Summary
Değerlendirilmesi için yeni kök hücre tedavileri ile enjekte edilen hücrelerin in vivo takip non-invaziv önemlidir. Bu video demir oksit bazlı kontrast ajanlar ile insan mezenkimal ve embriyonik kök hücreleri, in vivo sonraki MR, in vivo olarak nasıl etiketlemek için size gösterecektir.
Abstract
Son yıllarda, kök hücre araştırmaları, gelişim biyolojisi, çeşitli hastalıklar ve rejeneratif tıp üzerindeki potansiyel etkilerini daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır. In vivo olarak nakledilen kök hücreler tekrar tekrar izlemek için bir non-invaziv yöntem büyük ölçüde mekanizmaları anlamak için yeteneğimizi artıracak, kontrol kök hücre ölümü ve kök hücre engraftman artırmak trofik faktörleri ve sinyal yolları belirlemek. MR görüntüleme yakın mikroskobik anatomik çözünürlük ile kök hücreleri in vivo tasviri için etkili bir araç olduğu kanıtlanmıştır. MR ile kök hücreleri algılamak için, hücrelerin hücre spesifik MR kontrast ajanlar ile etiketlenmiş olması gerekir. Bu amaçla, süperparamanyetik demir oksit parçacıkları (SPIO) gibi demir oksit nano, çünkü hücre algılama ve mükemmel biyouyumluluk için yüksek hassasiyet, uygulanır. SPIO parçacıklar demir oksit çekirdek ve yerel alan homojen olmayan düzensizlikleri, T2 ağırlıklı MR görüntülerinde bir azalma sinyali neden oluşturarak, dekstran, carboxydextran veya nişasta mont, ve fonksiyon oluşmaktadır. Bu sunum, MR görüntüleme ile işaretli hücrelerin in vivo izleme sonraki non-invaziv klinik olarak uygulanabilen MR kontrast ajanlar ile kök hücre etiketleme teknikleri gösterecektir.
Protocol
Ferucarbotran ile hMSC Etiketleme
Bu Ferucarbotran, MR görüntüleme için demir oksit bazlı kontrast madde ile insan mezenkimal kök hücreleri etiketlenmesi için tekniği:
- Başlamak için, plaka hücreleri 18-24 saat önce,% 80 bir izdiham T75 matara etiketleme prosedürü. Farklı bir kültürü çanak kullanıyorsanız, bu cm 2 başına yaklaşık 10000 hücrelere eşit.
- Ertesi gün, 8 ml serum serbest medya Resovist 30 ul ekleyerek etiketleme medya hazırlanması ile başlar. Bu bir konsantrasyon 100 mg Fe / ml medya karşılık gelen,% 80 confluency az bir T75 şişesi etiketi olacak.
- Kültür ortamı çıkarın ve hücreler PBS veya serum ücretsiz medya ile bir kez yıkayın. Bu, artık serum proteinleri ve diğer bileşenleri, kontrast madde ve etkisi etiketleme verimliliği bağlamak medya kurtulmak için yapılır.
- Erlene etiketleme Medya ekle ve inkübatör şişeyi geri koymak.
- 2 saat sonra,% 20 FCS nihai bir konsantrasyon elde edilir böylece FCS 2 ml ekleyin. Bu hücrelerin ayırt etmek için uyaran almazlar sağlamak için yapılabilir, ancak yerine aşina oldukları bir ortamda büyümek.
- Hücreler 18 saat boyunca inkübe edin. Bu en iyi gece yapılır.
- Ertesi gün, hücreler PBS ile yıkayın, sonra onları her zamanki gibi trypsinize.
- Tripsinize sonra, hücre süspansiyonu medyada kalan, ücretsiz kontrast madde kurtulmak için 3 kez yıkanması gerekmektedir. Bu PBS 5 dakika boyunca 400 RCF hücreler santrifüj ile yapılır.
- Son hücre pelet yeniden bekletildi ve daha fazla deneyler için hazır olabilir.
- Önceki yıkama adımları sırasında kaybolmuş olabilir gibi, şimdi hücreleri saymak. Ayrıca, bu noktada Tripan mavi dışlama tahlil kullanarak canlılığı testi gerçekleştirmek ve etiketleme etkinliğini ölçmek için spektrometrik analizi için bazı örnekler.
Ferumoxides insan embriyonik kök hücreleri Etiketleme
- Başlamak için, plaka hESC 10cm yemekler, her zamanki gibi. Bu yemekler jelatin ile kaplı ön ve onlara ışınlanmış besleyici hücreler var. Siz de besleyici ücretsiz kültürler için bu protokolü kullanabilirsiniz.
- Orta büyüklükte koloniler oluştururlar, böylece hESC takın ve yaklaşık 3-4 gün için büyümek. Bu süre zarfında büyük koloniler, daha sonra break up için daha zor gibi, koloniler büyük büyümek olmadığını sağlamak.
- Farklılaşmış hücrelerin kolonilerin temizlik bağlı olarak, bu kültürlerin kirletebilir, diseksiyon farklılaşmış kültürler kurtulmak için olabilir.
- 100μg/ml ve tam hESC medya bir konsantrasyon Ferumoxides oluşan etiketleme ortam hazırlayın. Bunun için, biz 89μl Ferumoxides ve 10 ml tam büyüme ortamı karıştırın.
- Eksiksiz bir medya çanak ile bir kez yıkayın.
- Medya etiketleme çanak ortalama 10 ml ekleyin ve 4 saat boyunca hücreler kuluçkaya yatmaktadır.
- Şimdi, etiketleme tamamlandı. Bir sonraki adımda, bu hücrelerin yıkayın ve daha sonra kullanmak için tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için gerekli. Bunun için, ilk önce tabak PBS ile yıkayın.
- Sonra,% 0.25 tripsin, 5ml ile PBS değiştirin ve 5 dakika inkübatör inkübe veya hücreleri ayırmak kadar. Çanak sık sık dokunun yardımcı olur.
- Hücreler artık müstakil var. Çanak içerdiği Büyük koloniler halinde kalan bazı kümeleri olabileceğini aklınızdan çıkarmayın.
- Bu yığınlara kurtulmak için, bir serolojik bir pipet kullanarak kez tüm süspansiyon karıştırın, daha sonra başka bir 2 dakika boyunca bekletin.
- Biz, ince ucu ile, hücre zarlarının zarar verebilir hücrelerin tekrarlanan emme Eppendorf pipet kullanmak yok.
- Artık kümeleri varsa, bir hücre süspansiyonu 40μm hücre süzgecinden çalıştırabilirsiniz.
- Eğer her şeyi doğru bir şekilde çalıştı, tek bir hücre süspansiyonu, ESC-matrix ve ölü hücreleri jelatin kaplama kaynaklanan, enkaz çok karışık olduğunu var. Bu kurtulmak için, iki kez, 5 dakika boyunca 400 RCF onları aşağı iplik hücrelerin yıkayın ve tam medya onları tekrar süspansiyon haline getirin.
- Şimdi, ESC ışınlanmış besleyici hücreler izole edilmesi gerekiyor. Bu verimli bir jelatin kaplı çanak hücre süspansiyonu kaplama yapılabilir.
- Çanak manipüle değilse, tüm hücreleri tortu aşağı, ama besleyiciler ESC daha hızlı eklenecektir.
- Yani, besleyiciler, özellikle çanak bağlı olmalıdır süpernatantı 45 dakika sonra alınırsa, bu, özellikle ESC içermelidir.
- Bu şekilde, başka deneyler için kullanılan manyetik etiketli insan embriyonik kök hücreleri tek bir hücre süspansiyonu elde edilir.
- Önceki protokolünde olduğu gibi, bu noktada, hücrelerin sayısı ve canlılığı değerlendirmesi ve etiketleme verimliliğini ölçmek için numune almak gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kök hücre non-invaziv bir tasviri hemen hemen her türlü kök hücre tabanlı tedavi izlenmesi için çok önemlidir. Etiketli kök hücrelerin in vivo kinetiği daha iyi bir anlayış, MR görüntüleri görüntülendi, rasyonel bir şekilde ve kök hücre bazlı tedavilerin daha etkin kullanımı neden olabilir. Klinik olarak uygulanabilen kontrast ajanlar ve görüntüleme tekniklerinin kullanılması sebebiyle, sunulan protokolleri hastalarda uygulamalara kolayca çevrilebilir olmalıdır. Yöntemlerden potansiyel klinik uygulamaları karşılaştırmalı araştırmalar, çeşitli kök hücre alt tipi ya da genetiği değiştirilmiş kök hücreleri engraftman sürecinin yanı sıra, kök hücre engraftman sonucu tedavisinin etkileri değerlendirme içerir. Sonuçlar klinik pratikte bu kök hücre tabanlı tedavilerin değerlendirilmesi, daha sonra ilgili klinik çalışmaların tasarımı, hemen kök temelli tedavilerin preklinik değerlendirmelerde yardımcı olabilir ve olmalıdır. Unutmayın ki, bizim görüntüleme tekniği ayrıca hematopoietik kök hücreleri veya nöronal kök hücreleri gibi diğer kök hücre popülasyonlarının için de geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu proje için California Rejeneratif Tıp Enstitüsü bir Leon J. Thal TOHUM hibe ile desteklendi. Tobias Henning, Alman Araştırma Birliği (DFG, HE 4578/1-2) nakit Araştırma tarafından finanse edildi. Biz insan embriyonik kök hücre kültürü onun tavsiye Juanito Meneses minnetle kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
