La imagen en vivo ex vivo es una técnica poderosa para estudiar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares en los tejidos vivos. Aquí, presentamos un protocolo que implementa la microscopía de dos fotones para rastrear en vivo las células epiteliales dentales en incisivos de ratones adultos enteros cultivados.
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Artículo de método
Uso de imágenes en vivo ex vivo para investigar las divisiones celulares y los movimientos durante la renovación dental del ratón
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En este artículo
Resumen
Resumen
El incisivo de ratón en continuo crecimiento está emergiendo como un sistema modelo altamente manejable para investigar la regulación de las células madre epiteliales y mesenquimales adultas y la regeneración dental. Estas poblaciones progenitoras se dividen, se mueven y se diferencian activamente para mantener la homeostasis tisular y regenerar las células perdidas de manera receptiva. Sin embargo, los análisis tradicionales que utilizan secciones fijas de tejido no pudieron capturar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares, lo que limitó nuestra capacidad para estudiar sus regulaciones. En este trabajo se describe un protocolo para mantener incisivos enteros de ratón en un sistema de cultivo de explantes y células epiteliales dentales de seguimiento vivo mediante microscopía de lapso de tiempo multifotónica. Esta técnica se suma a nuestra caja de herramientas existente para la investigación dental y permite a los investigadores adquirir información espacio-temporal sobre el comportamiento y las organizaciones celulares en un tejido vivo. Anticipamos que esta metodología ayudará a los investigadores a explorar más a fondo los mecanismos que controlan los procesos celulares dinámicos que tienen lugar tanto durante la renovación como durante la regeneración dental.
Introducción
En las últimas dos décadas, el incisivo de ratón se ha convertido en una plataforma inestimable para investigar los principios de la regulación de las células madre adultas y la regeneración dental 1,2. El incisivo del ratón crece continuamente y se renueva a lo largo de la vida del animal. Lo hace mediante el mantenimiento de células madre epiteliales y mesenquimales, que pueden autorrenovarse y diferenciarse en diferentes tipos de células del diente 1,2. Mientras que las células madre epiteliales dentales dan lugar a los ameloblastos, que secretan la....
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Protocolo
Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones de animales libres de patógenos en la Universidad de California en Los Ángeles (UCLA) o la Universidad Hebrea de Jerusalén (HUJI). Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las normas y protocolos aprobados por el respectivo Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) o (MD-23-17184-3; HUJI). En la Figura 2A se muestra un flujo de trabajo general de los pasos experimentales. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los instrumentos, reactivos y materiales utilizados en este protoco....
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Resultados
La región apical del incisivo del ratón adulto está encerrada dentro de la mandíbula (Figura 1) y, por lo tanto, no es directamente accesible para visualizar y rastrear en vivo las células progenitoras que residen dentro de la región de crecimiento. Por lo tanto, hemos desarrollado un método para extraer todo el incisivo de la mandíbula y mantenerlo en un sistema de cultivo de explantes para microscopía timelapse de dos fotones (Figura 2). Aquí describimos resul.......
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Discusión
La imagen de tejido vivo es una técnica importante que nos permite estudiar los procesos dinámicos y el comportamiento de las células cuando se mantienen en su entorno de nicho41. Idealmente, las imágenes en vivo se realizan in vivo con una alta resolución espacio-temporal. Sin embargo, la obtención de imágenes in vivo de órganos de mamíferos puede ser un reto debido a la inaccesibilidad de los tejidos, la opacidad óptica y la dificultad para inmovilizar al animal o al órgano dur.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Laboratorio de Microscopía Óptica/Espectroscopía Avanzada de la UCLA y al Centro de Excelencia de Leica Microsystems en el Instituto de Nanosistemas de California (RRID:SCR_022789) por proporcionar microscopía de dos fotones. AS fue apoyado por ISF 604-21 de la Fundación de Ciencias de Israel. JH contó con el apoyo de R03DE030205 y R01DE030471 de los NIH/NIDCR. AS y JH también recibieron el apoyo de 2021007 de subvenciones de la Fundación Binacional de Ciencias (BSF) de los Estados Unidos e Israel.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 24 pocillos, placa de cultivo de tejidos de fondo plano | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR objetivo de inmersión en agua | Leica | 11507704 | |
| Ácido ascórbico (vitamina C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucosa bioxtra | Sistema Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T | Bioptechs | 0420-4 | Incluye control de temperatura, placas de cultivo y configuración de perfusión |
| Microscopio de disección- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Medios basales sin rojo fenol |
| Cuchilla quirúrgica Feather (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Pinzas finas | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Sustituto de glutamina |
| Leica SP8-DIVE equipado con un objetivo de inmersión en agua 25X HC IRAPO motCORR | Leica | n/a | |
| agarosa de bajo punto de fusión | NuSieve | 50080 | |
| aminoácidos no esenciales (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicilina– estreptomicina | Thermo Scientific | 15140122 | 10.000 U/mL |
| Placa de Petri | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Suero de rata | Valley Biomedical | AS3061SC | Procesado para imágenes en vivo |
| Hoja de afeitar #9 | VWR | 55411-050 | |
| Mango de bisturí | F.S.T | 10003-12 | |
| Tijeras | F.S.T | 37133 | |
| pinza dentada | F.S.T | 11000-13 | |
| tijeras de muelle | F.S.T | 91500-09 |
Referencias
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- Jing, J., et al. Ro....
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Reimpresiones y permisos
