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Bioengineering

"रेबीज एंटीजन को एनकैप्सुलेट करने वाले पल्सेटाइल पॉलीमेरिक माइक्रोपार्टिकल्स का निर्माण"।

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65147
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 2, 1, 2, 1,4
1Department of Bioengineering, Rice University, 2Particles for Humanity, 3IMPACT Technology Development, 4Department of Chemistry, Rice University
* These authors contributed equally

Summary

यह विधि संरचनात्मक और भौतिक गुणों के साथ बायोडिग्रेडेबल पॉलीमेरिक माइक्रोपार्टिकल्स में रेबीज एंटीजन के एनकैप्सुलेशन का वर्णन करती है जो पूर्व निर्धारित देरी के बाद पल्सटाइल रिलीज को सक्षम करती है। कण कोर से प्राप्त एंटीजन का एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) मूल्यांकन कण निर्माण के माध्यम से बरकरार ट्राइमेरिक रेबीज वायरस ग्लाइकोप्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करता है।

Abstract

रेबीज पोस्ट-एक्सपोजर प्रोफिलैक्सिस के लिए वर्तमान दिशानिर्देशों में कई हफ्तों में कई इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। यह कम और मध्यम आय वाले देशों (LMICs) में रहने वाले लोगों के लिए असंगत रूप से बोझिल हो सकता है, जहां रेबीज के अधिकांश घातक जोखिम होते हैं। एंटीजन को पॉलीमेरिक कणों में एनकैप्सुलेट करके वैक्सीन रेजिमेन को एक इंजेक्शन में संघनित करने के लिए विभिन्न दवा वितरण रणनीतियों का पता लगाया गया है। हालांकि, एनकैप्सुलेशन प्रक्रिया के दौरान कठोर तनाव एनकैप्सुलेटेड एंटीजन के विकृतीकरण का कारण बन सकता है। यह लेख रेबीज वायरस (आरएबीवी) एंटीजन को बहुलक माइक्रोपार्टिकल्स में एनकैप्सुलेट करने की एक विधि का वर्णन करता है जो असमर्थ पल्सटाइल रिलीज प्रदर्शित करते हैं। यह विधि, जिसे पार्टिकल्स यूनिफॉर्मली लिक्विफाइड एंड सील्ड टू एनकैप्सुलेट ड्रग्स (स्पंदित) कहा जाता है, एक मल्टी-फोटॉन, 3 डी-प्रिंटेड मास्टर मोल्ड से व्युत्क्रम पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) मोल्ड बनाने के लिए सॉफ्ट लिथोग्राफी का उपयोग करके माइक्रोपार्टिकल्स उत्पन्न करता है। पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड) (पीएलजीए) फिल्मों को तब पीडीएमएस मोल्डों में संपीड़न-ढाला जाता है ताकि खुले चेहरे वाले सिलेंडर उत्पन्न किए जा सकें जो पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसिंग रोबोट का उपयोग करके केंद्रित आरएबीवी से भरे होते हैं। इन सूक्ष्म संरचनाओं को तब कणों के शीर्ष को गर्म करके सील किया जाता है, जिससे सामग्री को प्रवाह करने और एक निरंतर, गैर-छिद्रपूर्ण बहुलक बाधा बनाने की अनुमति मिलती है। निर्माण के बाद, एक एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) जो बरकरार ट्राइमेरिक रेबीज वायरस ग्लाइकोप्रोटीन का पता लगाने के लिए विशिष्ट है, का उपयोग माइक्रोपार्टिकल्स से इम्युनोजेनिक एंटीजन की उच्च वसूली की पुष्टि करने के लिए किया जाता है।

Introduction

टीकाकरण एक अत्यंत प्रभावी स्वास्थ्य सेवा उपकरण है, जिसने 2000 और 2019 के बीच 37 मिलियन से अधिक मौतों को रोकाहै। इस प्रभावशीलता के बावजूद, वैक्सीन-रोकथाम योग्य बीमारियां वैश्विक स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम पैदा करना जारी रखती हैं, विशेष रूप से निम्न और मध्यम आय वाले देशों (LMICs) में जहां गैर-और कम-टीकाकरण की उच्च दर सालाना 1.5 मिलियन वैक्सीन-रोकथाम योग्य मौतों में योगदान करतीहै। रेबीज इन असमानताओं का कोई अपवाद नहीं है। मानव जाति के लिए ज्ञात सबसे घातक बीमारी के रूप में इसकी स्थिति के बावजूद, लगभग सार्वभौमिक रूप से घातक होने के नाते, रेबीज पूरी तरह से इलाज योग्य है और कई उच्च आय वाले देशों में उन्मूलन के रूप में वर्गीकृत किया गया है। इसके बजाय, रेबीज का बोझ एशिया और अफ्रीका के कुछ हिस्सों में रहने वाले लोगों द्वारा असमान रूप से वहन किया जाता है, जहां बीमारी के मनुष्योंऔर पशुधन पर विनाशकारी परिणाम होते हैं।

रेबीज5 के वैश्विक प्रभाव के प्रबंधन के लिए टीकाकरण महत्वपूर्ण है। टीकाकरण की लागत रोग की समग्र कम घटनाओं को देखते हुए प्री-एक्सपोजर प्रोफिलैक्सिस (पीआरईपी) के व्यापक कार्यान्वयन को प्रतिबंधित करती है। इसके अलावा, एलएमआईसी में, पोस्ट-एक्सपोजर प्रोफिलैक्सिस (पीईपी) की उपयोगिता स्वास्थ्य देखभाल की मांग करने वाले रोगियों पर सामाजिक आर्थिक दबावों से सीमित है। तार्किक कारक, जैसे कि स्वास्थ्य देखभाल पहुंच बिंदुओं तक यात्रा की दूरी, उपचार प्राप्त करते समय मजदूरी में कमी, उपचार की लागत, दैनिक गतिविधियों में हस्तक्षेप करने वाली नियुक्तियां, और भूलने की बीमारी, के परिणामस्वरूप पीईपी पालन दर 60% 6,7 तक कम हो जाती है। यह उच्च रोगी एट्रिशन रेट बीमारी का मुकाबला करने के लिए रेबीज टीकाकरण में अंतराल को संबोधित करने के लिए दृष्टिकोण को परिष्कृत करने का अवसर प्रस्तुत करता है।

एकल-इंजेक्शन (एसआई) टीकाकरण प्रणाली जो एंटीजन की रिहाई को नियंत्रित करती है, को एक इंजेक्शन में पूर्ण टीकाकरण प्राप्त करने के तरीकों के रूप में खोजा गया है। एक स्वास्थ्य सेवा प्रदाता के लिए कई यात्राओं की आवश्यकता को समाप्त करना उन बोझ ों को कम करता है जो व्यक्तियों को पर्याप्त देखभाल की मांग करने से रोकते हैं। एसआई टीकाकरण प्राप्त करने के लिए, एक एंटीजन को आमतौर पर एक बायोडिग्रेडेबल पॉलीमेरिक मैट्रिक्स के भीतर समझाया जाता है जो अक्सर इंजेक्टेबल माइक्रोपार्टिकल्स का रूप लेता है। एक बार इंजेक्शन लगाने के बाद, बहुलक अवक्रमित एंटीजन को नीचा दिखाता है और जारी करता है। आज तक, एसआई टीकाकरण प्राप्त करने के लिए दो प्राथमिक रिलीज रणनीतियों का पालन किया गया है। एक दृष्टिकोण में, एंटीजन को समय की विस्तारित अवधि में लगातार जारी किया जाता है। यद्यपि एक इंजेक्शन की इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ाने का इरादा है, यह स्पष्ट नहीं है कि यह दृष्टिकोण मनुष्यों में रेबीज वायरस (आरएबीवी) के खिलाफ सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैया नहीं। दूसरे में, एंटीजन को एक पारंपरिक और सिद्ध प्राइम-बूस्ट वैक्सीन रेजिमेन की नकल करने के लिए पूर्व निर्धारित देरी के बाद जारी किया जाता है। विलायक वाष्पीकरण-आधारित माइक्रोपार्टिकल निर्माण विधियां पूर्व रणनीति का प्रदर्शन करती हैं, और इसका उपयोग मॉडल वैक्सीन9 और अत्यधिक स्थिर एंटीजन, जैसे टेटनस टॉक्सॉइड10 दोनों को सफलतापूर्वक समाहित करने के लिए किया गया है। हालांकि, इन एनकैप्सुलेशन विधियों में गर्मी, विलायक बातचीत और भौतिक बलों सहित तनाव शामिल हैं, जो एंटीजन11 को विकृत कर सकते हैं।

कणों को समान रूप से द्रवित और सील करके एनकैप्सुलेट ड्रग्स (स्पंदित) एक हाल ही में विकसित निर्माण विधि है जिसे बायोडिग्रेडेबल माइक्रोपार्टिकल्स में जीवविज्ञान को समाहित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। माइक्रोमोल्डिंग का उपयोग उन कणों को उत्पन्न करने के लिए किया जाता है जो एक तरल पेलोड से भरे होते हैं और बहुलक को बायोडिग्रेडेबल बहुलक की एक सन्निहित परत के भीतर कार्गो के केंद्रीय डिपो को पुन: प्रवाह और पूरी तरह से समाहित करने की अनुमति देने के लिए गर्म किया जाता है। इस माइक्रोस्ट्रक्चर के परिणामस्वरूप पेलोड की पल्सटाइल रिलीज होती है, एक अवधि के बाद जो पॉलिमरिक शेल12 की गिरावट दर पर निर्भर होती है। यह पांडुलिपि पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड) (पीएलजीए) से बने सूक्ष्म कणों के भीतर निष्क्रिय आरएबीवी के एनकैप्सुलेशन को प्रदर्शित करती है, जो कई एफडीए-अनुमोदित फॉर्मूलेशन13 में उपयोग किया जाने वाला एक बायोडिग्रेडेबल बहुलक है, जो एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा मूल्यांकन के रूप में स्थिर आरएबीवी एंटीजन को समाहित करने के लिए स्पंदित निर्माण विधि का उपयोग करता है। पीएलजीए कणों को विभिन्न आणविक भार और / या अंतिम समूहों के साथ जोड़कर, इस दृष्टिकोण में एकल इंजेक्शन के बाद वर्तमान रेबीज टीकाकरण समय पाठ्यक्रम की नकल करने की क्षमता है।

Protocol

1. कण मास्टर मोल्ड पीढ़ी

नोट: 3 डी प्रिंटिंग प्रक्रिया पर्याप्त स्थानिक संकल्प के साथ किसी भी 3 डी प्रिंटर के साथ किया जा सकता है; हालाँकि, वर्तमान प्रोटोकॉल एक बहु-फोटॉन 3 डी प्रिंटर के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है।

  1. कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) प्रोग्राम का उपयोग करके माइक्रोपार्टिकल संरचनाओं को डिजाइन करें।
    नोट: डिजाइन विनिर्देश निम्नानुसार हैं: 308 कण (व्यास = 400 μm, ऊंचाई = 500 μm, और दीवार की मोटाई = 100 μm) को 22 से 14 सरणी में व्यवस्थित किया जाता है, उनके बीच 600 μm की दूरी होती है। डिजाइन में एक चार-बिंदु वाला सितारा और एक पांच-बिंदु वाला सितारा भी शामिल है जो सरणी के ठीक बाहर फिड्यूशियल के रूप में है (पूरक चित्र 1)।
  2. अंतिम डिजाइन को एसटीएल फ़ाइल (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) के रूप में निर्यात करें और फ़ाइल को नीचे दिखाए गए अनुसार प्रिंट पैरामीटर को परिभाषित करने में सक्षम सॉफ़्टवेयर पर अपलोड करें। फिर, इसे 3 डी प्रिंटर के साथ संगत फ़ाइल के रूप में सहेजें (सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: स्लाइसिंग दूरी = 5 μm, हैचिंग दूरी = 1 μm, शेल कंटूर = 50 μm, बेस स्लाइस काउंट = 5 μm, मचान = खोखला, स्कैन मोड = गैल्वो, z-अक्ष = माइक्रोस्कोप z-ड्राइव, स्कैन गति = 100,000, शक्ति = 100।
  3. प्लाज्मा सफाई प्रक्रिया (गैस: ओ2; शक्ति: 200 वाट; तापमान: 25 डिग्री सेल्सियस; प्रवाह: 20; समय: 5 मिनट) का उपयोग करके एक सिलिकॉन प्रिंटिंग सब्सट्रेट (सामग्री की तालिका देखें) का पूर्व-उपचार करें, फिर तुरंत सब्सट्रेट को 30 एमएल इथेनॉल और 60 μl 3-(ट्राइमेथॉक्सीसिलिल) प्रोपिल मेथैक्रिलेट के घोल में एक ग्लास पेट्री डिश में डुबोएं। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें और रात भर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    नोट: यह कदम सब्सट्रेट के लिए प्रिंट आसंजन बढ़ाता है, जो पीडीएमएस पृथक्करण (चरण 2.6) के दौरान महत्वपूर्ण है।
  4. मल्टी-फोटॉन 3 डी प्रिंटर पर प्रिंट फ़ाइल अपलोड करें, उपचारित सब्सट्रेट पर प्रिंट राल लागू करें, 10x लेंस लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें), और माइक्रोस्ट्रक्चर प्रिंट करें।
  5. एक बार समाप्त होने के बाद, प्रिंट को प्रोपलीन ग्लाइकोल मिथाइल ईथर एसीटेट ( सामग्री की तालिका देखें) में 45 मिनट के लिए डुबोएं ताकि अनएक्सपोज़्ड फोटोरेसिस्ट को हटाया जा सके, फिर प्रिंट को 5 मिनट के लिए आइसोप्रोपिल अल्कोहल में डुबोएं। 120 मिनट के लिए 254 एनएम पर यूवी प्रकाश को उजागर करके मास्टर मोल्ड को ठीक करें।
    नोट: यदि उपलब्ध हो, तो 405 से 365 एनएम रेंज में यूवी प्रकाश का उपयोग मुद्रित संरचनाओं को पोस्ट-ठीक करने के लिए ~ 20 मिनट के लिए किया जा सकता है।

2. पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) मोल्ड जनरेशन

  1. 3 डी-मुद्रित मास्टर मोल्ड की सतह को एक वैक्यूम कक्ष में रखकर उपचारित करें जिसमें 40 μL ट्राइक्लोरो (1H, 1H, 2H, 2H, -perfluroctyl) के साथ एक ग्लास स्लाइड होती है (सामग्री की तालिका देखें) सिलेन सतह पर जोड़ा जाता है। वैक्यूम खींचें (सापेक्ष दबाव: -20 इंच)। एचजी) 1 घंटे के लिए।
    नोट: यह चरण डिमोल्डिंग (चरण 2.6) के दौरान आसान पृथक्करण सुनिश्चित करता है।
  2. जबकि मास्टर मोल्ड सतह का इलाज किया जा रहा है, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) प्रीपॉलिमर बेस को पीडीएमएस प्रीपॉलिमर इलाज एजेंट के साथ द्रव्यमान द्वारा 9: 1 अनुपात में अच्छी तरह से मिलाएं (प्रत्येक मास्टर मोल्ड के लिए कम से कम 10 ग्राम सामग्री की आवश्यकता होती है)। एक बार अच्छी तरह से मिश्रित होने के बाद, बिना ठीक किए गए पीडीएमएस को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. एक बार सतह उपचार पूरा हो जाने के बाद, मास्टर मोल्ड को एल्यूमीनियम पन्नी डिश में रखें और मोल्ड के शीर्ष पर अप्रयुक्त पीडीएमएस डालें, यह सुनिश्चित करें कि विशेषताएं पूरी तरह से जलमग्न हैं। एल्यूमीनियम पन्नी डिश को एक वैक्यूम कक्ष में रखें और वैक्यूम खींचें (सापेक्ष दबाव: -20 इंच)। हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 1 घंटे के लिए एचजी)।
  4. वैक्यूम कक्ष से एल्यूमीनियम पन्नी पकवान निकालें। मास्टर मोल्ड के सिरों पर 800 μm स्पेसर्स रखें और मास्टर मोल्ड पर एक साफ ग्लास स्लाइड को ओवरले करें, हवा के बुलबुले पेश करने से बचने का ध्यान रखें। मोल्ड और स्लाइड को एक साथ दबाने के लिए बाइंडर क्लिप का उपयोग करें, स्पेसर्स पर क्लैंपिंग बल का स्थानीयकरण करें (पूरक चित्रा 2)।
  5. प्रीपॉलिमर को पीडीएमएस मोल्ड में ठीक करने के लिए संरचना को कम से कम 4 घंटे के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर सेट ओवन में रखें।
  6. ओवन से संरचना को हटा दें, बाइंडर क्लिप को ध्यान से जारी करें, और रेजर ब्लेड का उपयोग करके ठीक किए गए पीडीएमएस मोल्ड से मास्टर मोल्ड को सावधानीपूर्वक अलग करें।
    नोट: 3 डी-मुद्रित मास्टर मोल्ड अतिरिक्त पीडीएमएस मोल्ड उत्पन्न करने के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है।

3. पीएलजीए फिल्म निर्माण

  1. पीएलजीए के 450 मिलीग्राम का वजन करें ( सामग्री की तालिका देखें) और इसे 50.8 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ 250 μm मोटी रिंग शिम के भीतर 76 मिमी × 76 मिमी नॉनस्टिक पॉलिमर शीट पर रखें। पीएलजीए के ऊपर एक दूसरी नॉनस्टिक पॉलिमर शीट रखें और 101.6 मिमी सी-क्लैंप का उपयोग करके दो एल्यूमीनियम ब्लॉकों के बीच स्टैक को उंगली-तंग होने तक संपीड़ित करें।
    नोट: 502 एच पीएलजीए का उपयोग विशेष रूप से इस अध्ययन में किया गया था; हालांकि, अन्य प्रकार के पीएलजीए इस प्रक्रिया के साथ संगत हैं।
  2. सी-क्लैंप ्ड असेंबली को वैक्यूम ओवन में 30 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, जिसमें -30 इंच एचजी का सापेक्ष दबाव हो। फिर, असेंबली को हटा दें और इसे वैक्यूम ओवन में वापस 30 मिनट के लिए रखने से पहले क्लैंप को मजबूती से कस लें।
    नोट: वैक्यूम का उपयोग करने का प्राथमिक उद्देश्य पीएलजीए गिरावट से बचना है, जो उच्च तापमान पर त्वरित होता है।
  3. असेंबली को ओवन से निकालें और इसे एक डेसिकेटर में 4 घंटे तक ठंडा होने दें।
  4. ठंडा होने के बाद, क्लैंप को ढीला करें, नॉनस्टिक पॉलिमर शीट से पीएलजीए फिल्म को हटा दें, और फिल्म को एक लेबल पेट्री डिश में रखें। बाद में उपयोग के लिए पेट्री डिश को डेसिकेटर के अंदर स्टोर करें।

4. पीएलजीए कण उत्पादन

  1. चरण 2.1 में पहले वर्णित पीडीएमएस मोल्ड की सतह का इलाज करें।
  2. चिमटी और / या एक स्केलपेल का उपयोग करके, 250 μm PLGA फिल्म के एक हिस्से को काट लें और उपचारित PDMS मोल्ड पर लगभग सरणी के आकार का रखें।
  3. पीएलजीए फिल्म और पीडीएमएस मोल्ड के शीर्ष पर एक साफ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड को ओवरले करें और सरणी और पीएलजीए फिल्म पर सीधे स्प्रिंग क्लैंप रखकर घटकों को एक साथ दबाएं।
  4. क्लैंप ्ड मोल्ड असेंबली को वैक्यूम ओवन में 120 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और -30 इंच के सापेक्ष दबाव के साथ वैक्यूम को खींचें। 1 घंटे के लिए एचजी।
    नोट: कणों को बनाने के लिए आवश्यक समय पीएलजीए पर निर्भर करता है, और 1-12 घंटे से भिन्न हो सकता है।
  5. क्लैंप ्ड मोल्ड असेंबली को ओवन से हटा दें और इसे लगभग 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर निष्क्रिय रूप से ठंडा होने दें, या स्पर्श के लिए ठंडा होने दें।
  6. रेजर ब्लेड का उपयोग करके, दोनों को अलग करने के लिए पीडीएमएस मोल्ड और पीएलजीए कण सरणी के बीच धीरे से दबाव लागू करें। पीएलजीए कणों को भविष्य में उपयोग के लिए एक डेसिकेटर में स्टोर करें।

5. एंटीजन एकाग्रता और शुद्धि

  1. कमरे के तापमान पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएबीवी एंटीजन ( सामग्री की तालिका देखें) के एक एलिकोट को पिघलाएं।
  2. दो संग्रह ट्यूबों में 100 केडीए आणविक भार कटऑफ (एमडब्ल्यूसीओ; सामग्री की तालिका देखें) के साथ दो केन्द्रापसारक स्पिन फिल्टर रखकर निस्पंदन सेटअप को इकट्ठा करें।
  3. अल्ट्राप्योर पानी के 500 μL जोड़कर दो केन्द्रापसारक स्पिन फिल्टर को प्रीवेट करें।
  4. कमरे के तापमान पर एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में 1 मिनट के लिए 2,400 x g पर फिल्टर को स्पिन करें।
  5. 200 μL पिपेट का उपयोग करके निस्पंदन सेटअप के शीर्ष और निचले दोनों डिब्बों से पानी निकालें।
    नोट: प्रीवेटेड स्पिन फिल्टर को सूखने न दें।
  6. प्रत्येक स्पिन फिल्टर के शीर्ष डिब्बे में 400 μL आसुत जल जोड़ें, फिर पिघले हुए RABV एंटीजन के 100 μL जोड़ें और पिपेट के साथ मिलाएं।
    नोट: इस अध्ययन ने एंटीजन को लगभग पांच गुना केंद्रित किया और एक्सिपिएंट्स <100 केडीए की एकाग्रता को ~ 50 गुना कम कर दिया।
  7. दो केन्द्रापसारक स्पिन फिल्टर को एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में लोड करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि फिल्टर सेंट्रीफ्यूज के केंद्र का सामना करते हैं। चिह्नित करें कि फिल्टर का कौन सा पक्ष सेंट्रीफ्यूज के केंद्र की ओर है।
    नोट: यदि गलत तरीके से उन्मुख है, तो समाधान ठीक से फ़िल्टर / केंद्रित नहीं किया जाएगा।
  8. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर फिल्टर को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. सेंट्रीफ्यूज से फ़िल्टर पुनर्प्राप्त करें। संग्रह ट्यूबों में छानना होगा, जबकि फिल्टर में केंद्रित नमूना होगा (पूरक चित्रा 3 ए)।
  10. एक पिपेट का उपयोग करके संग्रह ट्यूबों में छानना निकालें और फेंक दें।
  11. प्रत्येक फिल्टर में 450 μL फ़िल्टर ्ड आसुत जल जोड़ें, और केंद्रित नमूने और पानी को छह बार ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
  12. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर दूसरी बार दो स्पिन फिल्टर को सेंट्रीफ्यूज करें। सुनिश्चित करें कि फिल्टर सेंट्रीफ्यूज के केंद्र का सामना उसी अभिविन्यास में करें जैसा कि चरण 5.7 में है।
  13. सेंट्रीफ्यूज से फ़िल्टर इकाइयों को पुनः प्राप्त करें और, पहले की तरह, पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक ट्यूब से छानना निकालें और छोड़ दें।
  14. संग्रह ट्यूबों से स्पिन फिल्टर निकालें और संग्रह ट्यूबों के शीर्ष का उपयोग करके फ़िल्टर आवरण को कैप करें (पूरक चित्रा 3 बी)।
  15. स्पिन फिल्टर आवरण के निचले भाग को सीधे एक भंवर पर रखें और 30 सेकंड के लिए 3,000 आरपीएम पर भंवर और भंवर रखें, जबकि फिल्टर आवरण को सीधा और 45 डिग्री कोण पर रखें (पूरक चित्र 3 सी)।
    नोट: इस कदम का उद्देश्य सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया के दौरान गोली बनाने वाले किसी भी आरएबीवी एंटीजन को फिर से निलंबित करना है।
  16. स्पिन फिल्टर आवरण से संग्रह ट्यूबों की टोपी को सावधानीपूर्वक हटा दें। फ़िल्टर आवरण को प्रदान किए गए संग्रह ट्यूबों में वापस रखें और किसी भी मात्रा को इकट्ठा करने के लिए एक त्वरित स्पिन (2-3 एस) चलाएं जो टोपी में फंस गया हो।
    नोट: इस त्वरित स्पिन को बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में किया जाना चाहिए। फिल्टर को सेंट्रीफ्यूज के लिए स्पर्शरेखीय होना चाहिए, पिछले कॉन्फ़िगरेशन के विपरीत, यह सुनिश्चित करने के लिए कि फिल्टर के माध्यम से कोई समाधान खो न जाए।
  17. प्रत्येक स्पिन फ़िल्टर यूनिट को स्पिन फ़िल्टर किट ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ प्रदान की गई एक नई संग्रह ट्यूब में इनवर्ट करें, और केंद्रित नमूने एकत्र करने के लिए कमरे के तापमान पर 1,000 x g पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  18. दो संग्रह ट्यूबों से केंद्रित नमूनों को एक संग्रह ट्यूब में समेकित करें। परिणामी आयतन को मापें और रिकॉर्ड करें.
    नोट: परिणामी नमूने में स्टॉक के रूप में प्रारंभिक एंटीजन एकाग्रता 5 गुना होगी, स्टॉक की तुलना में लगभग 50 गुना कम एक छोटी एक्सिपियन (<100 केडीए) एकाग्रता होगी, और थोड़ा दूधिया सफेद दिखाई देगा। कुल मात्रा लगभग 44-48 μL होनी चाहिए।
  19. वितरण के समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 5x केंद्रित, दो बार धोए गए एंटीजन को स्टोर करें, लेकिन 16 घंटे से अधिक समय तक नहीं। इस समाधान के साथ कणों को भरने से पहले, किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए 1 मिनट के लिए ट्यूब को 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। वितरण के लिए नाममात्र लक्ष्य एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आसुत जल का उपयोग करके समाधान को पतला किया जा सकता है।

6. कण भरने

  1. वैक्यूम फ़िल्टर 0.22 μm वैक्यूम फ़िल्टर के माध्यम से 500 mL विआयनीकृत पानी को फ़िल्टर करें, फिर वैक्यूम (सापेक्ष दबाव: -20 इंच) लागू करके समाधान को हटा दें। एचजी) 20 मिनट के लिए सोनिकेशन के तहत रहते हुए।
  2. इस समय के दौरान, पीज़ो डिस्पेंसर को पीज़ोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसर में पीज़ो डिस्पेंसर से पीज़ो डिस्पेंसर (पीडीसी; सामग्री की तालिका देखें) संलग्न करें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार मशीन को प्राइम करें ( सामग्री की तालिका देखें), और पीएलजीए कणों के साथ स्लाइड को वितरण क्षेत्र में रखें।
  4. पूरक चित्र 4 के अनुसार, "लक्ष्य संदर्भ बिंदु खोजें" सेट करें, चलाएं, और फिर "लक्ष्य सब्सट्रेट" सेट करें।
  5. स्रोत प्लेट में केंद्रित एंटीजन के 25 μL लोड करें और इसे मशीन में लोड करें। पीडीसी का उपयोग करके, डिस्पेंसिंग टिप में केंद्रित एंटीजन के 10 μL को एस्पिरेट करें, टिप के बाहर धोएं, फिर डिस्पेंसिंग संरेखण को कैलिब्रेट करें (पूरक चित्रा 5)।
  6. "लक्ष्य सेटअप पैरामीटर" दर्ज करें और रन (पूरक चित्रा 6) पर क्लिक करें।
  7. एक बार पूरा होने के बाद, भरे हुए कणों को हटा दें और सत्यापित करें कि वे स्टीरियोस्कोप के तहत भरे हुए हैं।
  8. प्रोटोकॉल में अगले चरण पर सीधे जाएं।

7. कण सीलिंग और कटाई

  1. एक हॉटप्लेट पर एक स्टेनलेस-स्टील ब्लॉक ( सामग्री की तालिका देखें) रखें। स्टेनलेस-स्टील ब्लॉक पर दो माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें ताकि वे समानांतर हों। सुनिश्चित करें कि स्टेनलेस स्टील ब्लॉक स्तर है, फिर हॉटप्लेट को चालू करें और तापमान सेट करें ताकि स्टेनलेस स्टील की सतह का तापमान 200 डिग्री सेल्सियस हो। सील करने से पहले हॉटप्लेट के तापमान की जांच करें।
  2. भरे हुए पीएलजीए कणों को हॉटप्लेट के ऊपर दो ग्लास स्लाइड पर रखकर निलंबित करें, फिर तुरंत 18 सेकंड के लिए टाइमर शुरू करें।
    नोट: कणों को सील करने के लिए आवश्यक समय और गर्मी के कणों की मात्रा कणों को बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले पीएलजीए के रासायनिक गुणों के आधार पर अलग-अलग होगी। हॉटप्लेट से सुरक्षित दूरी पर स्लाइड को संभालने के लिए एक कस्टम 3 डी-मुद्रित स्लाइड धारक का उपयोग किया जा सकता है। एसटीएल फ़ाइल पूरक कोडिंग फ़ाइल 2 के रूप में प्रदान की जाती है।
  3. एक बार सील होने के बाद, कण सरणी को हॉटप्लेट से हटा दें और कण सरणी को दो अलग-अलग ग्लास स्लाइड पर रखकर लैब बेंच पर निलंबित कर दें। कणों को 1 मिनट के लिए ठंडा होने दें।
  4. एक बार ठंडा होने के बाद, कणों को स्टीरियोस्कोप के माध्यम से देखते हुए स्केलपेल का उपयोग करके काटा जा सकता है। स्लाइड के 45 ° कोण पर ब्लेड के साथ स्केलपेल को पकड़ें और इसे ग्लास स्लाइड से अलग करने के लिए कण के आधार पर दबाव लागू करें।
  5. एक बार कटाई के बाद, कणों को 0.5 एमएल कम-प्रोटीन बाइंडिंग ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। फिर, ट्यूबों को 1x फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) के 250 μL के साथ भरें जिसमें 30 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 1 मिलीग्राम / एमएल ग्लूकोज होता है।
    नोट: पीबीएस में तैयार 30 मिलीग्राम / एमएल बीएसए और 1 मिलीग्राम / एमएल ग्लूकोज समाधान आरएबीवी एंटीजन की स्थिरता बनाए रखेगा।
  6. बारीक टिप चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके एक स्टीरियोस्कोप के नीचे कणों को कुचल दें। सुनिश्चित करें कि कण के मूल में आरएबीवी एंटीजन आसपास के घोल में घुलने के लिए उपलब्ध है। नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें जब तक कि एलिसा का उपयोग करके एंटीजन शक्ति का मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है। नमूने तैयारी के 7 दिनों के भीतर एक ईएलएसआईए पर चलाया जाना चाहिए।

8. एलिसा द्वारा एंटीजन का मूल्यांकन

सावधानी: किसी भी बिंदु पर माइक्रोप्लेट्स को सूखने न दें। हमेशा प्लेटों को ढेर करें, और हमेशा ऊपरी प्लेट को प्लास्टिक की सील, एक खाली प्लेट, या एक ढक्कन के साथ कवर करें ताकि सूखने से बचा जा सके।

  1. पूरक फाइल 1 में दिए गए निर्देश के अनुसार बफर तैयार करें।
  2. 2.5 μg /mL की सांद्रता पर 5 मिलीलीटर कोटिंग समाधान (कार्बोनेट-बाइकार्बोनेट बफर, pH 9.6) तैयार करें, जिसमें pH 9.4-9.6 पर 4975 μL कोटिंग बफर में 25 μL कोटिंग एंटीबॉडी जोड़ें।
    नोट: 50 μL के साथ 96 कुओं को कोट करने के लिए 5 एमएल की आवश्यकता होती है (पाइपिंग हानि के लिए अतिरिक्त मात्रा के साथ)। आवश्यक प्रत्येक अतिरिक्त एलिसा प्लेट के लिए कुल मात्रा 5 एमएल बढ़ाएं।
  3. माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में कोटिंग समाधान के 50 μL वितरित करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। समाधान तैयार होने के तुरंत बाद कोटिंग के लिए उपयोग किया जाना चाहिए।
  4. धीरे-धीरे एक हथेली पर प्लेट किनारों के साथ टैप करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्रत्येक कुएं का तल समान रूप से तरल से ढका हुआ है।
  5. चिपकने वाली फिल्म के साथ प्लेट को सील करें और इसे 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें, फिर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
  6. कोल्ड स्टोरेज से प्लेटों को पुनः प्राप्त करें और उन्हें प्रत्येक कुएं में 200 μL वॉश बफर के साथ तीन बार धोएं।
  7. वॉश बफर को हटा दें और प्रत्येक कुएं में 300 μL ब्लॉकिंग बफर वितरित करें।
    सावधानी: अलग-अलग प्लेटों पर दोहराए गए एक ही नमूने के साथ कई प्लेटों को चलाते समय, प्लेट-दर-प्लेट आगे बढ़ना महत्वपूर्ण है (यानी, प्लेट 2 पर आगे बढ़ने से पहले सामग्री के साथ प्लेट 1 भरें, और फिर प्लेट 3 और इसी तरह)। सभी प्लेटों और फिर सामग्री वाई, आदि पर सामग्री एक्स लागू न करें, क्योंकि इससे कुओं के सूखने का खतरा बढ़ जाएगा। अंतिम धोने के चरण के बाद, वॉश बफर को प्लेट के कुओं में रहना चाहिए और प्लेट में नमूने जोड़ने से पहले केवल तुरंत फेंक दिया जाना चाहिए। एलिसा प्लेट के सभी कुओं को कवर करने के लिए एक प्लास्टिक 96-वेल प्लेट ढक्कन का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जिन्हें सीधे वितरित नहीं किया जा रहा है, और ढक्कन को क्रमिक रूप से सामग्री से भरे जाने वाले अतिरिक्त कुओं को प्रकट करने के लिए स्थानांतरित किया जाता है।
  8. प्लेटों को चिपकने वाली प्लास्टिक फिल्म ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ सील करें और उन्हें 37 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर 60 ± 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
  9. इस इनक्यूबेशन के दौरान मूल्यांकन किए जाने वाले मानक वक्र और परीक्षण नमूने तैयार करें।
    नोट: मूल्यांकन किए जा रहे एंटीजन को 0.125 आईयू / एमएल के अनुशंसित कमजोर पड़ने पर डिल्यूएंट बफर में पूर्व-पतला किया जाना चाहिए, जिसमें पाइपिंग हानि के लिए कम से कम 40 μL की अतिरिक्त मात्रा हो। सभी नमूनों का मूल्यांकन प्रत्येक एलिसा प्लेट पर डुप्लिकेट (दो तकनीकी प्रतिकृति) में किया जाता है। मानक वक्र के लिए, प्रत्येक एलिसा प्लेट के कॉलम 2 और 3 में कुल आठ बिंदुओं के लिए एक दोहरी कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला शामिल की जानी चाहिए। मूल्यांकन किए जा रहे एंटीजन की अनुमानित मात्रा के आधार पर उचित संख्या में बिंदुओं के साथ अन्य सभी नमूनों के लिए एक कमजोर पड़ने की श्रृंखला की जा सकती है। हालांकि उच्च थ्रूपुट के लिए कम कठोर, ऊपर वर्णित चढ़ाना के विकल्प के रूप में एक एकल नमूना कमजोर पड़ने का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, एकल कमजोर पड़ने की अपेक्षित एकाग्रता मानक वक्र सीमा के भीतर होनी चाहिए।
  10. कम-बाइंड प्रोटीन 96-वेल प्लेटों, या कम-बाइंड प्रोटीन ट्यूबों (सामग्री की तालिका देखें) में, प्लेट के स्तंभों के साथ प्रत्येक नमूने की दोहरी कमजोर पड़ने की श्रृंखला करें।
  11. प्रत्येक संबंधित नमूने के लिए पंक्ति ए में तनुकरण श्रृंखला की शुरुआत को आवश्यक अंतिम मात्रा से दोगुना लोड करें (प्रति प्लेट, प्रति कुएं 100 μL नमूने की आवश्यकता होती है, इसलिए A2-A11 के सभी कुओं में कम से कम 240 μL नमूना होना चाहिए, जिसमें पाइपिंग हानि के लिए 40 μL की अतिरिक्त मात्रा होनी चाहिए)।
  12. कॉलम 1 और 12 (यानी, बी 2 से एच 11) को छोड़कर, कम-बाइंड प्रोटीन प्लेट पर अन्य सभी कुओं में 120 μL डिल्यूएंट बफर लोड करें।
  13. 10 युक्तियों से भरे मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, ए 2-ए 11 से बी 2-बी 11 में 120 μL नमूने को स्थानांतरित करके सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें और छींटे और बुलबुले से बचते हुए मिश्रण करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पाइप करें। इस प्रक्रिया को दोहराएं, प्लेट को स्तंभों के साथ नीचे ले जाएं जब तक कि एच 2-एच 11 न हो जाए। कुओं की अंतिम पंक्ति से शेष 120 μL आयतन को हटा दें।
    नोट: नमूने अब विश्लेषण के लिए तैयार हैं। यदि इस समय तक अवरुद्ध चरण पूरा नहीं होता है, तो सुनिश्चित करें कि नमूने बर्फ पर रखे गए हैं।
  14. इनक्यूबेशन चरण के अंत में, प्लेटों को 200 μL वॉश बफर के साथ तीन बार धोएं।
  15. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, 100 μL डिल्यूएंट बफर को कॉलम 1 और 12 में "रिक्त स्थान" के रूप में स्थानांतरित करें।
  16. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, कम-बाइंड प्रोटीन 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से 100 μL को धोए गए एलिसा प्लेट में स्थानांतरित करें। चलाए जा रहे सभी एलिसा प्लेटों के लिए दोहराएं।
  17. प्लेटों को चिपकने वाली प्लास्टिक फिल्म के साथ सील करें और उन्हें 37 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर 60 5 मिनट ± लिए इनक्यूबेटर में रखें।
  18. डिल्यूएंट बफर के 10,995.6 μL में एंटीबॉडी समाधान के 4.4 μL को जोड़कर 0.2 μg / mL की सांद्रता पर डिटेक्शन एंटीबॉडी समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें और ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
    नोट: 100 μL पर 96 कुओं के लिए कुल 11 एमएल की आवश्यकता होती है (पाइपिंग घाटे के लिए अतिरिक्त मात्रा के साथ)। मूल्यांकन किए जा रहे प्रत्येक अतिरिक्त एलिसा प्लेट के लिए कुल मात्रा में 11 एमएल की वृद्धि करें। तैयारी के तुरंत बाद समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए।
  19. इनक्यूबेशन चरण के अंत में, प्लेटों को 200 μL वॉश बफर के साथ पांच बार धोएं।
  20. शेष वॉश बफर को एस्पिरेट करें और मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके माइक्रोप्लेट पर प्रत्येक कुएं में 100 μL डिटेक्शन एंटीबॉडी समाधान वितरित करें।
  21. प्लेटों को चिपकने वाली प्लास्टिक फिल्म के साथ सील करें और उन्हें 37 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर 60 5 मिनट ± लिए इनक्यूबेटर में रखें।
  22. 10,995.6 μL वॉश बफर में स्ट्रेप्टाविडिन-पेरोक्सीडेज संयुग्म समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के 4.4 μL को जोड़कर पहचान एंटीबॉडी इनक्यूबेशन चरण के अंत में संयुग्म तैयार करें।
    नोट: 100 μL पर 96 कुओं के लिए कुल 11 एमएल की आवश्यकता होती है (मल्टीचैनल पाइपिंग के लिए अतिरिक्त मात्रा के साथ)। मूल्यांकन किए जा रहे प्रत्येक अतिरिक्त एलिसा प्लेट के लिए कुल मात्रा में 11 एमएल की वृद्धि करें।
  23. 200 μL वॉश बफर के साथ प्लेटों को पांच बार धोएं।
  24. शेष वॉश बफर को एस्पिरेट करें और प्रत्येक कुएं में संयुग्म घोल के 100 μL वितरित करें।
  25. प्लेटों को चिपकने वाली प्लास्टिक फिल्म के साथ सील करें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 ± 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर ± 2 डिग्री सेल्सियस में रखें।
  26. निर्माता के निर्देशों के अनुसार अंतिम धोने के चरण के दौरान सब्सट्रेट तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रत्येक प्लेट के लिए, अंधेरे में 9 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में ओ-फेनिलीनडायमाइन डाइहाइड्रोक्लोराइड (ओपीडी; सामग्री की तालिका देखें) की एक गोली घोलें, फिर 10 x स्थिर पेरोक्साइड बफर के 1 एमएल के साथ टॉप अप करें। मूल्यांकन की जा रही प्लेटों की संख्या के अनुसार गोलियों की संख्या और समाधान की कुल मात्रा (10 एमएल) समायोजित करें।
  27. 200 μL वॉश बफर के साथ प्लेटों को पांच बार धोएं।
  28. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में सब्सट्रेट के 100 μL वितरित करें।
  29. एक चिपकने वाली प्लास्टिक फिल्म के साथ प्लेटों को सील करें और उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके प्रकाश से सुरक्षित, 10-20 मिनट के लिए बेंच पर छोड़ दें।
    नोट: संतृप्ति से बचने के लिए नेत्रहीन रंग विकास की निगरानी करें।
  30. प्रत्येक कुएं में 50 μL स्टॉप घोल जोड़ें और 492 nm पर अवशोषण और 620 nm के संदर्भ अवशोषण के लिए तुरंत रीड प्लेट जोड़ें।
  31. सही अवशोषण रीडिंग का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें (492 एनएम पर पढ़ना 620 एनएम पर रीडिंग को कम करता है) और सभी नमूनों से रिक्त स्थान का औसत घटाएं। अवशोषण मूल्यों को IU / mL में परिवर्तित करने के लिए एक सिग्मोइडल 4PL प्रक्षेप विधि का उपयोग करें। अंत में, IU में परिवर्तित करने के लिए 250 μL (कुल नमूना मात्रा) से गुणा करें।
    नोट: यह विश्लेषण डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के किया जा सकता है।

Representative Results

कण सीलिंग और भरना इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से दो हैं। आदर्श भरने और कुछ सामान्य त्रुटियों को प्रदर्शित करने के लिए कणों को फ्लोरेसिन सोडियम नमक से भरा गया था। विज़ुअलाइज़ेशन में आसानी के लिए आरएबीवी एंटीजन के बदले फ्लोरेसिन सोडियम नमक का उपयोग किया गया था। भरने के दौरान, कण कोर के तल में घोल वितरित करना महत्वपूर्ण है, फिर विलायक / पानी को वाष्पित करने के लिए पर्याप्त समय दें। एक बार पूरा होने के बाद, विलेय का एक डिपो कण कोर (चित्रा 1 ए) के तल में रहता है। एक बार भरने के बाद, कणों को सही ढंग से सील करना महत्वपूर्ण है। चित्रा 1 बी सीलिंग प्रक्रिया के कई परिणामों (सफल और असफल) को दर्शाता है। सीलिंग समय के 12 सेकंड के बाद, कण केंद्र से कण के बाहर तक एक अलग मार्ग रहता है, जो एक कण का प्रदर्शन करता है जो पूरी तरह से सील नहीं होता है। इसके विपरीत, यदि 36 सेकंड के लिए सील करने के लिए छोड़ दिया जाता है, तो पीएलजीए लगभग पूरी तरह से पिघल जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उथले प्रोफाइल के साथ एक माइक्रोस्ट्रक्चर होता है। आदर्श आकृति विज्ञान की कल्पना तब की जा सकती है जब कणों को 18 और 24 सेकंड के लिए सील किया जाता है, क्योंकि उनमें कण संरचना को बनाए रखते हुए बहुलक द्वारा पूरी तरह से कार्गो होता है। चित्रा 1 सी भरने और सील करने के बाद कई संभावित परिणामों को दर्शाता है। वितरण के दौरान, यदि विलायक कण तल तक नहीं पहुंचता है, तो यह कण कोर के बीच में विलेय को सूखदेता है (गलत तरीके से भरा हुआ); हालांकि ये कण अभी भी सील कर सकते हैं, कार्गो की खराब लोडिंग लोडिंग दक्षता को सीमित कर सकती है। यदि कण बहुत अधिक कार्गो (ओवरफिल) से भरे हुए हैं, तो सीलिंग प्रक्रिया बाधित हो जाती है, क्योंकि कार्गो पीएलजीए को उद्घाटन के ऊपर बहने से रोकता है। जब सही ढंग से भरा और सील किया जाता है, तो इस ज्यामिति के कण 19 ग्राम सुई के अंदर आसानी से फिट होने के लिए काफी छोटे होते हैं। इसके अलावा, 10 कण लगातार 19 ग्राम सुई (100% ± 0%) के माध्यम से प्रवाहित होते हैं जब 2% कार्बोक्सीमिथाइल सेल्यूलोज (पूरक चित्रा 7) जैसे चिपचिपे घोल के साथ इंजेक्शन दिया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: भरने और सील करने की प्रक्रिया के साथ आम समस्याएं। (ए) छवियां एक भरने के चक्र के बाद विलायक के वाष्पीकरण को दिखाती हैं, जहां कणों को पानी में घुलने वाले 100 मिलीग्राम / एमएल फ्लोरेसिन सोडियम नमक के 6 एनएल के साथ लोड किया जाता है। (बी) 502 एच पीएलजीए कणों की प्रतिनिधि छवियां 0, 12, 18, 24, और 36 सेकंड पर सीलिंग प्रक्रिया से हटा दी गईं। कई छवियों को फोकस स्टैक करके और फोकस स्टैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उन्हें विलय करके छवियां उत्पन्न की जाती हैं। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कणों में लोड करने से पहले एक स्पिन फिल्टर के माध्यम से एंटीजन को संसाधित करना दो कारणों से महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, सेंट्रीफ्यूजेशन वैक्सीन समाधान में स्टॉक एक्सीपिएंट्स को हटाने का कार्य करता है, जो आरएबीवी एंटीजन को बनाए रखते हुए कण लोडिंग क्षमता को सीमित कर सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल एंटीजन को लगभग 50 गुना शुद्ध करता है। दूसरा, इस प्रक्रिया के दौरान एंटीजन भी केंद्रित होता है। चित्रा 2 ए केंद्रित एंटीजन नमूने में बरकरार आरएबीवी विषाणुओं का एक माइक्रोग्राफ दिखाता है। यह एंटीजन शुरुआती स्टॉक समाधान (चित्रा 2 बी) की तुलना में लगभग 4.4 गुना अधिक केंद्रित है। प्रारंभ में केन्द्रापसारक स्पिन फिल्टर में लोड किए गए एंटीजन की मात्रा को अंतिम गुना एकाग्रता को संशोधित करने के लिए बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, स्टॉक एंटीजन के 40 μL लोड करने से अनुमानित 1.75 गुना एकाग्रता होती है। पूरक चित्र 8 एकाग्रता प्रक्रिया में भंवर (चरण 5.15) के महत्व को दर्शाता है। भंवर की उपेक्षा या नमूने को अनुचित रूप से भंवर ति करना एकाग्रता प्रक्रिया को सीमित करता है।

Figure 2
चित्रा 2: एंटीजन एकाग्रता। केन्द्रापसारक निस्पंदन द्वारा एंटीजन की एकाग्रता ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ए) द्वारा दिखाई गई और एलिसा (बी) द्वारा पुष्टि की गई। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. सांख्यिकीय विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा के साथ टुकी के कई तुलना परीक्षणों का उपयोग करके किया जाता है। ** पी < 0.01, ****पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 3 ए बिना सील और सील कणों में भरे केंद्रित एंटीजन को दर्शाता है। यद्यपि एंटीजन की एक महत्वपूर्ण मात्रा कणों (0.0469 ± 0.0086 आईयू) में लोड की जाती है, इस सामग्री में कण क्षमता का <90% शामिल होता है, जिससे अतिरिक्त एंटीजन के लोडिंग के लिए पर्याप्त जगह बचती है। दिलचस्प बात यह है कि अनसील कणों में केवल 0.0396 ± 0.0077 आईयू होते हैं, जिसमें लोड की गई कुल राशि का केवल 85% ± 16% शामिल होता है। हालांकि एक सांख्यिकीय रूप से महत्वहीन नुकसान, कुछ आरएबीवी एंटीजन बार-बार पुनर्जलीकरण और भरने की प्रक्रिया में सूखने के दौरान विकृत हो सकते हैं। सील करने के बाद, एंटीजन का 69% ± 5% बायोएक्टिव रूप में समझाया जाता है। हालांकि इससे पता चलता है कि थर्मल तनाव के कारण सीलिंग प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण नुकसान होता है, अधिकांश निष्क्रिय वायरल एंटीजन बरकरार रहता है (चित्रा 3 बी)। एंटीजन के साथ एक्सिपिएंट्स को स्थिर करने का सह-एनकैप्सुलेशन निर्माण प्रक्रिया के दौरान एंटीजन स्थिरता को और बढ़ाने के लिए एक संभावित रणनीति है, और पहले अन्य निष्क्रिय वायरस एंटीजन14,15 के साथ सफल रहा है।

Figure 3
चित्र 3: कण निर्माण के बाद बायोएक्टिव आरएबीवी एंटीजन । (ए) छवियां आरएबीवी एंटीजन युक्त बिना सील और सील किए गए कणों को दिखाती हैं। (बी) कण निर्माण प्रक्रिया (एन = 4) के माध्यम से एंटीजन स्थिरता। एंटीजन को सीधे घोल में वितरित करके लोडिंग नियंत्रण उत्पन्न होता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. स्केल बार = 200 μm। सांख्यिकीय विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा के साथ टुकी के कई तुलना परीक्षणों का उपयोग करके किया जाता है। * पी < 0.05. कई छवियों को फोकस स्टैक करके और फोकस स्टैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उन्हें विलय करके छवियां उत्पन्न की जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: कण, भौतिक और सरणी आयाम। यह आंकड़ा सीएडी सॉफ्टवेयर में प्रदर्शित चार-नुकीले स्टार फिड्यूशियल (ए), बेलनाकार माइक्रोपार्टिकल (बी), पांच-पॉइंटेड स्टार फिड्यूशियल (सी) और फिड्यूशियल (डी) के साथ कणों की एक सरणी के ज्यामितीय गुणों को दर्शाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: यह आंकड़ा पीडीएमएस मोल्डों को ठीक करने के लिए ओवन में रखी गई संरचना का एक क्रॉस-सेक्शन दिखाता है। तीर इंगित करते हैं कि बाइंडर क्लैंप कहां लगाए जाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: केंद्रित एंटीजन को कुशलतापूर्वक पुनर्प्राप्त करने के लिए उचित तकनीक। पहले स्पिन के अंत में, लाल (ए) में सर्कल किए गए केंद्रित नमूने को फिल्टर में बनाए रखा जाता है, जबकि छानना संग्रह ट्यूब (बड़ी बाहरी ट्यूब) के तल में एकत्र किया जाता है। पेलेट एंटीजन को फिर से निलंबित करने के लिए, केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट को भंवर की तैयारी में संग्रह ट्यूब (बी) का उपयोग करके कवर किया जाता है। भंवर के दौरान, ट्यूब की नोक को भंवर पैड के संपर्क में रखा जाता है और भंवर पैड (सी) के साथ 45 डिग्री कोण बनाए रखते हुए टोपी के छोर को चारों ओर घुमाया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 4: प्री-रन प्रोग्रामिंग पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसर। (ए) लक्ष्य संदर्भ बिंदुओं को खोजने के लिए "मुख्य टैब" से विविध >डिव फ़ंक्शन > रोबोट सेटअप नेविगेट करके "लक्ष्य संदर्भ बिंदु खोजें" >सेट करें। भरोसेमंद निशान सेट करने के लिए नीले रंग में हाइलाइट किए गए बटन का उपयोग करें। सबसे पहले, टेम्प्लेट सीखें का चयन करें और रुचि के भरोसेमंद चिह्न के चारों ओर एक बॉक्स खींचें, खोज टेम्पलेट पर क्लिक करके टेम्पलेट सटीकता सत्यापित करें, और टेम्पलेट को सहेजें। चार और पांच-बिंदु वाले सितारों के लिए ऐसा करें, और दो अलग-अलग टेम्पलेट छवियों का उपयोग करें के तहत निर्देशों के अनुसार फ़ाइल नामों को सहेजें। इसके बाद, सुनिश्चित करें कि ब्लैक बॉक्स में सभी पैरामीटर मेल खाते हैं। लोड टेम्प्लेट (हरा बॉक्स) का उपयोग करके चार-बिंदु स्टार फ़िड्यूशियल लोड करें। कार्य सूची (नारंगी बॉक्स) का चयन करके "लक्ष्य संदर्भ बिंदु खोजें" प्रोग्राम सहेजें। (बी) रोबोट सेटअप > टास्क टैब पर नेविगेट करके रन सेट अप करें, फिर टास्क इन रन सिलेक्शन (ग्रीन बॉक्स) का उपयोग करके टास्क लिस्ट (ब्लैक बॉक्स) से टास्क जोड़कर ब्लू बॉक्स में दिखाए गए कार्यों के अनुक्रम को लोड करें। अंत में, कार्य (नारंगी बॉक्स) सहेजें। (सी) रोबोट सेटअप > टारगेट सब्सट्रेट पर नेविगेट करके "टारगेट सब्सट्रेट" सेट करें, फिर एक लक्ष्य (ब्लू बॉक्स) जोड़ें। (डी) यहां दिखाए गए पैरामीटर दर्ज करें और सहेजें (नीला बॉक्स) चुनें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 5: एंटीजन लोड करना और व्यय संरेखण को कैलिब्रेट करना। (ए) नोजल सेटअप > डू टास्क टैब पर नेविगेट करें और टेकप्रोब 10 यूएल (ब्लैक बॉक्स) का चयन करके और डीओ (ब्लैक बॉक्स) पर क्लिक करके डिस्पेंसिंग टिप में एंटीजन के 10 μL को एस्पिरेट करें। (बी) यह एक अलग विंडो खोलता है। उस कुएं का चयन करें जिसमें केंद्रित एंटीजन लोड किया गया था और ओके (ब्लू बॉक्स) का चयन करें। (सी) एंटीजन एस्पिरेटेड होने के बाद, नीले बॉक्स का चयन करके टिप को धो लें, और इस धोने को दो बार दोहराएं। कैमरा (ब्लैक बॉक्स) का चयन करें और ड्रॉप वॉल्यूम (ग्रीन बॉक्स) का चयन करके ड्रॉप वॉल्यूम निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि वॉल्यूम मानक विचलन (%) <2 (नारंगी बॉक्स) के साथ एक स्थिर गिरावट बन रही है। (डी) इन चरणों का पालन करने से स्नैप ड्रॉप कैम खुल जाएगा; ड्रॉप-डाउन मेनू में छवि (नीला बॉक्स) का चयन करें और नोजल हेड कैमरा विज़ार्ड का चयन करें। यह एक नई विंडो खोलता है। चरणों का अगला क्रम जल्दी से निष्पादित करें। (ई) सुनिश्चित करें कि पूरक चित्र 4 में किया गया लक्ष्य लोड किया गया है, फिर लक्ष्य की ओर बढ़ें (ब्लू बॉक्स) का चयन करें। बूंदों को 15 पर समायोजित करें और स्पॉट (ब्लैक बॉक्स) का चयन करें। एक बार देखे जाने के बाद, तुरंत मूव (ग्रीन बॉक्स) चुनें। सुनिश्चित करें कि ऑटो फाइंड चुना गया है और कण आकार = 12 हटाएँ, फिर स्टार्ट (नारंगी बक्से) पर क्लिक करें। यदि ऑटो-डिटेक्शन विफल हो जाता है, तो स्लाइड (बैंगनी बॉक्स) पर एक अलग क्षेत्र में जाने के बाद इस प्रक्रिया को दोहराएं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 6: स्पॉटिंग सरणी को प्रोग्राम करना और रन शुरू करना। (ए) लक्ष्य सेटअप > लक्ष्य पर नेविगेट करें, फिर नीले बॉक्स में दिखाए गए पैरामीटर भरें। (बी) इसके बाद, "फ़ील्ड सेटअप टैब" पर नेविगेट करें और संख्या में 20 दर्ज करें। ड्रॉप्स फ़ील्ड (ब्लू बॉक्स) का चयन करें, एक कुएं (ब्लैक बॉक्स) का चयन करें, फिर (हरे बॉक्स) में वितरित करने के लिए लक्ष्य / कणों का चयन करें। एक अलग कुएं का चयन करके और लक्ष्यों / कणों का पुन: चयन करके, एक ही रन के दौरान अतिरिक्त भरने के चक्र किए जाते हैं। (सी) मुख्य स्क्रीन पर, सुनिश्चित करें कि पूरक चित्र 5 में बनाए गए रन और लक्ष्य का चयन किया गया है। (डी) "रन टैब" पर नेविगेट करें और स्टार्ट रन (ब्लू बॉक्स) का चयन करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 7: माइक्रोपार्टिकल इंजेक्शनेबिलिटी। (A-C) फ्लोरेसिन सोडियम नमक से भरे माइक्रोपार्टिकल्स की फोकस-स्टैक्ड स्टीरियोस्कोप छवियां और 19 ग्राम सुई में सील की गईं। (डी) 2% कार्बोक्सीमिथाइल सेल्यूलोज समाधान (एन = 8) का उपयोग करके 19 ग्राम सुई के माध्यम से कुल 10 कणों को इंजेक्ट किया गया था। स्केल बार = 1 मिमी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 8: एंटीजन एकाग्रता के साथ संभावित मुद्दे। लाल रेखा एकाग्रता में अपेक्षित गुना वृद्धि को इंगित करती है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. सांख्यिकीय विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा के साथ टुकी के कई तुलना परीक्षणों का उपयोग करके किया गया था। पी < 0.001, ****पी < 0.0001. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: आरएबीवी एलिसा के लिए बफर और समाधान तैयार करना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: कण सरणी युक्त एसटीएल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: कणों को सील करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कस्टम स्लाइड धारक के लिए ज्यामिति युक्त एसटीएल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए कण ज्यामिति को बदलना संभव है; हालांकि, बेलनाकार संरचनाओं के लिए, लेखक प्रोटोकॉल में वर्णित ऊंचाई: व्यास: दीवार मोटाई के 5: 4: 1 अनुपात को बनाए रखने की सलाह देते हैं। यह पहलू अनुपात यह सुनिश्चित करता है कि कणों को सील करने के लिए पर्याप्त पीएलजीए सामग्री मौजूद है और हैंडलिंग के लिए यांत्रिक रूप से पर्याप्त मजबूत है। सीएडी प्रक्रिया के दौरान कण आयाम ों और आकृतियों को आसानी से बदला जा सकता है, जिससे असंख्य ज्यामिति उत्पन्न हो सकती है। 3 डी प्रिंटिंग के साथ सीएडी के लचीलेपन का संयोजन माइक्रोपार्टिकल डिजाइनों के तेजी से पुनरावृत्ति को सक्षम बनाता है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल एक मल्टी-फोटॉन 3 डी प्रिंटर का उपयोग करता है, लेकिन एक उपयुक्त सामग्री में माइक्रोस्ट्रक्चर आयामों को प्रिंट करने में सक्षम विनिर्देशों के साथ किसी भी 3 डी प्रिंटर का उपयोग प्रारंभिक मास्टर मोल्ड उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, फोटोलिथोग्राफी का उपयोग पहले इस प्रोटोकॉल में उत्पादित लोगों की तुलना में सरणियों में समान संरचनाओं को बनाने के लिए किया गया है; हालांकि, श्रम, कस्टम-निर्मित फोटोमास्क ऑर्डर करने में देरी, और उपकरण पहुंच पुनरावृत्ति डिजाइन प्रक्रियाको धीमा कर देगी। अंत में, मास्टर मोल्ड पीढ़ी को शुल्क-फॉर-सर्विस कंपनियों को आउटसोर्स किया जा सकता है यदि इन-हाउस मास्टर मोल्ड निर्माण संभव नहीं है। मास्टर मोल्डों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले 3 डी प्रिंटर या विधि के बावजूद, सब्सट्रेट में प्रिंट का आसंजन डाउनस्ट्रीम चरणों के लिए महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, यदि पीडीएमएस मोल्ड पीढ़ी के दौरान आसंजन अपर्याप्त है, तो मुद्रित कण पीडीएमएस मोल्ड में दर्ज रहेंगे, जिससे मुद्रित कणों को मैन्युअल रूप से हटाने और मास्टर मोल्ड के विनाश की आवश्यकता होगी।

कण भरना विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण पहलू है। माइक्रोपार्टिकल्स में सीमित भरने की क्षमता होती है, इसलिए निस्पंदन का उपयोग न केवल आरएबीवी एंटीजन को केंद्रित करने के लिए किया जाता है, बल्कि स्टॉक एक्सीपिएंट्स को हटाने के लिए भी किया जाता है जो अन्यथा माइक्रोपार्टिकल कोर वॉल्यूम के एक बड़े हिस्से पर कब्जा कर लेंगे। हालांकि, आरएबीवी एंटीजन (लगभग 60 एनएम बाय 180 एनएम) 17 के बड़े आकार को देखते हुए, सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों के दौरान एंटीजन को आंशिक रूप से बाहर निकालना संभव है। इस कारण से, आरएबीवी एंटीजन की उच्च वसूली प्राप्त करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पाइपिंग या भंवर द्वारा एंटीजन को फिर से निलंबित करना महत्वपूर्ण है। एक अत्यधिक केंद्रित समाधान वितरण के लिए आदर्श है, क्योंकि यह वितरण चक्रों को कम करता है और इस प्रकार भरने के दौरान एंटीजन गिरावट को सीमित करता है। हालांकि, चिपचिपाहट एक स्थिर बूंद बनाने वाले पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसिंग रोबोट की एक प्रमुख सीमा है, इसलिए बहुत अधिक एकाग्रता समाधान देना संभव या उचित नहीं हो सकता है। भरने के समाधान को पतला करना एक स्थिर ड्रॉप गठन प्राप्त करने का सबसे आसान तरीका है, लेकिन वांछित लोडिंग को प्राप्त करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त भरने चक्रों पर एंटीजन स्थिरता और कणों को भरने के लिए आवश्यक समय की लंबी मात्रा पर विचार किया जाना चाहिए।

सीमाओं
इस विधि को प्रारंभिक मोल्डों का उत्पादन करने के लिए अत्यधिक विशिष्ट उपकरणों और माइक्रोपार्टिकल उत्पादन के लिए एक विशेष भरने वाले उपकरण की आवश्यकता होती है। यद्यपि प्रारंभिक मास्टर मोल्डों को उत्पन्न करने में सक्षम प्रिंटिंग रिज़ॉल्यूशन के साथ 3 डी प्रिंटर की आवश्यकता को शुल्क-फॉर-सर्विस दृष्टिकोण द्वारा नष्ट किया जा सकता है, लेकिन पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसिंग रोबोट तक पहुंच सीमित है। पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसिंग रोबोट की खरीद के लिए एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक अग्रिम निवेश की आवश्यकता होती है, जो अक्सर ब्रांड, थ्रूपुट और क्षमताओं के आधार पर $ 80,000 से $ 200,000 की सीमा में होती है। यद्यपि कई अन्य भरने के तरीके संभावित विकल्प हैं, इन विधियों को आरएबीवी एंटीजन12 का उपयोग करके मान्य नहीं किया गया है।

भविष्य के अनुप्रयोग
सीलिंग प्रक्रिया के माध्यम से एनकैप्सुलेटेड आरएबीवी एंटीजन का एक बड़ा हिस्सा स्थिर रहा। सिद्धांत रूप में, इस एंटीजन को विभिन्न प्रकार के पीएलजीए से बने कणों में शामिल करके जो पोस्ट-एक्सपोजर प्रोफिलैक्सिस उपचार की प्रशासन समयरेखा की नकल करते हैं, सभी खुराक को एक ही इंजेक्शन में प्रशासित किया जा सकता है। अतिरिक्त खुराक देने के लिए बार-बार अस्पताल के दौरे की आवश्यकता को समाप्त करने से रोगी अनुपालन में वृद्धि होगी, जिसके परिणामस्वरूप बेहतर उपचार परिणाम होंगे। इसके अलावा, अत्यधिक जटिल निष्क्रिय रेबीज वायरस की एलिसा-प्रतिक्रिया को बनाए रखने की क्षमता का प्रदर्शन करने के बाद, यह संभावना है कि सबयूनिट टीकों सहित अन्य एंटीजन इस एनकैप्सुलेशन विधि के साथ संगत होंगे। स्पंदित माइक्रोपार्टिकल्स के साथ अन्य रोगनिरोधी एंटीजन का उपयोग करने से कम टीकाकरण वाली आबादी की टीकाकरण दर में वृद्धि करके एलएमआईसी में लाखों लोगों की जान बचाई जा सकती है। हालांकि, इसे पूरा करने के लिए, टीकों को न केवल एनकैप्सुलेशन के माध्यम से स्थिर रहना चाहिए, बल्कि रिलीज भी करना चाहिए, जो चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि पेलोड को शरीर की गर्मी और पीएलजीएक्षरण उत्पादों के कारण ऊंचे तापमान और संभावित अम्लीय माइक्रोएन्वायरमेंट के अधीन किया जाएगा। भविष्य के काम रिलीज के माध्यम से एंटीजन की स्थिर रणनीतियों को आगे बढ़ाएंगे, जो एकल-इंजेक्शन टीकाकरण मंच की क्षमता को खोलेगा जो कई संक्रामक रोगों को रोकने के लिए व्यापक रूप से लागू है।

Disclosures

मैकहग के पास शामिल काम के आधार पर एक पेटेंट दायर किया गया है और वर्तमान में मानवता के लिए कणों के लिए एक सलाहकार है। श्री ग्राफ के पास शामिल काम के आधार पर एक पेटेंट दायर किया गया है। डॉ कडासिया, श्री यांग और सुश्री ब्रैडी पार्टिकल्स फॉर ह्यूमैनिटी का हिस्सा हैं, जो एक सार्वजनिक लाभ निगम है जिसने इस काम के दौरान एमआईटी से इसी तरह की माइक्रोपार्टिकल वैक्सीन डिलीवरी तकनीक को लाइसेंस दिया था।

Acknowledgments

हम आरएबीवी एंटीजन के साथ मानवता के लिए कण प्रदान करने के लिए चिरोन बेहरिंग और भारत बायोटेक इंटरनेशनल को धन्यवाद देते हैं। हम चार्ल्स रुपरेच्ट, वीएमडी, एमएस, पीएचडी, उनके अमूल्य मार्गदर्शन और तकनीकी योगदान के लिए भी स्वीकार करना चाहते हैं। रेबेका रिचर्ड्स-कॉर्टम की उदारता को धन्यवाद देना चाहते हैं कि उन्होंने अपने SciFLEXARRAYER S3 पिकोलिटर डिस्पेंसिंग उपकरण के उपयोग की अनुमति दी और डिवाइस का उपयोग करने पर डॉ चेल्सी स्मिथ के निर्देश दिए। हम रेबीज एंटीजन की माइक्रोस्कोपी छवियों को उत्पन्न करने के लिए मैसाचुसेट्स चैन मेडिकल स्कूल विश्वविद्यालय को भी स्वीकार करते हैं। अंत में, हम प्रस्तुत करने से पहले दस्तावेज़ की समीक्षा करने के लिए डॉन चिकरिंग और एरिन यूलियानो को धन्यवाद देते हैं। इस काम को बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन से अनुदान (आईएनवी -004360) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm PES filter Cole-Parmer+B4B2:B63 04396-26
0.25 mm Shims McMaster Carr 98090A935
0.75 inch Binder Clips Staples 480114
10 mL Syringe Becton, Dickinson and Company 309604
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11E
101.6 mm C-Clamp Amazon PT-SD-CP01A Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens.
19 G needle EXCELINT 26438
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate  Millipore Sigma M6514-25ML
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Eppendorf 22431081
50 mL Centrifuge Tubes Corning  352098
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11F
Acetone Fisher AC268310010
Aluminum Block McMaster Carr 9057K175
Aluminum Foil VWR 89079-069
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa Millipore Sigma C82301
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 Fisherbrand 13-678-11D
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated Fisherbrand 14-388-100
Carboxymethyl Cellulose Tokyo Chemical Industries C0045
ClipTip 300, Filter, Racked Fisherbrand 13-678-11
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3206
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3207
Describe Nanoscribe Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2.
Software provided with the printer.
Desiccator Fisher Scientific 10529901 Or equivalent
Double-Sided Tape Staples 649280
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium Gibco 14200075
Ethanol VWR 89370-084
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL Fisherbrand 13-678-11E
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL Fisherbrand 13-678-11F
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL Fisherbrand 03-448-17
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL Fisherbrand FB14955202
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL Fisherbrand 13-374-10
Fisherbrand Elite Pipette Kit Fisherbrand 05-408-137
Fisherbrand Pipet Controller  Fisherbrand FB14955202
Glass Petri Dish, 90 mm VWR 470313-346
Glass Slides Globe Scientific 1380-10
Helicon Focus 8 HeliconSoft Software used to focus stack images
IP-Q Resin Nanoscribe Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple Amazon 5053485896236 Or equivalent
Microscope Slide Box Millipore Sigma Z374385-1EA Or equivalent
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective Nanoscribe
NanoWrite Nanoscribe Software used to interface with nanoscrive 3D printer.
Software provided with printer.
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate Invitrogen 44-2404-21
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) Fisherbrand 02-707-432
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. Fisherbrand 13-374-10
PDC 60 with Type 3 Coating Scienion P-2020
PDMS Particle Molds Rice University n/a N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array.
Petri Dish Fisher Scientific 08-757-100D
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) Fisherbrand 02-707-430
Plastic Cups Fisher Scientific S04170
PLGA Film, 502H Sigma 502H: 719897-1G
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate Millipore Sigma 484431
Rabies Antigen Chiron Behring and Bharat Biotech International Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company.
Razor Blades VWR 55411-050
Scalpel VWR 21899-530 and 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 Scienion Or equivalent
Sealing Tape for 96-Well Plates Thermo Scientific 15036
Silicon Wafer University Wafer 1025
Spring Clamps IRWIN VGP58100
Stainless Steel Block McMaster Carr 9083K12
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive Fisherbrand 02-707-404
Sylgard 184 DOW 2646340
Teflon Sheet McMaster Carr 9266K12 Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces.
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick McMaster Carr 9266K81
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane Sigma 448931-10G
Tweezers  Pixnor ESD-16
UltraPure Distilled Water Fisher Scientific 10977015
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker UVP 95-0174-01 Or equivalent
Vacuum Desiccator Bel-Art F420100000 Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination.
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C VWR 97027-664 Or equivalent
Vacuum, CRVpro4  Welch 3041-01 Or equivalent
Wooden Tongue Depressors Electron Microscopy Sciences 72320

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References

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खाली मूल्य अंक 195 नियंत्रित रिलीज पल्सेटाइल डिलीवरी पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड) रेबीज एलिसा पोस्ट-एक्सपोजर प्रोफिलैक्सिस टीकाकरण
"रेबीज एंटीजन को एनकैप्सुलेट करने वाले पल्सेटाइल पॉलीमेरिक माइक्रोपार्टिकल्स का निर्माण"।
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Graf, T. P., Kadasia, K., Melhorn,… More

Graf, T. P., Kadasia, K., Melhorn, S., Kessler, E., Yang, H., Baryakova, T., Brady, S., McHugh, K. J. Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen. J. Vis. Exp. (195), e65147, doi:10.3791/65147 (2023).

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