Etikettering hESC 's en hMSCs met ijzeroxide nanodeeltjes voor niet-invasieve in vivo Tracking met MR Imaging

Summary

Voor de evaluatie van nieuwe stamcellen therapieën is het belangrijk om niet-invasief spoor de geïnjecteerde cellen in vivo. Deze video toont u hoe de menselijke mesenchymale en embryonale stamcellen met ijzeroxide gebaseerde contrastmiddelen label in vivo voor latere MR imaging in vivo.

Abstract

In de afgelopen jaren, heeft stamcelonderzoek heeft geleid tot een beter begrip van de ontwikkelingsbiologie, verschillende ziekten en de mogelijke impact op de regeneratieve geneeskunde. Een niet-invasieve methode om herhaling zien op de getransplanteerde stamcellen in vivo zal sterk verbeteren ons vermogen om de mechanismen te begrijpen die de controle stamcellen dood en identificeren van trofische factoren en signaalwegen die stamcellen engraftment te verbeteren. MRI heeft bewezen een effectief instrument voor de in vivo afbeelden van stamcellen met bijna microscopische anatomische resolutie. Om de stamcellen met MR te detecteren, de cellen moeten worden geëtiketteerd met cel-specifieke MR contrastmiddelen. Voor dit doel zijn ijzeroxide nanodeeltjes, zoals superparamagnetische ijzeroxide deeltjes (SPIO), toegepast, vanwege hun hoge gevoeligheid voor cel-detectie en hun uitstekende biocompatibiliteit. SPIO deeltjes zijn opgebouwd uit een kern van ijzeroxide en een dextran, carboxydextran of zetmeel vacht, en de functie door het creëren van lokale veld inhomogeniteiten, dat een verminderde signaal op T2-gewogen MR beelden veroorzaken. Deze presentatie zal aantonen technieken voor etikettering van stamcellen met klinisch toepasbare MR contrastmiddelen voor verdere niet-invasieve in vivo volgen van de gemerkte cellen met MRI.

Protocol

Etikettering van hMSC met Ferucarbotran

Dit is de techniek voor de etikettering menselijke mesenchymale stamcellen met Ferucarbotran, een ijzeroxide op basis van contrastmiddel voor MRI:

1. Om te beginnen, het bord van de cellen 18-24 uur voor de etikettering procedure in T75 flessen bij een samenloop van 80%. Als u een andere cultuur schotel, dit is gelijk aan ongeveer 10.000 cellen per cm ^2.
2. De volgende dag, te beginnen met de voorbereiding van de etikettering media door het toevoegen van 30 pi van Resovist tot 8 ml serum vrije media. Dit zal een label T75 kolf bij 80% confluentie, wat overeenkomt met een concentratie van 100 ug Fe / ml media.
3. Take off van de cultuur media en een keer was de cellen met PBS of serum-vrije media. Dit wordt gedaan om zich te ontdoen van de resterende serum eiwitten en andere bestanddelen van de media die het contrastmiddel en invloed etikettering efficiëntie zou kunnen binden.
4. Voeg de etikettering media om de kolf en zet de kolf terug in de incubator.
5. Na 2 uur, voeg 2 ml FCS, zodat een uiteindelijke concentratie van 20% FCS is bereikt. Dit wordt gedaan om ervoor te zorgen dat de cellen geen stimulans om een ​​onderscheid te ontvangen, maar in plaats daarvan groeien in hun vertrouwde omgeving.
6. Incubeer de cellen gedurende 18 uur. Dit is het beste 's nachts gedaan.
7. De volgende dag, de cellen met PBS spoelen, dan trypsinize ze zoals gewoonlijk.
8. Eenmaal getrypsiniseerd, de celsuspensie moet worden gewassen 3 keer om zich te ontdoen van de resterende, vrije contrastmiddel te krijgen in de media. Dit wordt gedaan met PBS centrifugeren de cellen op 400 RCF gedurende 5 minuten.
9. De uiteindelijke celpellet kan worden geresuspendeerd en is klaar voor verdere experimenten.
10. Nu tellen de cellen, zoals sommigen misschien verloren zijn gegaan tijdens de vorige wasstappen. Ook, uit te voeren levensvatbaarheid getest op dit punt met behulp van de trypan blauw uitsluiting test en neem monsters voor spectrometrische analyse van de etikettering efficiëntie te meten.

Etikettering van menselijke embryonale stamcellen met Ferumoxides

1. Om te beginnen, het bord van de hESC in 10cm gerechten, zoals gewoonlijk. Deze gerechten zijn vooraf gecoat met gelatine en hebben bestraald feeder-cellen op hen. U kunt dit protocol voor feeder-vrije culturen.
2. Laat de hESC hechten en te groeien naar ongeveer 3-4 dagen, zodat ze vormen middelgrote kolonies. Gedurende deze tijd, ervoor te zorgen dat de koloniën niet uitgroeien tot grote, als grotere kolonies zijn later moeilijk te breken.
3. Gedifferentieerde cellen kunnen deze culturen worden besmet, dus afhankelijk van de reinheid van de koloniën, moet u wellicht om zich te ontdoen van gedifferentieerde culturen door dissectie.
4. Bereid de etikettering media die van Ferumoxides bestaat bij een concentratie van 100μg/ml en volledige hESC media. Voor deze, we mixen 89μl Ferumoxides en 10 ml volle groei media.
5. Ze wast de schotel met een complete media.
6. Voeg 10 ml van de etikettering media per schotel en incubeer de cellen gedurende 4 uur.
7. Nu, het etiket is voltooid. In de volgende stap, is het noodzakelijk om de cellen te wassen en een enkele celsuspensie voor verder gebruik te krijgen. Voor deze eerst spoel de schaal met PBS.
8. Dan, vervangt u de PBS met 5 ml van 0,25% trypsine en broeden in de incubator gedurende 5 minuten, of totdat de cellen los te maken. Het helpt om de schotel vaak kraan.
9. De cellen zijn nu los. Houd er rekening mee dat als de schotel die grotere kolonies er misschien worden gelaten wat bosjes.
10. Om zich te ontdoen van deze klonten, kan men de gehele suspensie mix een keer met behulp van een serologische pipet, dan laat het zitten voor nog eens 2 minuten.
11. We maken geen gebruik van een Eppendorf pipet, als herhaalde zuigen van de cellen door de dunne tip kan breken de celmembranen.
12. Als resterende klontjes aanwezig zijn, kan men de celsuspensie lopen door een 40μm cel zeef.
13. Als alles werkt goed, een enkele celsuspensie bestaat nu dat is vermengd met een hoop puin, afkomstig van de gelatine coating, de ESC-matrix en dode cellen. Om zich te ontdoen van deze, twee keer wassen van de cellen door het draaien van hen neer op 400 RCF gedurende 5 minuten en resuspendeer ze in volle media.
14. Nu, de ESC moet worden geïsoleerd van de bestraalde feeder cellen. Dit kan efficiënt worden uitgevoerd door uitplating de celsuspensie op een gelatine-gecoate schaal.
15. Als de schotel is niet gemanipuleerd, alle cellen zullen sediment naar beneden, maar de feeders zal hechten sneller dan de ESC.
16. Dus, als de supernatant wordt genomen uit na 45 minuten, moet het bevatten voornamelijk ESC, terwijl de feeders moet vooral worden bevestigd aan het gerecht.
17. Op deze manier is een enkele celsuspensie van magnetisch gelabeld menselijke embryonale stamcellen die kunnen worden gebruikt voor verdere experimenten verkregen.
18. Net als in het vorige protocol, op dit moment, moet je de cellen tellen en monsters te nemen voor de levensvatbaarheid beoordeling en het meten van de etikettering efficiency.

Discussion

Een niet-invasieve weergave van stamcellen is cruciaal voor de controle op vrijwel elke stamcel therapie op basis van. Een beter begrip van de in vivo kinetiek van gelabelde stamcellen, zoals gevisualiseerd op MR beelden, zou kunnen leiden de weg naar een rationeel en een effectiever gebruik van op basis van stamcellen therapieën. Omdat we gebruik van klinisch toepasbare contrastmiddelen en beeldvormende technieken, moeten onze gepresenteerd protocollen gemakkelijk vertaalbaar voor toepassingen bij patiënten. Mogelijke klinische toepassingen van onze methoden omvatten vergelijkend onderzoek van de innesteling proces van de verschillende subtypen stamceltherapie of genetisch gemanipuleerde stamcellen, evenals de beoordeling van de therapie effecten op de uitkomst van stamcellen engraftment. Resultaten moeten onmiddellijk nuttig zijn in preklinische beoordeling van stam-gebaseerde therapieën, bij het ontwerp van gerelateerde klinische proeven, en later, in de beoordeling van deze op basis van stamcellen therapieën in de klinische praktijk. Van de nota, onze beeldvormende techniek is ook toepasbaar op andere stamcellen populaties, zoals hematopoietische stamcellen of neuronale stamcellen.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	D5648
Gelatin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1890	dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 %
PBS (Ca++ Mg++ freed)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%	Reagent	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0.25%	Reagent	Invitrogen	25200-114
FBS characterized	Reagent	Hyclone	SH30071.03
Cell Strainer (40 μm Nylon)	Tool	BD Biosciences	352340
Knockout DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10829018
Knockout Serum Replacer	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828028
b-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	7522
non-essential amino acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140050
FGF-2	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Ferumoxides (Endorem)	Reagent	Guerbet
Ferucarbotran (Resovist®)	Reagent	Bayer AG