Procesamiento de los Pinus taeda PtGen2 cDNA microarray

Este video fue producido por investigadores de la Escuela Warnell de Silvicultura y Recursos Naturales de la Universidad de Georgia. El propósito de este video de capacitación es detallar cómo procesar nuestro microarray LOB lolly pine pt, gen two CDNA, prestando especial atención al lavado y manejo del array, tanto antes como después de la hibridación. En general, nuestros protocolos siguen los desarrollados en el Instituto de Investigación Genómica Tiger y el Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, donde se imprimen nuestras matrices.

Hemos descubierto que se requiere un procesamiento más estricto de PT Gen dos para proporcionar la mayor cantidad de consistencia con respecto a la uniformidad de la calidad de la señal y los fondos bajos. El primer paso es un prelavado. Hacemos esto porque nuestro tampón de manchas contiene un contenido de sal muy alto y este prelavado es necesario para eliminar esa sal.

Los portaobjetos se colocan en un portaobjetos de microscopio y se sumergen vigorosamente de 15 a 20 veces en una solución de SDS al 0,2% que se ha precalentado a 43 grados. Después de lavar los portaobjetos en la solución SDS, se retiran cuidadosamente con pinzas y se colocan en un frasco Copeland que contiene tampón de prehibridación. Este tampón contiene cinco XSSC 0.1%SDS y 1%BSA, y también se calienta a 43 grados.

El frasco Copeland se cubre con perfume y se coloca en una incubadora a 43 grados durante una hora. Después de la prehibridación, los portaobjetos se retiran a un portaobjetos de microscopio y se procesan sucesivamente a través de cinco cambios de agua desionizada sumergiéndose de 15 a 20 veces en cada cambio. Finalmente, los portaobjetos se colocan en isopropanol y se sumergen cinco o seis veces antes de ser centrifugados hasta la sequedad en una centrífuga de chip Mmate.

Después de la centrifugación, los portaobjetos se soplan con aire comprimido que pasa a través de un filtro de 0,2 micras. A continuación, las correderas se recubren con deslizadores de elevación, que también se han limpiado con aire comprimido, y utilizamos una pequeña punta de pipeta para ajustar el deslizamiento del elevador a la posición correcta. En la diapositiva.

Una vez colocados los deslizamientos del elevador, pero antes de añadir el tampón de hibridación, añadimos 20 microlitros de 100 milimolares de dihi, tres atol a los pozos de humedad situados en los extremos de la cámara. Ahora estamos listos para agregar los CDNA de destino, que se han resuspendido en el búfer de hibridación. La punta de la pipeta se coloca en el borde del deslizamiento del elevador y la corredera y la solución se pipetean lentamente.

Descubrimos que utilizar el efecto capilar para cargar las matrices proporciona la mayor consistencia y reduce en gran medida la incorporación de burbujas no deseadas. Una vez que se ha agregado el material objetivo a la matriz, la cámara de hibridación se ensambla y se cubre con papel de aluminio. Luego, la cámara de hibridación se coloca en un baño de agua agitada para la incubación durante la noche, generalmente de 14 a 16 horas.

El baño de agua se ajusta a 48 grados y el agitador se ajusta a 50 rpm. Es importante tener en cuenta también que desde el punto de adición de la solución de hibridación a través de todos los lavados posteriores a la hibridación, los procedimientos se llevan a cabo con poca luz para evitar la fotooxidación. Al día siguiente, los portaobjetos se retiran de la cámara de hibridación y se colocan en un frasco Copeland que contiene la solución de lavado número uno, que se ha precalentado a 53 grados.

Se permite que los portaobjetos permanezcan en el frasco Copeland durante aproximadamente un minuto hasta que los resbalones del elevador se caigan, momento en el que los portaobjetos se retiran suavemente con pinzas y se colocan en un portaobjetos de microscopio para proceder con los lavados. A continuación, los portaobjetos se sumergen vigorosamente unas 15 a 20 veces en un segundo recipiente, que también contiene la solución de lavado número uno a 53 grados. A continuación, el recipiente se cubre con perfume y se coloca en un agitador de aire de la incubadora ajustado a 53 grados y cien RPM.

Después de la solución de incubación y lavado de 10 minutos, número uno, los portaobjetos se sumergen vigorosamente de 15 a 20 veces en un recipiente con solución de lavado número dos, que está a temperatura ambiente en el recipiente. Esto se cubre con película paradistinta y se coloca de nuevo en una coctelera a temperatura ambiente durante una incubación de 10 minutos. Finalmente, los portaobjetos se retiran de la solución de lavado número dos y se sumergen vigorosamente de 15 a 20 veces en un recipiente con la solución de lavado número tres.

A continuación, los portaobjetos se introducen en un segundo recipiente con la solución de lavado número tres cubierta con perfil y se vuelven a colocar en el agitador durante 10 minutos. Después del lavado final, centrifugamos los portaobjetos hasta que se sequen por completo. Para hacer esto, colocamos una tapa Falcon de 15 mil en un tubo cónico de 50 mil, y colocamos el lado del código de barras de las matrices hacia abajo en el tubo cónico.

A continuación, los tubos se hacen girar en un cabezal de cucharón oscilante a 1500 RPM a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, los portaobjetos se retiran a un segundo conjunto de tubos cónicos de 50 milésimas de pulgada, que se han cubierto con papel de aluminio. A continuación, los tubos se purgan con gas nitrógeno, que se filtra a través de un filtro y un tapón de 0,22 micras para su transporte o para su almacenamiento hasta el escaneo.

Recopilamos datos de escaneo en una matriz de escaneo PerkinElmer 5, 000. La imagen de la matriz se cuadricula y se procesan los datos de escaneo sin procesar, y el análisis inicial de los datos se realiza con el paquete de software de imágenes de bio discovery. A continuación, los datos de intensidad de la señal puntual se normalizan a medida que se realizan análisis estadísticos con BRB array tools, un paquete estadístico de microarrays robusto y de libre acceso que se puede descargar del Instituto Nacional del Cáncer.

Otros análisis estadísticos y búsquedas de patrones de expresión génica se realizan con el conjunto de análisis y patrones de expresión génica de Jeep PPA. Otro paquete de análisis basado en la web disponible gratuitamente. Gracias por ver nuestro vídeo sobre cómo procesar el microarray PT Gen two de pino lolly pine.

Las siguientes personas fueron responsables del contenido y la producción de este video de capacitación.