Summary
नई स्टेम सेल के उपचारों के मूल्यांकन के लिए गैर invasively के लिए महत्वपूर्ण है vivo में इंजेक्शन कोशिकाओं को ट्रैक. यह वीडियो तुम्हें दिखाने कैसे vivo में बाद एमआर इमेजिंग के लिए vivo में मानव mesenchymal और लोहे के आक्साइड आधारित विपरीत एजेंटों के साथ भ्रूण स्टेम कोशिकाओं लेबल होगा.
Abstract
हाल के वर्षों में, स्टेम सेल अनुसंधान के विकास जीव विज्ञान, विभिन्न रोगों और पुनर्योजी चिकित्सा पर अपने संभावित प्रभाव का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व किया गया है. एक गैर इनवेसिव विधि प्रतिरोपित स्टेम कोशिकाओं vivo में बार - बार की निगरानी काफी हमारे तंत्र को समझने की क्षमता में वृद्धि होगी कि नियंत्रण स्टेम कोशिका मृत्यु और पौष्टिकता संबंधी कारकों और संकेत मार्ग है कि स्टेम सेल engraftment में सुधार की पहचान. एमआर इमेजिंग के लिए एक प्रभावी उपकरण के पास सूक्ष्म संरचनात्मक संकल्प के साथ स्टेम कोशिकाओं के vivo चित्रण में होना सिद्ध किया गया है. आदेश में एमआर के साथ स्टेम कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, कोशिकाओं के लिए सेल विशिष्ट एमआर विपरीत एजेंटों के साथ लेबल किया जा है. इस प्रयोजन के लिए, लोहे के आक्साइड नैनोकणों, superparamagnetic लोहे के आक्साइड कणों (SPIO) जैसे, उनके सेल का पता लगाने और उनके उत्कृष्ट biocompatibility के लिए उच्च संवेदनशीलता की वजह से से लागू कर रहे हैं. SPIO कण एक लोहे के आक्साइड कोर और एक dextran carboxydextran, स्टार्च या कोट, स्थानीय क्षेत्र inhomogeneities, कि टी 2 भारित एमआर छवियों पर एक कम संकेत के कारण बनाने के द्वारा और समारोह के बना रहे हैं. इस प्रस्तुति चिकित्सकीय लागू एमआर विपरीत एजेंटों के साथ स्टेम सेल के बाद एमआर इमेजिंग के साथ लेबल की कोशिकाओं के vivo पर नज़र रखने के लिए गैर इनवेसिव के लिए लेबलिंग के लिए तकनीक का प्रदर्शन करेंगे.
Protocol
Ferucarbotran साथ hMSC की लेबलिंग
यह Ferucarbotran, एमआर इमेजिंग के लिए एक लोहे के आक्साइड आधारित विपरीत एजेंट के साथ मानव mesenchymal स्टेम सेल की लेबलिंग के लिए तकनीक है:
- शुरू करने के लिए, थाली 18-24 घंटे 80% की एक संगम पर T75 बोतल में लेबलिंग प्रक्रिया से पहले कोशिकाओं. यदि आप एक अलग संस्कृति डिश का उपयोग करें, यह 2 सेमी प्रति के बारे में 10000 कोशिकाओं के बराबर है.
- अगले दिन, सीरम स्वतंत्र मीडिया के 8 मिलीलीटर Resovist के 30 μl जोड़कर लेबलिंग मीडिया की तैयारी के साथ शुरू करते हैं. यह 80 confluency% पर एक T75 फ्लास्क लेबल, 100 μg / Fe मिलीलीटर मीडिया के एक एकाग्रता के लिए संगत होगा.
- संस्कृति मीडिया ले लो और कोशिकाओं पीबीएस या सीरम स्वतंत्र मीडिया के साथ एक बार धोने. यह अवशिष्ट सीरम प्रोटीन और मीडिया के अन्य घटक है कि विपरीत एजेंट और प्रभाव लेबलिंग दक्षता बाँध सकता से छुटकारा पाने के लिए किया जाता है.
- फ्लास्क लेबलिंग मीडिया जोड़ें और इनक्यूबेटर में फ्लास्क वापस डाल दिया.
- 2 घंटे के बाद, इतना है कि 20% FCS की एक अंतिम एकाग्रता हासिल की है FCS के 2ml जोड़ें. यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं में अंतर प्रोत्साहन प्राप्त नहीं है के लिए किया जाता है, लेकिन इसके बजाय अपने परिचित वातावरण में विकसित.
- 18 घंटे से अधिक कोशिकाओं को सेते हैं. यह सबसे अच्छा रात भर किया है.
- अगले दिन, पीबीएस के साथ कोशिकाओं कुल्ला, तो उन्हें हमेशा की तरह trypsinize.
- एक बार trypsinized, सेल निलंबन 3 बार धोया मीडिया में अवशिष्ट, मुफ्त विपरीत एजेंट से छुटकारा पाने की जरूरत है. यह पीबीएस centrifuging 5 मिनट के लिए 400 आरसीएफ में कोशिकाओं के साथ किया जाता है.
- अंतिम सेल गोली और resuspended किया जा सकता है आगे के प्रयोगों के लिए तैयार है.
- कोशिकाओं अब गणना है, जैसा कि कुछ पिछले धोने चरणों के दौरान किया गया है खो सकता है. इसके अलावा, इस Trypan नीले अपवर्जन परख का उपयोग बिंदु पर व्यवहार्यता परीक्षण करने और spectrometric लेबलिंग क्षमता को मापने के विश्लेषण के लिए कुछ नमूने ले.
Ferumoxides के साथ मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की लेबलिंग
- शुरू करने के लिए, थाली 10cm व्यंजन में hESC, के रूप में हमेशा की तरह. ये व्यंजन जिलेटिन के साथ पूर्व में लिपटे रहे हैं और उन पर विकिरणित फीडर कोशिकाओं है. आप फीडर मुक्त संस्कृतियों के लिए इस प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से उपयोग कर सकते हैं.
- चलो hESC देते हैं और लगभग 3-4 दिनों के लिए बढ़ती इतना है कि वे मध्यम आकार कालोनियों के रूप में. इस समय के दौरान, सुनिश्चित करें कि कालोनियों बड़े हो जाना नहीं है, के रूप में बड़ा कालोनियों अधिक मुश्किल बाद में तोड़ रहे हैं.
- विभेदित कोशिकाओं इन संस्कृतियों को दूषित कर सकते हैं, तो कालोनियों की सफाई पर निर्भर करता है, तो आप विच्छेदन द्वारा विभेदित संस्कृतियों के छुटकारा हो सकता है.
- लेबलिंग मीडिया कि 100μg/ml और पूरा hESC मीडिया के एक एकाग्रता में Ferumoxides के होते हैं तैयार. इस के लिए, हम 89μl Ferumoxides और पूर्ण विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर का मिश्रण है.
- पूरा मीडिया के साथ पकवान एक बार धो.
- पकवान प्रति मीडिया लेबलिंग के 10 मिलीलीटर जोड़ें और 4 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- अब, लेबलिंग पूरा हो गया है. अगले चरण में, यह कोशिकाओं को धोने और आगे उपयोग के लिए एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इस के लिए, पहले पीबीएस के साथ पकवान कुल्ला.
- फिर, 0.25% trypsin के 5ml के साथ पीबीएस जगह और इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए सेते हैं, या जब तक कोशिकाओं को अलग. यह पकवान अक्सर नल में मदद करता है.
- कोशिकाओं को अब अलग है. ध्यान में रखें कि अगर पकवान बड़ा कालोनियों निहित वहाँ कुछ clumps छोड़ दिया हो सकता है.
- इन clumps से छुटकारा पाने के लिए, एक एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग कर के एक बार पूरे निलंबन मिश्रण कर सकते हैं, तो यह एक और 2 मिनट के लिए बैठते हैं.
- हम एक विंदुक Eppendorf नहीं का उपयोग करें, पतली टिप के माध्यम से कोशिकाओं के रूप में दोहराया चूसने कोशिका झिल्ली तोड़ कर सकते हैं.
- यदि अवशिष्ट clumps मौजूद हैं, एक एक 40μm सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन चला सकते हैं.
- अगर सब कुछ सही ढंग से काम किया, एक एकल कक्ष निलंबन अब मौजूद है कि मलबे का एक बहुत कुछ के साथ मिश्रित है, जिलेटिन कोटिंग से प्रारंभिक, ईएससी मैट्रिक्स और मृत कोशिकाओं. इससे छुटकारा पाना करने के लिए, कोशिकाओं में दो बार और उन्हें नीचे कताई 5 मिनट के लिए 400 आरसीएफ में धोने के लिए उन्हें पूरे मीडिया में resuspend.
- अब, ईएससी विकिरणित फीडर कोशिकाओं से अलग की जरूरत है. यह जिलेटिन लेपित एक डिश पर सेल निलंबन चढ़ाना द्वारा कुशलतापूर्वक किया जा सकता है.
- यदि पकवान चालाकी नहीं है, सभी कोशिकाओं तलछट नीचे जाएगा, लेकिन भक्षण ईएससी की तुलना में तेजी से संलग्न करेंगे.
- तो, अगर सतह पर तैरनेवाला बंद 45 मिनट के बाद लिया जाता है, यह मुख्य रूप से ईएससी होते हैं, जबकि मुख्य रूप से भक्षण डिश के लिए संलग्न किया जाना चाहिए चाहिए.
- इस तरह, चुंबकीय लेबल मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं है कि आगे के प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त की है.
- पिछले प्रोटोकॉल में के रूप में, इस बिंदु पर, आप कक्षों की गिनती और व्यवहार्यता और लेबलिंग दक्षता का आकलन मापने के लिए नमूने लेने की जरूरत है.
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Discussion
स्टेम सेल के एक गैर इनवेसिव चित्रण वस्तुतः किसी भी स्टेम सेल आधारित चिकित्सा की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है. लेबल स्टेम कोशिकाओं के vivo कैनेटीक्स में की एक बेहतर समझ, के रूप में एमआर छवियों पर कल्पना, एक तर्कसंगत रास्ता है और स्टेम सेल आधारित चिकित्सा के एक अधिक प्रभावी उपयोग हो सकता है. के बाद से हम चिकित्सकीय लागू विपरीत एजेंटों और इमेजिंग तकनीक का उपयोग करें, हमारे प्रस्तुत प्रोटोकॉल आसानी से रोगियों में आवेदन करने के लिए अनुवाद किया जाना चाहिए. हमारे तरीकों के संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों के विभिन्न स्टेम सेल उपप्रकारों या अनुवांशिक इंजीनियर स्टेम कोशिकाओं के engraftment प्रक्रिया की तुलनात्मक जांच, के रूप में अच्छी तरह के रूप में स्टेम सेल engraftment के परिणाम पर चिकित्सा के प्रभाव का आकलन शामिल हैं. परिणाम तुरंत स्टेम आधारित उपचारों के preclinical आकलन में मददगार हो सकता है, संबंधित नैदानिक परीक्षणों की डिजाइन में होना चाहिए, और बाद में उन स्टेम सेल आधारित चिकित्सा के नैदानिक व्यवहार में मूल्यांकन में. ध्यान से, हमारे इमेजिंग तकनीक भी अन्य hematopoietic स्टेम सेल या neuronal स्टेम कोशिकाओं के रूप में स्टेम सेल की आबादी के लिए लागू है.
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Acknowledgments
यह परियोजना एक लियोन पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट से जे थाल बीज अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. टोबीस हेनिंग एक जर्मन रिसर्च एसोसिएशन (DFG, महामहिम 4578/1-2) से वजीफा रिसर्च द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति पर अपनी सलाह के लिए आभार Juanito Meneses को स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
