Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

Hola, mi nombre es Brad Hamilton. Estoy en el departamento de investigación y desarrollo de STEM Gen. Hoy les mostraremos un procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos embrionarios de ratón.

Este procedimiento puede utilizarse tanto para generar células madre pluripotentes inducidas como para estudiar el proceso de reprogramación. Así que comencemos. Inicie sembrando fibroblastos embrionarios de ratón, o células meth, en un plato de 15 centímetros recubierto con gelatina, a una densidad de cuatro veces 10 a la quinta células por plato.

Ahora, agregue 30 mililitros de medio de crecimiento para metilcolilina e incube las células durante dos días a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono hasta que alcancen aproximadamente el 80% de confluencia. Una vez finalizado, aspire el medio e incorpore 30 mililitros de medio de crecimiento suplementado con lentivirus concentrado.

Mueva suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme del medio. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono con la transducción viral completada. Continuemos con la reprogramación inducida por doxiciclina.

Para iniciar la reprogrmación, 20 a 24 horas después de la transducción, retire las células transducidas con tripsina y centrifúguelas a 200 G durante cinco minutos. A continuación, aspire cuidadosamente el medio del botón celular y resuspenda las células en medio de crecimiento. Una vez suspendidas, siembre las células transducidas a una concentración adecuada según el tamaño del recipiente de cultivo celular que esté utilizando.

Aquí estamos utilizando 2,5 veces 10 a la quinta células por placa de 10 centímetros para experimentos de eficiencia de reprogramación y aislamiento de colonias IPS, y dos veces 10 a la cuarta células por pocillo en placas de cuatro pocillos para experimentos de inmunoquímica. Para monitorear la eficiencia de transducción, incubar las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. En esta etapa, las células pueden congelarse en nitrógeno líquido para análisis futuros si es necesario.

Al día siguiente, aspire el medio y reemplácelo con medio de crecimiento fresco suplementado con doxiciclina hasta una concentración final de dos microgramos por mililitro. Incluimos un control negativo que contiene medio sin doxiciclina. Finalmente, incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Hemos iniciado el proceso de reprogramación. En general, las colonias de células madre pluripotentes tendrán un tamaño suficiente para su aislamiento después de 16 a 22 días.

Antes de demostrar ese procedimiento, necesitamos primero verificar la eficiencia de transducción utilizando química para determinar dicha eficiencia. Se realiza una prueba de inmunoquímica en las células replatadas en placas de cuatro pocillos 48 horas después de la inducción con doxiciclina. Todos los volúmenes indicados en este protocolo deben ajustarse según el tamaño de la placa de cultivo celular; comience por lavar suavemente las células.

Una vez con PBS que no contenga iones de magnesio ni calcio, fije las células con 500 microlitros de paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 minutos. A temperatura ambiente, lave las células nuevamente suavemente dos veces con PBS. A continuación, permeabilice las células añadiendo 500 microlitros de Tween 20 al 0,2% frío en PBS e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Después de lavar las células dos veces más, agregue 200 microlitros de tampón bloqueador durante una hora a temperatura ambiente para bloquear la unión inespecífica de anticuerpos. A continuación, agregue 200 microlitros del anticuerpo primario deseado.

Aquí estamos utilizando los marcadores de pluripotencia T 4K LF cuatro, SOX dos y cmic. Incube las células durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Después de lavar las células suavemente dos veces con PBS, incúbelas con 200 microlitros de anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente, protegiendo las placas de la luz.

Aquí estamos utilizando los anticuerpos secundarios adecuados conjugados con fluorocromos para la visualización, mediante un microscopio fluorescente invertido tras la incubación. Lave las células dos veces más y luego agregue DPI e incube nuevamente durante 10 minutos para visualizar los núcleos. Finalmente, tras un último lavado, agregue montaje con antifa azul antes de imaginar las células con el microscopio fluorescente invertido para determinar la eficiencia de transducción.

Comience el aislamiento y la expansión de células madre pluripotentes. Después de iniciar el proceso de reprogramación, supervise los cultivos todos los días y cambie el medio apropiado cada 48 horas. Utilizamos medio suplementado con doxiciclina para cultivar las células durante los primeros 12 días y posteriormente eliminamos la doxiciclina del medio.

Las colonias de células madre pluripotentes inducidas o IPS seleccionadas manualmente para su expansión contienen doxiciclina. Las células independientes deben monitorearse diariamente en busca de cambios morfológicos indicativos del proceso de reprogramación. Cada experimento será diferente, pero generalmente las colonias tienen un tamaño suficiente para su aislamiento entre los 16 y 22 días posteriores a la inducción con DS, el día anterior al inicio del proceso de aislamiento y tripsinización de las colonias reprogramadas.

Prepare una placa de 24 pocillos sembrando una capa alimentadora de mets irradiados con rayos gamma a una densidad de cinco por 10 a la cuarta células por pocillo. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, seleccione manualmente cada colonia de IPS y tripsinice para disociar los agregados celulares; replique las células de IPS en medio para células madre embrionarias de ratón en los pocillos individuales de la placa de 24 pocillos preparada previamente e incube las células a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.

Cambie el medio cada 24 horas. Monitoree diariamente las colonias IPS para observar el crecimiento y la fluorescencia de GFP. Incubamos nuestros cultivos durante seis días antes de envasarlos en placas de cuatro pocillos para el análisis de pluripotencia.

Determine qué pocillos de la placa de 24 pocillos expresan GFP de manera uniforme; los pocillos que presenten buena expresión de GFP pueden ser triplicados, inizados y pasajeados uno a ocho en placas de cuatro pocillos que hayan sido previamente preparadas con capas alimentadoras de mes irradiadas con gamma. Estas placas pueden utilizarse entonces para análisis de ICC de pluripotencia para iniciar el análisis de pluripotencia. Lave suavemente las células dos veces con PBS que no contenga iones de magnesio ni calcio.

Añada 0,5 mililitros por pocillo de PBS frío con hielo que contenga 0,2 % entre 20 y 20 en PBS e incube las células durante 10 minutos. Después de tres lavados adicionales en PBS, bloquee la unión no específica con 200 microlitros de tampón bloqueante durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, añada 200 microlitros del anticuerpo primario deseado.

Aquí utilizamos SSEA uno, nanog y OCT cuatro para incubar las células durante la noche a cuatro grados Celsius. Después de lavar las células suavemente dos veces, incubarlas con 200 microlitros de anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente, manteniéndolas alejadas de la luz. Aquí estamos utilizando los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con fluoro force para la visualización, usando un microscopio fluorescente invertido; tras otros dos lavados, agregar DPI e incubar las células durante 10 minutos.

Ahora, tras un lavado final, agregue antifa aqua mount antes de observar las células con el microscopio fluorescente invertido. Las colonias de IPS también se pueden analizar para detectar actividad de fosfatasa alcalina utilizando kits disponibles comercialmente. El conjunto de lentivirus inducible de ratón stem gent docs se puede utilizar para reprogramar MES a células IPS tras la transducción de la expresión de factores de transcripción en MES.

T cuatro, SOX dos, KLF cuatro y seic pueden detectarse en células tratadas con doxiciclina, pero se puede detectar poca o ninguna expresión en células no tratadas. Los cambios morfológicos progresarán con el tiempo para generar colonias más grandes, similares a células ES, con bordes de colonia definidos y crecimiento tridimensional. Cuando se elimina docs, se observa una reversión notable de la morfología celular en algunas colonias similares a células ES.

Sin embargo, muchas de las colonias mantuvieron su morfología de IPS. Estas colonias de IPS, cuando se seleccionan y se pasan, muestran expresión típica de marcadores de pluripotencia como fosfatasa alcalina, Nanog, Oct4 y SSEA-1.

El tipo de células metiladas utilizadas en este experimento expresaba GFP a partir del locus endógeno nag. Cuando se reprograman al estado de pluripotencia, la expresión de GFP puede utilizarse por lo tanto como un indicador preliminar de una reprogramación exitosa. Acabamos de mostrarle cómo inducir la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón para generar células madre pluripotentes utilizando un sistema antiviral inducible por doxiciclina con cuatro factores de transcripción.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que al diseñar experimentos de reprogramación, se deben considerar varias variables para optimizar la eficiencia del proceso. En primer lugar, es posible modificar la relación entre el virus activo y el número de células durante el paso de infección primaria para aumentar o disminuir la eficiencia de transducción, afectando así la cantidad de virus integrados en la población celular diana. En segundo lugar, ajustar el tiempo de exposición de las células a los docs puede influir en el número de colonias IPS generadas.

En tercer lugar, la capacidad proliferativa de las células diana puede afectar la reprogramación, ya que las células que se encuentran activamente en crecimiento y división son más susceptibles a la reprogramación. Por último, al modificar el protocolo para diferentes números de células o placas de cultivo celular de distinto tamaño, se recomienda ajustar proporcionalmente el número de células diana al área superficial de la placa de cultivo. Eso es todo.

Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.