformen og overlejr en ren glasglide på masterformen, og pas på at undgå at indføre luftbobler. Brug bindeclips til at klemme formen og glideren sammen, lokalisere klemkraften over afstandsstykkerne (supplerende figur 2).
5. Anbring strukturen i en ovn indstillet til 120 ° C i mindst 4 timer for at hærde præpolymeren til PDMS-forme.
6. Fjern strukturen fra ovnen, slip forsigtigt bindemiddelklemmerne, og adskil forsigtigt masterformen fra den hærdede PDMS-form ved hjælp af et barberblad.
   BEMÆRK: Den 3D-printede masterform kan genbruges til at generere yderligere PDMS-forme.

3. PLGA-filmfremstilling

1. 450 mg PLGA afvejes (se materialetabel) og anbringes på en 76 mm x 76 mm nonstick-polymerplade inden for en 250 μm tyk ringplade med en indvendig diameter på 50,8 mm. Placer et andet nonstick-polymerark over PLGA'en, og komprimer stakken mellem to aluminiumsblokke ved hjælp af en 101,6 mm c-klemme, indtil den er fingertæt.
   BEMÆRK: 502H PLGA blev udelukkende anvendt i denne undersøgelse; andre typer PLGA er dog kompatible med denne proces.
2. Den c-fastspændte enhed anbringes i en vakuumovn, der er indstillet til 120 °C i 30 minutter under vakuum med et relativt tryk på -30 in.Hg. Fjern derefter samlingen, og stram klemmen fast, inden du sætter den tilbage i vakuumovnen i yderligere 30 minutter.
   BEMÆRK: Det primære formål med at bruge et vakuum er at undgå PLGA-nedbrydning, som accelereres ved høje temperaturer.
3. Fjern enheden fra ovnen og lad den køle af i 4 timer i en ekssikkator.
4. Når den er afkølet, løsnes klemmen, fjern PLGA-filmen fra nonstick-polymerpladerne og læg filmen i en mærket petriskål. Opbevar petriskålen inde i en ekssikkator til senere brug.

4. PLGA-partikelgenerering

1. Behandl overfladen af PDMS-formen som beskrevet tidligere i trin 2.1.
2. Brug pincet og/eller en skalpel til at skære ud og placere en del af 250 μm PLGA-filmen, omtrent på størrelse med arrayet, på den behandlede PDMS-form.
3. Overlejr et rent glasmikroskopglas oven på PLGA-filmen og PDMS-formen, og klem komponenterne sammen ved at placere en fjederklemme direkte over arrayet og PLGA-filmen.
4. Anbring den fastspændte formenhed i vakuumovnen indstillet til 120 °C, og træk vakuumet med et relativt tryk på -30 tommer. Hg i 1 time.
   BEMÆRK: Den tid, det tager at danne partiklerne, afhænger af PLGA og kan variere fra 1-12 timer.
5. Fjern den fastspændte formenhed fra ovnen, og lad den passivt afkøle ved stuetemperatur i ca. 15 minutter, eller indtil den er kølig at røre ved.
6. Brug et barberblad til forsigtigt at lægge tryk mellem PDMS-formen og PLGA-partikelarrayet for at adskille de to. Opbevar PLGA-partiklerne i en ekssikkator til fremtidig brug.

5. Antigenkoncentration og oprensning

1. Der optøes en prøve kommercielt tilgængeligt RABV-antigen (se materialetabellen) ved stuetemperatur.
2. Saml filtreringsopsætningen ved at placere to centrifugalcentrifugalcentrifugeringsfiltre med en 100 kDa molekylvægtsafskæring (MWCO; se materialetabel) i to opsamlingsrør.
3. Forvåd de to centrifugalcentrifugalcentrifugeringsfiltre ved at tilsætte 500 μL UltraPure-vand.
4. Drej filtrene ved 2.400 x g i 1 min i en bordcentrifuge ved stuetemperatur.
5. Fjern vandet fra både det øverste og nederste rum i filtreringsopsætningen ved hjælp af en 200 μL pipette.
   BEMÆRK: Lad ikke det forvædede centrifugeringsfilter tørre ud.
6. Der tilsættes 400 μL destilleret vand til det øverste rum i hvert centrifugeringsfilter, derefter tilsættes 100 μL af det optøede RABV-antigen, og pipetten blandes med pipetten.
   BEMÆRK: Denne undersøgelse koncentrerede antigenet ca. fem gange og reducerede koncentrationen af hjælpestoffer <100 kDa med ~ 50 gange.
7. Læg de to centrifugalcentrifugalcentrifugeringsfiltre i en bordcentrifuge, og sørg for, at filtrene vender mod midten af centrifugen. Marker hvilken side af filteret der vender mod midten af centrifugen.
   BEMÆRK: Hvis opløsningerne er orienteret forkert, filtreres/koncentreres de ikke korrekt.
8. Centrifuger filtrene ved 14.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
9. Hent filtrene fra centrifugen. Opsamlingsrørene indeholder filtratet, mens filtrene indeholder den koncentrerede prøve (supplerende figur 3A).
10. Filtratet i opsamlingsrørene fjernes ved hjælp af en pipette og kasseres.
11. Der tilsættes 450 μL filtreret destilleret vand til hvert filter, og den koncentrerede prøve og vandet blandes ved pipettering op og ned seks gange.
12. Centrifuger de to centrifugeringsfiltre endnu en gang ved 14.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Sørg for, at filtrene vender mod midten af centrifugen i samme retning som i trin 5.7.
13. Udtag filterenhederne fra centrifugen, og fjern og kassér filtratet fra hvert rør ved hjælp af en pipette ligesom før.
14. Centrifugeringsfiltrene fjernes fra opsamlingsrørene, og filterhusene lukkes med toppen af opsamlingsrørene (supplerende figur 3B).
15. Placer bunden af centrifugeringsfilterhusene direkte på en hvirvel og hvirvel ved 3.000 o/min i 30 sek., mens du holder filterhusene lodret og i en vinkel på 45° (supplerende figur 3C).
    BEMÆRK: Dette trin er beregnet til at resuspendere ethvert RABV-antigen, der dannede en pellet under centrifugeringsprocessen.
16. Fjern forsigtigt hætten på opsamlingsrørene fra centrifugeringsfilterhusene. Sæt filterhusene tilbage i de medfølgende opsamlingsrør, og kør en hurtig centrifugering (2-3 s) for at opsamle ethvert volumen, der kan være blevet fanget i hætten.
    BEMÆRK: Dette hurtige spin skal udføres i en stationær mikrocentrifuge. Filtrene skal tangere centrifugen, modsat den tidligere konfiguration, for at sikre, at ingen opløsning går tabt gennem filtrene.
17. Omvend hver centrifugeringsfilterenhed til et nyt opsamlingsrør, der følger med centrifugeringsfiltersættet (se materialetabellen), og centrifuger i 2 minutter ved 1.000 x g ved stuetemperatur for at opsamle de koncentrerede prøver.
18. De koncentrerede prøver fra de to opsamlingsrør konsolideres i ét opsamlingsrør. Mål og registrer det resulterende volumen.
    BEMÆRK: Den resulterende prøve vil have 5x den oprindelige antigenkoncentration som stammen, have en lille hjælpekoncentration (<100 kDa) ca. 50 gange lavere end stammen og fremstå let mælkehvid. Det samlede volumen skal være ca. 44-48 μL.
19. Det 5x koncentrerede, to gange vaskede antigen opbevares ved 4 °C indtil udleveringstidspunktet, dog højst i 16 timer. Før påfyldning af partikler med denne opløsning centrifugeres røret ved 1.000 x g i 1 min for at fjerne eventuelle bobler. Opløsningen kan fortyndes med destilleret vand for at nå den nominelle målkoncentration for dispensering.

6. Partikelfyldning

1. Vakuumfiltrer 500 ml deioniseret vand gennem et 0,22 μm vakuumfilter, afgas derefter opløsningen ved at påføre et vakuum (relativt tryk: -20 in. Hg) under sonikering i 20 min.
2. I løbet af denne tid skal du fastgøre piezodispenseringskapillærerne (PDC'er; se materialetabel) til den piezoelektriske dispenser.
3. Klargør maskinen i henhold til producentens anvisninger (se materialetabellen), og anbring objektglasset med PLGA-partiklerne i dispenseringsområdet.
4. Opsæt "Find målreferencepunkter", kør, og opsæt derefter "Målsubstratet" i henhold til supplerende figur 4.
5. Læg 25 μL af det koncentrerede antigen i kildepladen, og læg det i maskinen. Ved hjælp af PDC'erne suges 10 μL koncentreret antigen ind i dispenseringsspidsen, vaskes ydersiden af spidsen, hvorefter dispenseringsjusteringen kalibreres (supplerende figur 5).
6. Indtast "Target Setup parameters" og klik på Kør (supplerende figur 6).
7. Når du er færdig, skal du fjerne de fyldte partikler og kontrollere, at de er fyldt under et stereoskop.
8. Gå direkte til næste trin i protokollen.

7. Partikelforsegling og høstning

1. Placer en rustfri stålblok (se Materialetabel) på en kogeplade. Placer to mikroskopglas på blokken i rustfrit stål, så de er parallelle. Sørg for, at blokken i rustfrit stål er plan, tænd derefter kogepladen, og indstil temperaturen, så overfladetemperaturen på rustfrit stål er 200 °C. Kontroller kogepladens temperatur inden forsegling.
2. Ophæng de fyldte PLGA-partikler over kogepladen ved at placere dem på de to glasglas, og start derefter straks en timer i 18 sekunder.
   BEMÆRK: Den tid og varmepartikler, der skal forsegles, varierer afhængigt af de kemiske egenskaber af PLGA, der bruges til at fremstille partiklerne. En brugerdefineret 3D-printet diasholder kan bruges til at håndtere diasene i sikker afstand fra kogepladen. Den STL fil leveres som supplerende kodning fil 2.
3. Når partikelarrayet er forseglet, skal du fjerne det fra kogepladen og hænge det over laboratoriebænken ved at placere partikelarrayet på to separate glasglas. Lad partiklerne køle af i 1 min.
4. Når partiklerne er afkølet, kan de høstes ved hjælp af en skalpel, mens de kigger gennem et stereoskop. Hold skalpellen med bladet i en vinkel på 45° i forhold til objektglasset, og tryk på partiklens bund for at adskille den fra glasglasset.
5. Når den er høstet, skal du bruge skalpellen til at overføre partiklerne til 0,5 ml lavproteinbindende rør (se materialetabel). Derefter fyldes glassene med 250 μL af en 1x fosfatbufferopløsning (PBS) indeholdende 30 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) og 1 mg/ml glucose.
   BEMÆRK: 30 mg/ml BSA- og 1 mg/ml glucoseopløsning fremstillet i PBS opretholder stabiliteten af RABV-antigenet.
6. Knus partiklerne under et stereoskop ved hjælp af en pincet med fin spids. Sørg for, at RABV-antigenet i partiklens kerne er tilgængeligt til opløsning i den omgivende opløsning. Prøverne opbevares i køleskab ved 4 °C, indtil antigenstyrken kan evalueres ved hjælp af en ELISA. Prøverne skal køres på en ELSIA inden for 7 dage efter tilberedningen.

8. ELISA-antigenets evaluering

FORSIGTIG: Lad ikke mikropladerne tørre ud på noget tidspunkt. Stak altid plader, og dæk altid den øverste plade med en plastikforsegling, en tom plade eller et låg for at undgå udtørring.

1. Forbered bufferne som beskrevet i supplerende fil 1.
2. Der fremstilles 5 ml belægningsopløsning (carbonat-bicarbonatbuffer, pH 9,6) i en koncentration på 2,5 μg/ml ved tilsætning af 25 μL af belægningsantistoffet til 4975 μL belægningsbuffer ved pH 9,4-9,6.
   BEMÆRK: Der kræves 5 ml for at belægge 96 brønde med hver 50 μL (med ekstra volumen til pipetteringstab). Forøg det samlede volumen med 5 ml for hver ekstra ELISA-plade, der er nødvendig.
3. Brug en multikanalpipette til at dispensere 50 μL af belægningsopløsningen i hvert hul i mikropladen. Opløsningen skal anvendes til belægning umiddelbart efter tilberedningen.
4. Bank forsigtigt langs pladekanterne på en handskehåndflade for at sikre, at bunden af hver brønd er jævnt dækket med væske.
5. Pladen forsegles med selvklæbende film, anbringes ved 37 °C i 1 time, hvorefter den overføres til 4 °C natten over.
6. Tag pladerne ud af kølerummet, og vask dem tre gange med 200 μL vaskebuffer i hvert hul.
7. Fjern vaskebufferen, og fordel 300 μL blokerende buffer i hvert hul.
   FORSIGTIG: Når du kører flere plader med de samme prøver gentaget på forskellige plader, er det vigtigt at fortsætte plade for plade (dvs. fyld plade 1 med materialet, før du fortsætter til plade 2 og derefter til plade 3 og så videre). Anvend ikke materiale X på alle plader og derefter materiale Y osv., da dette ville øge risikoen for, at brøndene tørrer ud. Efter det sidste vasketrin skal vaskebufferen forblive i pladens brønde og kun kasseres, umiddelbart før prøverne tilsættes pladen. Et plastpladelåg med 96 brønde skal bruges til at dække alle huller i ELISA-pladen, der ikke dispenseres i med det samme, og låget flyttes sekventielt for at afsløre yderligere brønde, der skal fyldes med materiale.
8. Pladerne forsegles med en klæbende plastfilm (se materialetabellen) og anbringes i en inkubator i 60 ± 5 minutter ved 37 ± 2 °C.
9. Standardkurven og testprøverne forberedes under denne inkubation.
   BEMÆRK: Det antigen, der evalueres, skal forfortyndes i fortyndingsbuffer ved en anbefalet fortynding på 0,125 IE/ml med et overskydende volumen på mindst 40 μL for at tage højde for pipetteringstab. Alle prøverne evalueres to gange (to tekniske replikater) på hver ELISA-plade. For standardkurven anføres en dobbelt fortyndingsserie for i alt otte punkter i kolonne 2 og 3 på hver ELISA-plade. Der kan udføres en fortyndingsserie for alle andre prøver med et passende antal point baseret på den forventede mængde antigen, der evalueres. Selvom det er mindre stringent for højere gennemstrømning, kan en enkelt prøvefortynding anvendes som et alternativ til pletteringen beskrevet ovenfor. Den forventede koncentration af en enkelt fortynding skal dog ligge inden for standardkurveområdet.
10. I lavbindende protein 96-brøndsplader eller lavbindende proteinrør (se materialetabel) udføres en dobbelt fortyndingsserie af hver prøve langs pladens kolonner.
11. Starten af fortyndingsserien fyldes i række A for hver prøve med det dobbelte af det endelige volumen (pr. plade kræves 100 μL prøve pr. hul, så alle huller i A2-A11 skal indeholde mindst 240 μL af en prøve med et ekstra volumen på 40 μL for at tage højde for pipetteringstab).
12. Der fyldes 120 μL fortyndingsbuffer i alle andre huller på lavbindingsproteinpladen, undtagen kolonne 1 og 12 (dvs. B2 til og med H11).
13. Brug en multikanalpipette fyldt med 10 spidser til at udføre seriel fortynding ved at overføre 120 μL prøve fra A2-A11 til B2-B11 og pipettere op og ned flere gange for at blande, samtidig med at stænk og bobler undgås. Gentag denne proces, bevæg dig ned pladen langs søjlerne indtil brønd H2-H11. Kassér det resterende 120 μL rumfang, der er opsuget fra den sidste række brønde.
    BEMÆRK: Prøverne er nu klar til analyse. Hvis blokeringsfasen ikke er afsluttet på dette tidspunkt, skal du sørge for, at prøverne opbevares på is.
14. Ved afslutningen af inkubationstrinnet vaskes pladerne tre gange med 200 μL vaskebuffer.
15. Ved hjælp af en multikanalpipette overføres 100 μL fortyndingsbuffer til kolonne 1 og 12 som "blindprøver".
16. Ved hjælp af en multikanalpipette overføres 100 μL fra hvert hul i 96-brøndspladen med lavt bindende protein, der indeholder prøvefortyndinger, til den vaskede ELISA-plade. Gentag for alle ELISA-plader, der køres.
17. Pladerne forsegles med en klæbende plastfilm og anbringes i en inkubator i 60 ± 5 minutter ved 37 ± 2 °C.
18. Klargør detektionsantistofopløsningen (se materialetabel) i en koncentration på 0,2 μg/ml ved at tilsætte 4,4 μL af antistofopløsningen til 10,995,6 μL af fortyndingsbufferen og bland godt ved pipettering op og ned.
    BEMÆRK: Der kræves i alt 11 ml til 96 brønde ved hver 100 μL (med ekstra volumen til pipetteringstab). Forøg det samlede volumen med 11 ml for hver ekstra ELISA-plade, der evalueres. Opløsningen skal anvendes umiddelbart efter tilberedningen.
19. Ved afslutningen af inkubationstrinnet vaskes pladerne fem gange med 200 μL vaskebuffer.
20. Den resterende vaskebuffer suges op, og 100 μL af detektionsantistofopløsningen hældes i hvert hul på mikropladen ved hjælp af en multikanalpipette.
21. Pladerne forsegles med en klæbende plastfilm og anbringes i en inkubator i 60 ± 5 minutter ved 37 ± 2 °C.
22. Konjugatet fremstilles mod slutningen af detektionsantistofinkubationstrinnet ved at tilsætte 4,4 μL streptavidin-peroxidasekonjugatopløsning (se materialetabel) til 10,995,6 μL vaskebuffer.
    BEMÆRK: Der kræves i alt 11 ml til 96 brønde ved hver 100 μL (med ekstra volumen til multikanalpipettering). Forøg det samlede volumen med 11 ml for hver ekstra ELISA-plade, der evalueres.
23. Pladerne vaskes fem gange med 200 μL vaskebuffer.
24. Den resterende vaskebuffer suges op, og der hældes 100 μL konjugatopløsning i hvert hul.
25. Pladerne forsegles med en klæbende plastfilm, og de anbringes i en inkubator på 37 °C i 60 ± 5 minutter ved 37 ± 2 °C.
26. Forbered underlaget under det sidste vasketrin i henhold til producentens anvisninger (se materialetabellen). For hver plade opløses en tablet o-phenylendiamindihydrochlorid (OPD; se materialetabel) i 9 ml deioniseret vand i mørke, og fyld derefter op med 1 ml 10x stabil peroxidbuffer. Antallet af tabletter og det totale volumen opløsning (10 ml) justeres i henhold til antallet af plader, der evalueres.
27. Pladerne vaskes fem gange med 200 μL vaskebuffer.
28. Fordel 100 μL af substratet til hvert hul ved hjælp af en multikanalpipette.
29. Forsegl pladerne med en klæbende plastfilm og lad dem stå på bænken i 10-20 min, beskyttet mod lys, ved hjælp af aluminiumsfolie.
    BEMÆRK: Overvåg farveudviklingen visuelt for at undgå mætning.
30. Der tilsættes 50 μL stopopløsning til hvert hul og straks læsepladen for absorbans ved 492 nm og en referenceabsorbans på 620 nm.
31. Dataene analyseres ved hjælp af den korrigerede absorbansaflæsning (aflæsning ved 492 nm minus aflæsningen ved 620 nm), og blindprøvens gennemsnit trækkes fra alle prøver. Brug en sigmoidal 4PL interpolationsmetode til at konvertere absorbansværdier til IE/ml. Til sidst ganges med 250 μL (samlet prøvevolumen) for at konvertere til IE.
    BEMÆRK: Denne analyse kan udføres ved hjælp af dataanalysesoftware.

Representative Results

Partikelforsegling og påfyldning er to af de mest kritiske trin i denne protokol. Partikler blev fyldt med fluoresceinnatriumsalt for at demonstrere ideel påfyldning og nogle almindelige fejl. Fluoresceinnatriumsalt blev anvendt i stedet for RABV-antigenet for at lette visualiseringen. Under påfyldning er det vigtigt at dispensere opløsningen i bunden af partikelkernerne og derefter give tilstrækkelig tid til, at opløsningsmidlet/vandet kan fordampe. Når det er færdigt, forbliver et depot af det opløste stof i bunden af partikelkernen (figur 1A). Når partiklerne er fyldt, er det afgørende at forsegle partiklerne korrekt. Figur 1B viser flere resultater (vellykkede og mislykkede) af forseglingsprocessen. Efter 12 s forseglingstid forbliver en tydelig vej fra partikelcentret til ydersiden af partiklen, hvilket viser en partikel, der ikke er helt forseglet. Omvendt, hvis PLGA får lov til at forsegle i 36 s, smelter den næsten helt, hvilket resulterer i en mikrostruktur med en lav profil. Den ideelle morfologi kan visualiseres, når partikler forsegles i 18 og 24 s, da de indeholder last, der er helt indkapslet af polymeren, samtidig med at der opretholdes en partikelstruktur. Figur 1C viser flere potentielle resultater efter påfyldning og forsegling. Under dispensering, hvis opløsningsmidlet ikke når partikelbunden, efterlader det opløst stof tørret midt i partikelkernen (forkert fyldt); Selvom disse partikler stadig kan forsegle, kan den dårlige lastning af last begrænse lasteeffektiviteten. Hvis partikler fyldes med for meget last (overfyldt), hæmmes tætningsprocessen, da lasten forhindrer PLGA i at strømme over åbningen. Når de er korrekt fyldt og forseglet, er partikler af denne geometri små nok til let at passe ind i en 19 G nål. Endvidere strømmede 10 partikler konsekvent gennem en 19 G nål (100% ± 0%), når de injiceres med en tyktflydende opløsning såsom 2% carboxymethylcellulose (supplerende figur 7).

Figur 1: Almindelige problemer med påfyldnings- og forseglingsprocessen . (A) Billeder viser fordampningen af opløsningsmidlet efter en påfyldningscyklus, hvor partiklerne fyldes med 6 nL 100 mg/ml fluoresceinnatriumsalt opløst i vand. (B) Repræsentative billeder af 502H PLGA-partikler fjernet fra forseglingsprocessen ved 0, 12, 18, 24 og 36 s. (C) Forskellige resultater af forseglingsprocessen, når partikler fyldes korrekt, forkert eller overfyldt. Billeder genereres ved fokusstabling af flere billeder og fletning af dem ved hjælp af fokusstablingssoftware. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Behandling af antigenet gennem et spinfilter, inden det lægges i partiklerne, er vigtigt af to grunde. For det første tjener centrifugeringen til at fjerne stamhjælpestoffer i vaccineopløsningen, der kan begrænse partikelbelastningskapaciteten, samtidig med at RABV-antigenet bevares. Den nuværende protokol renser antigenet med ca. 50 gange. For det andet koncentreres antigenet også under denne proces. Figur 2A viser en mikrografi af intakte RABV-virioner i den koncentrerede antigenprøve. Dette antigen er ca. 4,4 gange mere koncentreret end stamopløsningen (figur 2B). Mængden af antigen, der oprindeligt blev påfyldt centrifugalcentrifugalfiltrene, kan ændres for at modulere den endelige foldkoncentration, der opnås. For eksempel resulterer ilægning af 40 μL stamantigen i en koncentration på ca. 1,75 gange. Supplerende figur 8 viser betydningen af hvirvelstrøm (trin 5.15) i koncentrationsprocessen. Forsømmelse af hvirvel eller forkert hvirvelstrøm af prøverne begrænser koncentrationsprocessen.

Figur 2: Antigenkoncentration. Koncentrationen af antigen ved centrifugalfiltrering vist ved transmissionselektronmikroskopi (A) og bekræftet ved ELISA (B). Fejlbjælker angiver standardafvigelsen. Statistisk analyse udføres ved hjælp af Tukeys flere sammenligningstest med envejs ANOVA. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3A viser koncentreret antigen fyldt i uforseglede og forseglede partikler. Selvom en betydelig mængde antigen er fyldt i partiklerne (0,0469 ± 0,0086 IE), omfatter dette materiale <90% af partikelkapaciteten, hvilket giver rigelig plads til påfyldning af yderligere antigen. Interessant nok indeholder uforseglede partikler kun 0,0396 ± 0,0077 IE, der kun omfatter 85% ± 16% af den samlede mængde indlæst. Selvom det er et statistisk ubetydeligt tab, kan noget af RABV-antigenet have denatureret under gentagen rehydrering og tørring i påfyldningsprocessen. Efter forsegling forbliver 69% ± 5% af antigenet indkapslet i en bioaktiv form. Selvom dette tyder på, at der opstår betydeligt tab under forseglingsprocessen på grund af termisk stress, forbliver det meste af det inaktiverede virale antigen intakt (figur 3B). Samtidig indkapsling af stabiliserende hjælpestoffer sammen med antigenet er en mulig strategi til yderligere at øge antigenstabiliteten gennem hele fremstillingsprocessen og har tidligere været vellykket med andre inaktiverede virusantigener^14,15.

Figur 3: Bioaktivt RABV-antigen efter partikelfremstilling . (A) Billeder viser uforseglede og forseglede partikler, der indeholder RABV-antigenet. B) Antigenstabilitet gennem partikelfremstillingsprocessen (n = 4). Belastningskontrol genereres ved at dispensere antigenet direkte i opløsningen. Fejlbjælker angiver standardafvigelsen. Skalabjælke = 200 μm. Statistisk analyse udføres ved hjælp af Tukeys flere sammenligningstest med envejs ANOVA. *p < 0,05. Billeder genereres ved fokusstabling af flere billeder og fletning af dem ved hjælp af fokusstablingssoftware. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Partikel-, fiducial- og array-dimensioner. Figuren viser de geometriske egenskaber af den firetakkede stjernefiducial (A), den cylindriske mikropartikel (B), den femtakkede stjernefiducial (C) og en række partikler med fiducials (D) vist i CAD-softwaren. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Denne figur viser et tværsnit af strukturen placeret i ovnen for at hærde PDMS-forme. Pile angiver, hvor bindeklemmer påføres. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Korrekt teknik til effektiv genvinding af koncentreret antigen. Ved afslutningen af det første spin tilbageholdes den koncentrerede prøve cirklet i rødt (A) i filteret, mens filtratet opsamles i bunden af opsamlingsrøret (større ydre rør). For at resuspendere det pelleterede antigen lukkes centrifugalfilterenheden ved hjælp af opsamlingsrøret (B) som forberedelse til hvirvelstrøm. Ved hvirvelstødning holdes spidsen af røret i kontakt med hvirvelpuden, og hætteenden roteres rundt, samtidig med at der opretholdes en vinkel på 45° med hvirvelpuden (C). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Piezoelektrisk dispenser med programmering før kørsel. (A) Opsæt "Find målreferencepunkter" ved at navigere fra "Hovedfane" til robotopsætnings- > diverse>Div.-funktionen > Find målreferencepunkter. Brug knapperne fremhævet med blåt til at indstille tillidsmærkerne. Vælg først Lær skabelon og tegn et felt omkring det betroede interessemærke, bekræft skabelonens nøjagtighed ved at klikke på Søg skabelon, og gem skabelonen. Gør dette for de fire- og femtakkede stjerner, og gem filnavnene i henhold til instruktionerne under Brug to forskellige skabelonbilleder. Sørg derefter for, at alle parametrene i de sorte bokse matcher. Indlæs den firetakkede stjernefiducial ved hjælp af indlæsningsskabelonen (grøn boks). Gem programmet "Find målreferencepunkter" ved at vælge Opgaveliste (orange boks). (B) Konfigurer kørslen ved at navigere til fanen Robotopsætning > opgaver, og indlæs derefter rækkefølgen af opgaver, der vises i den blå boks, ved at tilføje opgaver fra opgavelisten (sort boks) ved hjælp af markeringerne Opgave i kørsel (grøn boks). Gem til sidst opgaven (orange boks). (C) Opsæt "Target Substrate" ved at navigere til Robot Setup > Target Substrate, og tilføj derefter et mål (blå boks). (D) Indtast de parametre, der vises her, og vælg Gem (blå boks). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Ilægning af antigen og kalibrering af justering af udgifter. (A) Gå til fanen Dyseopsætning > opgave, og suspirer 10 μL antigen ind i dispenseringsspidsen ved at vælge TakeProbe10 uL (sort boks) og klikke på DO (sort boks). (B) Dette åbner et separat vindue. Vælg det brønd, som det koncentrerede antigen blev indlæst i, og vælg OK (blå boks). C) Når antigenet er opsuget, vaskes spidsen ved at vælge den blå boks, og denne vask gentages yderligere to gange. Vælg kameraet (sort boks), og bestem drop-lydstyrken ved at vælge drop-lydstyrke (grøn boks). Sørg for, at der dannes et stabilt fald med en volumenstandardafvigelse (%) <2 (orange boks). (D) Ved at følge disse trin åbnes Snap Drop Cam; vælg Billede (blå boks) i rullemenuen, og vælg Guiden Dysehovedkamera. Dette åbner et nyt vindue. Udfør hurtigt den næste sekvens af trin. (E) Sørg for, at målet i supplerende figur 4 er indlæst, og vælg derefter Flyt til mål (blå boks). Juster dråberne til 15, og vælg Spot (sort boks). Når du er opdaget, skal du straks vælge Flyt (grøn boks). Sørg for, at Automatisk søgning er valgt, og slet partikelstørrelse = 12, og klik derefter på Start (orange felter). Hvis den automatiske registrering mislykkes, skal du gentage denne proces, når du er flyttet til et andet område på sliden (lilla boks). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6: Programmering af spotting array og start af kørslen. (A) Naviger til målopsætningen > målet, og udfyld derefter parametrene vist i det blå felt. (B) Naviger derefter til fanen "Feltopsætning" og indtast 20 i nej. af dråbefeltet (blå boks), vælg en brønd (sort boks), og vælg derefter mål/partikler, der skal dispenseres i (grøn boks). Ved at vælge en anden brønd og genvælge mål/partikler udføres yderligere påfyldningscyklusser under en enkelt kørsel. (C) På hovedskærmen skal du sikre dig, at kørslen og målet, der er oprettet i supplerende figur 5 , er valgt. (D) Naviger til fanen "Kør", og vælg Start kørsel (blå boks). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 7: Mikropartikelinjektionsevne. (A-C) Fokusstablede stereoskopbilleder af mikropartikler fyldt med fluoresceinnatriumsalt og forseglet i en 19 G nål. D) I alt 10 partikler blev injiceret gennem en 19 G kanyle under anvendelse af en 2% carboxymethylcelluloseopløsning (n = 8). Vægtstang = 1 mm. Fejlbjælker angiver standardafvigelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 8: Potentielle problemer med antigenkoncentration. Den røde linje angiver den forventede foldstigning i koncentrationen. Fejlbjælker angiver standardafvigelse. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Tukeys flere sammenligningstest med envejs ANOVA. p < 0,001, ****p < 0,0001. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Fremstilling af buffere og opløsninger til RABV ELISA. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 1: STL-fil, der indeholder partikelarray. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 2: STL-fil, der indeholder geometri til den brugerdefinerede diasholder, der bruges til tætning af partikler. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Det er muligt at ændre partikelgeometri til specifikke behov; For cylindriske strukturer anbefaler forfatterne imidlertid at opretholde et forhold på 5: 4: 1 af højden: diameter: vægtykkelse beskrevet i protokollen. Dette billedformat sikrer, at der er nok PLGA-materiale til stede til at forsegle partiklerne og forblive mekanisk robust nok til håndtering. Partikeldimensioner og former kan let ændres under CAD-processen, hvilket gør det muligt at generere et utal af geometrier. Ved at kombinere CAD's fleksibilitet med 3D-udskrivning muliggøres hurtig iteration af mikropartikeldesign. Selvom denne protokol bruger en multi-foton 3D-printer, kan enhver 3D-printer med specifikationer, der er i stand til at udskrive mikrostrukturdimensionerne i et passende materiale, bruges til at generere den oprindelige masterform. Endvidere er fotolitografi tidligere blevet brugt til at gøre lignende strukturer i arrays meget større end dem, der produceres i denne protokol; Imidlertid ville arbejdet, forsinkelsen med at bestille specialfremstillede fotomasker og udstyrets tilgængelighed bremse den iterative designproces¹⁶. Endelig kan masterformgenerering outsources til gebyr-for-service-virksomheder, hvis intern masterformfremstilling ikke er mulig. Uanset hvilken 3D-printer eller metode, der bruges til at generere masterformene, er vedhæftningen af printet til underlaget kritisk for nedstrømstrin. Specifikt, hvis vedhæftningen er utilstrækkelig under PDMS-formgenerering, forbliver trykte partikler anbragt i PDMS-formen, hvilket kræver manuel fjernelse af de trykte partikler og ødelæggelse af masterformen.

Partikelfyldning er et andet kritisk aspekt at overveje. Mikropartikler har begrænset påfyldningskapacitet, så filtrering bruges ikke kun til at koncentrere RABV-antigenet, men også til at fjerne stamhjælpestoffer, der ellers ville optage en stor del af mikropartikelkernevolumenet. I betragtning af RABV-antigenets store størrelse (ca. 60 nm x 180 nm)¹⁷ er det imidlertid muligt delvist at pelletere antigenet under centrifugeringstrinnene. Det er derfor vigtigt at resuspendere antigenet ved pipettering eller hvirveldannelse efter centrifugering for at opnå en høj genfinding af RABV-antigenet. En stærkt koncentreret opløsning er ideel til dispensering, fordi den reducerer doseringscyklusserne og derved begrænser antigennedbrydning under påfyldning. Viskositet er imidlertid en væsentlig begrænsning for piezoelektriske dispenseringsrobotter, der danner et stabilt fald, så det er muligvis ikke muligt eller tilrådeligt at dispensere en meget høj koncentrationsopløsning. Fortynding af påfyldningsopløsningen er den nemmeste måde at opnå en stabil dråbedannelse på, men antigenstabilitet over de yderligere påfyldningscyklusser, der er nødvendige for at opnå den ønskede belastning, og den længere tid, der kræves for at fylde partikler, bør overvejes.

Begrænsninger
Denne metode kræver højt specialiseret udstyr til fremstilling af de indledende forme og et specialiseret påfyldningsinstrument til mikropartikelproduktion. Selvom behovet for en 3D-printer med en udskriftsopløsning, der er i stand til at generere de oprindelige masterforme, kan undergraves af en gebyr-for-service-tilgang, er tilgængeligheden til en piezoelektrisk dispenserrobot begrænsende. Indkøb af en piezoelektrisk dispenseringsrobot kræver en betydelig indledende forudgående investering, ofte i størrelsesordenen $ 80,000 til $ 200,000, afhængigt af mærke, gennemstrømning og kapacitet. Selv om flere andre påfyldningsmetoder er potentielle alternativer, er disse metoder ikke blevet valideret ved hjælp af RABV-antigen¹².

Fremtidige applikationer
En væsentlig del af det indkapslede RABV-antigen forblev stabilt gennem forseglingsprocessen. I teorien, ved at inkorporere dette antigen i partikler sammensat af forskellige typer PLGA, der efterligner administrationstidslinjen for profylaksebehandling efter eksponering, kunne alle doser administreres i en enkelt injektion. Eliminering af behovet for gentagne hospitalsbesøg for at administrere yderligere doser vil forbedre patientens overholdelse, hvilket resulterer i bedre behandlingsresultater. Efter at have påvist evnen til at bevare ELISA-reaktiviteten af det meget komplekse inaktiverede rabiesvirus er det desuden sandsynligt, at andre antigener, herunder underenhedsvacciner, vil være kompatible med denne indkapslingsmetode. Brug af andre profylaktiske antigener med PULSERENDE mikropartikler kan redde millioner af liv i LMIC'er ved at øge vaccinationsraterne for undervaccinerede befolkninger. For at opnå dette skal vacciner imidlertid forblive stabile gennem ikke kun indkapsling, men også frigivelse, hvilket kan være udfordrende, da nyttelasten vil blive udsat for forhøjede temperaturer og et potentielt surt mikromiljø på grund af kropsvarme og PLGA-nedbrydningsprodukter¹⁸. Fremtidigt arbejde vil forfølge stabiliserende strategier for antigenet gennem frigivelse, hvilket vil åbne potentialet for en vaccinationsplatform med en enkelt injektion, der er bredt anvendelig til forebyggelse af mange smitsomme sygdomme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm PES filter	Cole-Parmer+B4B2:B63	04396-26
0.25 mm Shims	McMaster Carr	98090A935
0.75 inch Binder Clips	Staples	480114
10 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309604
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Fisherbrand	13-678-11E
101.6 mm C-Clamp	Amazon	PT-SD-CP01A	Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens.
19 G needle	EXCELINT	26438
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Fisherbrand	13-678-11
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate	Millipore Sigma	M6514-25ML
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Eppendorf	22431081
50 mL Centrifuge Tubes	Corning	352098
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Fisherbrand	13-678-11F
Acetone	Fisher	AC268310010
Aluminum Block	McMaster Carr	9057K175
Aluminum Foil	VWR	89079-069
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa	Millipore Sigma	C82301
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100	Fisherbrand	13-678-11D
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated	Fisherbrand	14-388-100
Carboxymethyl Cellulose	Tokyo Chemical Industries	C0045
ClipTip 300, Filter, Racked	Fisherbrand	13-678-11
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube	Corning	3206
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube	Corning	3207
Describe	Nanoscribe		Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer.
Desiccator	Fisher Scientific	10529901	Or equivalent
Double-Sided Tape	Staples	649280
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium	Gibco	14200075
Ethanol	VWR	89370-084
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL	Fisherbrand	13-678-11E
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL	Fisherbrand	13-678-11F
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL	Fisherbrand	03-448-17
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL	Fisherbrand	FB14955202
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL	Fisherbrand	13-374-10
Fisherbrand Elite Pipette Kit	Fisherbrand	05-408-137
Fisherbrand Pipet Controller	Fisherbrand	FB14955202
Glass Petri Dish, 90 mm	VWR	470313-346
Glass Slides	Globe Scientific	1380-10
Helicon Focus 8	HeliconSoft		Software used to focus stack images
IP-Q Resin	Nanoscribe		Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple	Amazon	5053485896236	Or equivalent
Microscope Slide Box	Millipore Sigma	Z374385-1EA	Or equivalent
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective	Nanoscribe
NanoWrite	Nanoscribe		Software used to interface with nanoscrive 3D printer. Software provided with printer.
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate	Invitrogen	44-2404-21
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride)	Fisherbrand	02-707-432
Parafilm M Wrapping Film, 4 in.	Fisherbrand	13-374-10
PDC 60 with Type 3 Coating	Scienion	P-2020
PDMS Particle Molds	Rice University	n/a	N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array.
Petri Dish	Fisher Scientific	08-757-100D
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x)	Fisherbrand	02-707-430
Plastic Cups	Fisher Scientific	S04170
PLGA Film, 502H	Sigma	502H: 719897-1G
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate	Millipore Sigma	484431
Rabies Antigen	Chiron Behring and Bharat Biotech International		Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company.
Razor Blades	VWR	55411-050
Scalpel	VWR	21899-530 and 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60	Scienion		Or equivalent
Sealing Tape for 96-Well Plates	Thermo Scientific	15036
Silicon Wafer	University Wafer	1025
Spring Clamps	IRWIN	VGP58100
Stainless Steel Block	McMaster Carr	9083K12
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive	Fisherbrand	02-707-404
Sylgard 184	DOW	2646340
Teflon Sheet	McMaster Carr	9266K12	Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces.
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick	McMaster Carr	9266K81
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane	Sigma	448931-10G
Tweezers	Pixnor	ESD-16
UltraPure Distilled Water	Fisher Scientific	10977015
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker	UVP	95-0174-01	Or equivalent
Vacuum Desiccator	Bel-Art	F420100000	Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination.
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C	VWR	97027-664	Or equivalent
Vacuum, CRVpro4	Welch	3041-01	Or equivalent
Wooden Tongue Depressors	Electron Microscopy Sciences	72320