Summary
Für die Bewertung von neuen Stammzelltherapien ist es wichtig, nicht-invasiv Spur der injizierten Zellen in vivo. Dieses Video zeigt Ihnen, wie Sie humanen mesenchymalen und embryonalen Stammzellen mit Eisenoxid-Kontrastmittel in vivo für die nachfolgenden MR-Bildgebung in vivo-Label.
Abstract
In den letzten Jahren hat die Stammzellenforschung zu einem besseren Verständnis der Entwicklungsbiologie, verschiedene Krankheiten und ihre möglichen Auswirkungen auf die regenerative Medizin geführt. Eine nicht-invasive Methode, um die transplantierten Stammzellen wiederholt Monitor in vivo würden enorm steigen unsere Fähigkeit, die Mechanismen zu verstehen, dass die Kontrolle Stammzellen Tod und identifizieren trophischen Faktoren und Signalwege, die Stammzell-Transplantation zu verbessern. MR-Bildgebung hat sich als ein wirksames Instrument für die In-vivo-Darstellung von Stammzellen mit der Nähe mikroskopischen anatomischen Auflösung. Um Stammzellen mit MR zu erkennen, müssen die Zellen mit Zell-spezifische MR-Kontrastmitteln markiert werden. Zu diesem Zweck sind Eisenoxid-Nanopartikel, wie superparamagnetische Eisenoxid-Partikel (SPIO), angewendet, die aufgrund ihrer hohen Sensitivität für die Zelle Erkennung und ihrer hervorragenden Biokompatibilität. SPIO Partikel bestehen aus einem Eisenoxid-Kern und einer Dextran, Carboxydextran oder Stärke Fell und Funktion durch die Schaffung lokaler Inhomogenitäten, dass eine verminderte Signal auf T2-gewichteten MRT-Bilder verursachen zusammen. Diese Präsentation wird Techniken zur Markierung von Stammzellen mit klinisch anwendbaren MR-Kontrastmittel für die nachfolgende nicht-invasive in vivo Verfolgung der markierten Zellen mit der MR-Bildgebung zu demonstrieren.
Protocol
Kennzeichnung von hMSC mit Ferucarbotran
Dies ist die Technik für die Kennzeichnung von humanen mesenchymalen Stammzellen mit Ferucarbotran, eine Basis von Eisenoxid-Kontrastmittel für die MR-Bildgebung:
- Um zu beginnen, Platte die Zellen 18-24 Stunden vor der Etikettierung Verfahren in T75 Flaschen bei einer Konfluenz von 80%. Wenn Sie eine andere Kulturschale zu verwenden, ist dies entspricht etwa 10000 Zellen pro cm 2.
- Am nächsten Tag mit der Vorbereitung der Kennzeichnung Medien durch Zugabe von 30 ul von Resovist zu 8 ml Serum freie Medien zu starten. Dies wird eine T75-Kolben bei 80% Konfluenz Label, das entspricht einer Konzentration von 100 ug Fe / ml Medium.
- Nehmen Sie den Kulturmedien und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS oder Serum-freien Medien. Dies geschieht, um loszuwerden, verbleibende Serumproteine und andere Bestandteile der Medien, dass das Kontrastmittel und Einfluss Labelingeffizienz binden konnte.
- Fügen Sie die Kennzeichnung Medien in den Kolben und steckte die Flasche zurück in den Inkubator.
- Nach 2 Stunden, fügen 2ml FCS, so dass eine Endkonzentration von 20% FCS erreicht wird. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht empfangen Reiz zu unterscheiden, sondern in ihrer gewohnten Umgebung zu wachsen.
- Inkubieren Sie die Zellen über 18 Stunden. Dies geschieht am besten über Nacht.
- Am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen mit PBS, dann trypsinize sie wie gewohnt.
- Sobald trypsiniert, muss die Zellsuspension 3 mal gewaschen werden, um loszuwerden, residual, frei Kontrastmittel in den Medien. Dies ist mit PBS Zentrifugieren der Zellen bei 400 rcf für 5 Minuten erledigt.
- Die endgültige Zellpellet kann resuspendiert und ist bereit für weitere Experimente.
- Zählen Sie die Zellen nun, wie einige vielleicht während der letzten Waschschritte verloren gegangen. Auch führen die Lebensfähigkeit Tests an dieser Stelle mit dem Trypanblau-Ausschluss-Assay und einige Proben für die massenspektrometrische Analyse über die Etikettierung Effizienz zu messen.
Kennzeichnung von humanen embryonalen Stammzellen mit Ferumoxides
- Zu Beginn der Platte hESC in 10cm Gerichte, wie gewohnt. Diese Gerichte sind vorbeschichtet mit Gelatine und bestrahlten Feeder-Zellen auf ihnen. Sie können dieses Protokoll für Feeder-freien Kulturen zu nutzen.
- Lassen Sie die hESC legen und wachsen etwa 3-4 Tage, so dass sie mittelgroße Kolonien zu bilden. Während dieser Zeit sicherzustellen, dass die Kolonien nicht zu groß werden, da größere Kolonien schwerer zu brechen später.
- Differenzierte Zellen können diese Kulturen verunreinigen, so abhängig von der Sauberkeit der Kolonien, müssen Sie unter Umständen loswerden differenzierten Kulturen durch Dissektion.
- Bereiten Sie die Kennzeichnung Medien, dass der Ferumoxides besteht bei einer Konzentration von 100μg/ml und voller hESC Medien. Dazu mischen wir 89μl Ferumoxides und 10 ml vollem Wachstum Medien.
- Waschen Sie die Teller einmal mit kompletter Medien.
- 10 ml Kennzeichnung Medien pro Gericht und inkubieren Sie die Zellen für 4 Stunden.
- Nun ist die Kennzeichnung zu vervollständigen. Im nächsten Schritt ist es notwendig, die Zellen waschen und eine einzige Zellsuspension für die weitere Verwendung. Hierzu wird zunächst gründlich die Schale mit PBS.
- Ersetzen Sie dann die PBS mit 5 ml 0,25% Trypsin und inkubieren in den Inkubator für 5 Minuten, oder bis die Zellen zu lösen. Es hilft, das Gericht häufig zu erschließen.
- Die Zellen haben jetzt gelöst. Denken Sie daran, dass, wenn die Schale enthaltenen größeren Kolonien kann es einige Klumpen bleiben.
- Um loszuwerden diese Klumpen, kann man die ganze Suspension einmal mit einer serologischen Pipette mischen, dann lassen Sie es für weitere 2 Minuten sitzen.
- Wir verwenden keine einer Eppendorf-Pipette, wie wiederholt Saugen der Zellen durch die dünne Spitze können die Zellmembranen zu brechen.
- Wenn verbleibende Klumpen vorhanden sind, kann man die Zellsuspension durch ein 40 um Zellsieb laufen.
- Wenn alles funktioniert, eine einzige Zellsuspension Jetzt gibt es mit einer Menge Schutt gemischt, die aus der Gelatine-Beschichtung, die ESC-Matrix und tote Zellen. Um dies zu beheben, waschen Sie die Zellen zweimal durch Drehen sie sich bei 400 rcf für 5 Minuten und resuspendieren sie in voller Medien.
- Nun muss der ESC von der bestrahlten Feeder-Zellen isoliert werden. Dies kann effizient durch Ausplattieren der Zellsuspension auf eine mit Gelatine beschichtete Gericht erfolgen.
- Wenn das Gericht nicht manipuliert wird, werden alle Zellen Sediment ab, aber die Anleger werden anhängen schneller als der ESC.
- Also, wenn der Überstand wird nach 45 Minuten gedauert, sollte es vor allem ESC, während die Anleger sollten vor allem auf der Schale angebracht werden.
- Auf diese Weise wird eine einzelne Zelle Aussetzung der magnetisch markierte humane embryonale Stammzellen, die für weitere Experimente verwendet werden können erhalten werden.
- Wie in den vorangegangenen Protokoll, an diesem Punkt, müssen Sie die Zellen zu zählen und nehmen Proben für die Lebensfähigkeit Beurteilung und Messung der Kennzeichnung Effizienz.
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Discussion
Eine nicht-invasive Darstellung von Stammzellen ist von entscheidender Bedeutung für die Überwachung praktisch jede Stammzelle Therapie. Ein besseres Verständnis der in vivo Kinetik von markierten Stammzellen, wie visualisiert MR-Bildern, könnte dazu führen, den Weg zu einer rationalen und einer effizienteren Nutzung der Stammzellen-basierten Therapien. Da wir klinisch anwendbare Kontrastmittel-und Imaging-Techniken verwenden, sollten unsere vorgestellt Protokolle leicht übersetzbar zu Anwendungen bei Patienten. Potentielle klinische Anwendungen der Methoden sind vergleichende Untersuchungen der Transplantation Prozess der verschiedenen Stammzell-Subtypen oder gentechnisch Stammzellen, sowie die Beurteilung der Therapie Auswirkungen auf das Ergebnis der Stammzell-Transplantation. Die Ergebnisse sollten sofort hilfreich in der präklinischen Beurteilung der Stammzellen-basierten Therapien, bei der Gestaltung von verwandten klinischen Studien, und später, in der Bewertung dieser Stammzellen-basierten Therapien in der klinischen Praxis. Zu beachten ist, ist unser bildgebendes Verfahren auch auf andere Stammzell-Populationen, wie hämatopoetische Stammzellen oder neuronale Stammzellen.
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Acknowledgments
Dieses Projekt wurde von einem Leon J. Thal SEED Zuschuss aus dem California Institute for Regenerative Medicine unterstützt. Tobias Henning wurde durch eine Forschung von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HE 4578/1-2) Stipendium finanziert. Wir wollen danken Juanito Meneses für seine Beratung auf die Kultur von humanen embryonalen Stammzellen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
