La cultura y el mantenimiento de células estaminales embrionarias humanas

Hola, soy Leah Kent de STEM Gent. Hoy le mostraremos los procedimientos para alimentar, eliminar, diferenciar y empaquetar células madre embrionarias humanas. Utilizamos estas técnicas en nuestro laboratorio para el cultivo rutinario y el mantenimiento de las células HES.

Así que comencemos. La calidad general del cultivo se evalúa observando las colonias a baja potencia utilizando dos o cinco aumentos de x. Al observar las células bajo el microscopio, observe la siguiente ausencia de contaminación visible en el color medio normal, el tamaño y la densidad de las colonias y la calidad general de las células.

El medio de cultivo de células madre embrionarias humanas frescas normalmente tiene un color naranja o pajizo después de la incubación durante la noche. El medio de cultivo a menudo parece más amarillo debido al cambio en el pH y el agotamiento de los nutrientes en el medio. Si el medio aparece de color púrpura como se muestra en este ejemplo, se ha producido un cambio básico del pH.

Si el medio tiene un aspecto extremadamente amarillo, el medio se ha acidificado, lo que puede ser el resultado de colonias extremadamente superpobladas o contaminación. El medio debe aparecer claro en todo momento. Si el cultivo no contiene colonias grandes o densas, las células no necesitan empaquetamiento, pero sí necesitan alimentación diaria.

Lleve las células a la cabina de seguridad biológica. Retire la tapa de la placa de cultivo y aspire el medio gastado. No permita que la punta de la pipeta toque ninguna parte de la placa que no sea directamente dentro de los pocillos.

Utilizando una pipeta de vidrio estéril con la cantidad adecuada de cultivo de células madre embrionarias humanas calientes, de medio a pocillo para cultivos en una placa de seis pocillos a 2,5 mililitros de medio por pocillo después de que se hayan alimentado las células, devuelva la placa a la incubadora. La diferenciación ocurre comúnmente en los bordes de las colonias de células madre embrionarias humanas. Usando un microscopio y una herramienta de recolección estéril, las células diferenciadas se pueden extraer suavemente del borde de la colonia, dejando atrás las células indiferenciadas.

Para el cultivo continuo, se puede utilizar el mismo procedimiento cuando se extraen células diferenciadas del centro de una colonia, dejando un anillo de células madre embrionarias humanas indiferenciadas alrededor del área de las células que se eliminaron. Si el cultivo contiene más de aproximadamente un 10% de colonias diferenciadas, las células deben limpiarse eliminando manualmente las áreas diferenciadas. Para hacer esto primero, transforme el vidrio de nueve pulgadas más allá de sus pipetas en herramientas de recolección.

Al moldear las puntas sobre la llama controlada de un quemador de alcohol, asegúrese de que la punta de la pipeta esté sellada para evitar la contaminación y redondeada. Para evitar rayar el plástico de la placa de cultivo antes de usar las herramientas de recolección, esterilícelos con la fuente de luz UV en el gabinete de seguridad biológica durante 15 a 20 minutos. Para eliminar las células diferenciadas, primero sepárelas del resto de la colonia dibujando una línea a través de la colonia con el extremo de la herramienta de recolección.

Una vez que las piezas de la colonia estén separadas, deslice suavemente la herramienta de recolección a lo largo de la placa para separar las células no deseadas. Tenga cuidado de no raspar demasiado de la capa de alimentación de metanfetamina entre las colonias en este proceso. Cuando todas las células diferenciadas se hayan retirado de la placa y floten en el medio, lleve el cultivo al gabinete de seguridad biológica.

Aspire el medio que contiene las células diferenciadas y reemplácelo con un cultivo de ESL humano fresco. Medio a paso. Células E es humanas.

Las colonias se raspan suavemente de la superficie de la placa de cultivo con una pipeta serológica después de una breve incubación enzimática que desea que se raspen todos los pocillos que se van a pasar. Las piezas de la colonia se recogen en un tubo cónico de 15 mililitros y se centrifugan para producir un pellet de celda suelto. A continuación, se retira el sobrenadante y el gránulo de la célula se vuelve a suspender hasta convertirse en una célula del tamaño adecuado.

Agregados por pipeteo en medio ESL humano fresco. Después de enjuagar una nueva placa de cultivo que contiene una capa alimentadora de metanfetamina recién irradiada, las células E es humanas se distribuyen uniformemente entre los pocillos de la nueva placa y se permiten que se adhieran durante la noche. Si el cultivo contiene colonias grandes o densas, o si la capa alimentadora de MEF tiene más de 12 días de antigüedad, las células deben pasar a un gabinete de seguridad biológica estéril.

Retire la tapa de la placa de cultivo de seis pocillos y aspire el medio gastado de los pocillos a pasar. Con una pipeta de vidrio estéril, agregue un mililitro de colagenasa calentada cuatro a cada pocillo que se vaya a pasar. Regrese la placa a la incubadora a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

Después de los cinco minutos, observe las colonias bajo el microscopio. La enzima debería causar un cambio sutil pero observable en los bordes de la colonia. Se vuelven más definidos y puede aparecer un halo de luz a su alrededor.

En el gabinete de seguridad biológica, aspire suavemente la enzima de cada pocillo y reemplácela con dos mililitros de cultivo de células madre embrionarias humanas. Medio. Incline la placa de cultivo ligeramente hacia usted y tome los dos mililitros de medio. En el primer pocillo, con una pipeta de vidrio de cinco mililitros, sosteniendo la pipeta perpendicular al fondo de la placa, deslice suavemente la punta de la pipeta por el pocillo.

Mientras libera lentamente el medio. Repita este movimiento de raspado y pipeteo tres o cuatro veces hasta que todas las colonias se hayan retirado del pozo. Cuando se hayan extraído las células del primero, deje el contenido en el pocillo y comience a raspar las células del siguiente pocillo.

Cuando se hayan raspado todos los pocillos que se van a atravesar, agrupe el medio que contiene los trozos de colonia de cada pocillo en una pipeta de tubo cónico estéril de 15 mililitros con cuidado para evitar romper las colonias en trozos demasiado pequeños. Enjuague los pocillos raspados agregando un mililitro de cultivo de ESL humano. Medio a cada uno.

Recoge bien este enjuague y transfiéralo al tubo cónico en las celdas suavemente en el tubo para romper los trozos de la colonia al tamaño deseado. Centrifugar las células durante cinco minutos a 200 Gs mientras se centrifugan las células humanas. Prepare un nuevo plato alimentador de metanfetamina de seis pocillos.

Etiquete la placa con la línea celular de información de células madre embrionarias humanas apropiada, el nuevo número de paso y la fecha de paso. Aspire el medio de metanfetamina de los pozos y agregue un mililitro de PVS a cada uno. Bueno, agite suavemente el tampón alrededor de los pocillos y aspire el lavado PBS.

Añade 1,5 mililitros de cultivo humano de ESL. Pase el medio a cada pocillo y deje el plato a un lado. Después de centrifugar las células madre embrionarias humanas, lleve el tubo de vuelta al gabinete de seguridad biológica.

Aspirar el sobrenadante. Tenga cuidado de no perturbar la pelletización de celda suelta. Vuelva a suspender las células en el pellet con suficiente medio para un mililitro de cultivo de ESL humano, medio por pocillo nuevo que se va a platear.

Por ejemplo, al dividir en seis pozos nuevos, resus, suspender el pellet en seis mililitros de medio. Pipetear suavemente las colonias para romper las piezas al tamaño adecuado y dispersar uniformemente las piezas de la colonia. Agregue un mililitro de la suspensión celular a cada pocillo preparado de la placa de alimentación MEF.

Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados y deslice con cuidado la placa de adelante hacia atrás y deslícela hacia los lados para distribuir uniformemente las celdas por todo el pocillo. Permita que las celdas se adhieran a 37 grados centígrados durante la noche. Las células madre embrionarias humanas diferenciadas pueden tener una variedad de morfologías, pero generalmente consisten en células más grandes y más dispersas.

La diferenciación puede ocurrir dentro de una colonia o entre colonias. Estas son las diferentes morfologías de los cultivos de ES humanas que se pueden ver a bajo aumento bajo el microscopio. Una buena morfología de células y colonias se ve así.

Las células son muy pequeñas, están muy compactas y crecen en una monocapa. Las colonias deben tener bordes limpios y definidos con poca o ninguna diferenciación. Para mantener cultivos de ESL humanos sanos, las células deben pasar en el momento óptimo.

Las colonias que están listas para el empaquetamiento casi han alcanzado su tamaño máximo de colonia, pero no han comenzado a fusionarse ni a diferenciarse. No espere hasta que las colonias estén demasiado cubiertas para pasarlas. Acabamos de mostrarle cómo mantener cultivos de células HES saludables al seguir estos procedimientos.

Asegúrese de mantener una buena técnica estéril y mantenga siempre una copia de seguridad. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.