Summary
Pour l'évaluation de nouvelles thérapies de cellules souches, il est important de suivre de manière non invasive des cellules injectées in vivo. Cette vidéo va vous montrer comment étiqueter cellules souches mésenchymateuses humaines et embryonnaires avec des agents de contraste à base d'oxyde de fer in vivo pour subséquentes IRM in vivo.
Abstract
Ces dernières années, la recherche sur les cellules souches a conduit à une meilleure compréhension de la biologie du développement, de maladies diverses et son impact potentiel sur la médecine régénérative. Une méthode non-invasive pour surveiller les cellules souches transplantées plusieurs reprises in vivo serait grandement améliorer notre capacité à comprendre les mécanismes qui la mort des cellules souches et de contrôle d'identifier les facteurs trophiques et voies de signalisation qui permettent d'améliorer la prise de greffe de cellules souches. IRM a été prouvé être un outil efficace pour la représentation en in vivo des cellules souches avec une résolution proche anatomiques microscopiques. Afin de détecter les cellules souches avec MR, les cellules doivent être étiquetés avec des cellules spécifiques des agents de contraste IRM. A cet effet, les nanoparticules d'oxyde de fer, tels que les particules d'oxyde de fer superparamagnétique (SPIO), sont appliquées, en raison de leur grande sensibilité pour la détection de cellules et de leur excellente biocompatibilité. Particules SPIO sont composées d'un noyau d'oxyde de fer et un manteau de dextrane, carboxydextran ou de l'amidon, et la fonction en créant des inhomogénéités de champ local, qui causent une diminution du signal sur les images IRM pondérées en T2. Cette présentation fera la démonstration des techniques de marquage des cellules souches avec cliniquement applicables agents de contraste IRM pour subséquentes non-invasive dans le suivi in vivo des cellules marquées avec l'IRM.
Protocol
Étiquetage des hMSC avec Ferucarbotran
C'est la technique pour l'étiquetage cellules souches mésenchymateuses humaines avec des Ferucarbotran, un oxyde de fer agent de contraste pour l'IRM basées:
- Pour commencer, plaque les cellules 18-24 heures avant la procédure de labellisation dans les flacons T75 à une confluence de 80%. Si vous utilisez une boîte de culture différente, il est égal à environ 10 000 cellules par cm 2.
- Le lendemain, commencer par préparer le support d'étiquetage en ajoutant 30 pl de Resovist à 8 ml de sérum de médias libres. Ce sera une étiquette de flacon T75 à 80% de confluence, correspondant à une concentration de 100 ug Fe / ml médias.
- Enlever les milieux de culture et laver les cellules une fois avec du PBS ou du milieu sans sérum. Ceci est fait pour se débarrasser des protéines sériques résiduelles et d'autres constituants des médias qui pourrait lier l'agent de contraste et de l'efficacité d'étiquetage influence.
- Ajouter les médias d'étiquetage dans le ballon et remettre le ballon dans l'incubateur.
- Après 2 heures, ajouter 2 ml de SVF de telle sorte que la concentration finale de 20% de FCS est atteint. Ceci est fait pour s'assurer que les cellules ne reçoivent pas de relance de différencier, mais plutôt à grandir dans leur environnement familier.
- Incuber les cellules pendant 18 heures. Il est préférable de faire en une nuit.
- Le lendemain, rincez-les cellules avec du PBS, puis trypsiniser comme d'habitude.
- Une fois trypsinées, la suspension cellulaire doit être lavé trois fois pour se débarrasser des matières résiduelles, sans agent de contraste dans les médias. Ceci est fait avec du PBS centrifugation les cellules à 400 rcf pendant 5 minutes.
- Le culot cellulaire final peut être remis en suspension et est prêt pour de nouvelles expériences.
- Compter les cellules maintenant, comme certains pourraient avoir été perdus au cours des étapes précédentes à laver. En outre, effectuer des tests de viabilité à ce point en utilisant le test d'exclusion au bleu Trypan et prendre quelques échantillons pour analyse par spectrométrie de mesurer l'efficacité d'étiquetage.
Étiquetage des cellules souches embryonnaires humaines avec Ferumoxides
- Pour commencer, la plaque du CSEh dans des plats de 10cm, comme d'habitude. Ces plats sont pré-enduites de gélatine et de cellules nourricières irradiées ont sur eux. Vous pouvez utiliser ce protocole pour le chargeur sans cultures.
- Laissez les CSEh attacher et croître pendant environ 3-4 jours de sorte qu'ils forment des colonies moyennes entreprises. Pendant ce temps, s'assurer que les colonies ne poussent pas à la grande, que les grandes colonies sont plus difficiles à briser plus tard.
- Les cellules différenciées peuvent contaminer ces cultures, si en fonction de la propreté des colonies, vous pouvez avoir à se débarrasser des cultures différenciées par la dissection.
- Préparer les médias d'étiquetage qui consiste Ferumoxides à une concentration des médias sur les CSEh 100μg/ml et complète. Pour cela, nous mélangeons 89μl Ferumoxides et 10 ml de milieu de croissance complet.
- Laver la vaisselle une fois avec les médias complet.
- Ajouter 10 ml d'étiquetage des médias par plat et incuber les cellules pendant 4 heures.
- Maintenant, l'étiquetage est complet. Dans la prochaine étape, il est nécessaire de laver les cellules et obtenir une suspension cellulaire unique pour une utilisation ultérieure. Pour cela, d'abord rincer la vaisselle avec du PBS.
- Ensuite, remplacez le PBS avec 5 ml de trypsine à 0,25% et incuber dans l'étuve pendant 5 minutes, ou jusqu'à ce que les cellules se détachent. Il aide à exploiter le plat fréquemment.
- Les cellules ont désormais détaché. Gardez à l'esprit que si le plat contenait de plus grandes colonies pourrait y avoir quelques bouquets gauche.
- Pour se débarrasser de ces amas, on peut mélanger toute la suspension une fois en utilisant une pipette sérologique, puis laissez-le reposer pendant 2 minutes.
- Nous n'utilisons pas une pipette Eppendorf, sucer comme répétées des cellules à travers la pointe fine peut rompre les membranes cellulaires.
- Si les mottes résiduelles sont présentes, on peut exécuter la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire 40μm.
- Si tout marche correctement, une suspension cellulaire unique existe maintenant qui est mélangée avec beaucoup de débris, provenant de la couche de gélatine, l'ESC-matrice et les cellules mortes. Pour se débarrasser de cela, laver les cellules deux fois plus bas en les faisant tourner à 400 rcf pendant 5 minutes et les remettre en suspension dans un milieu complet.
- Maintenant, le CES doit être isolé de la cellules nourricières irradiées. Cela peut être fait efficacement par étalement de la suspension cellulaire sur un plat de gélatine-enduit.
- Si le plat n'est pas manipulé, toutes les cellules seront sédiments vers le bas, mais les mangeoires attachera plus vite que la CES.
- Donc, si le surnageant est retiré après 45 minutes, il devrait contenir essentiellement ESC, alors que les mangeoires doivent être principalement attaché à l'antenne.
- De cette façon, une suspension cellulaire unique marquées magnétiquement cellules souches embryonnaires humaines qui peuvent être utilisées pour d'autres expériences est obtenu.
- Comme dans le précédent protocole, à ce stade, vous avez besoin de compter les cellules et prélever des échantillons pour l'évaluation de la viabilité et l'efficacité de la mesure d'étiquetage.
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Discussion
Une représentation non-invasive de cellules souches est cruciale pour le suivi pratiquement toutes les thérapies cellulaires basées. Une meilleure compréhension de la cinétique in vivo des cellules souches étiquetées, comme visualisées sur les images IRM, pourrait ouvrir la voie à une utilisation rationnelle et une utilisation plus efficace de base de cellules souches thérapies. Puisque nous utilisons des agents de contraste cliniquement applicables et les techniques d'imagerie, nos protocoles présentés doivent être facilement traduisible aux demandes des patients. Des applications cliniques potentielles de nos méthodes comprennent des enquêtes comparatives sur le processus de prise de greffe de différents sous-types de cellules souches ou de cellules souches génétiquement modifiées, ainsi que, l'évaluation des effets thérapeutiques sur les résultats de la greffe de cellules souches. Les résultats devraient être immédiatement utile dans l'évaluation préclinique de thérapies basées sur la tige, à la conception des essais cliniques liés, et plus tard, dans l'évaluation de ces cellules souches thérapies basées sur la pratique clinique. Fait à noter, notre technique d'imagerie est aussi applicable à d'autres populations de cellules souches, comme les cellules souches hématopoïétiques ou de cellules souches neuronales.
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Acknowledgments
Ce projet a été soutenu par une subvention Leon J. Thal SEED du California Institute for Regenerative. Tobias Henning a été financée par une allocation de recherche de l'Association allemande de recherche (DFG, SE 4578/1-2). Nous voulons remercier chaleureusement Meneses Juanito pour ses conseils sur la culture de cellules souches embryonnaires humaines.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
