Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

Hola, mi nombre es Brad Hamilton. Estoy en el departamento de investigación y desarrollo aquí en STEM Gen. Hoy les mostraremos un procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos embrionarios de ratón.

Este procedimiento se puede utilizar tanto para generar células madre pluripotentes inducidas como para estudiar el proceso de reprogramación. Así que comencemos. Comience sembrando fibroblastos embrionarios de ratón o células de metanfetamina en un plato recubierto de gelatina de 15 centímetros a una densidad de cuatro veces 10 de las quintas células por plato.

Ahora agregue 30 mililitros de medio de crecimiento de metanfetamina e incube las células durante dos días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que estén aproximadamente 80% confluentes. Al terminar, la incubación aspira el medio y agrega 30 mililitros de crecimiento. Medio suplementado con lentivirus concentrado.

Agite el plato suavemente para asegurar una distribución uniforme del medio. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con la transducción viral completa. Pasemos a la reprogramación inducida por doxiciclina.

Para comenzar la reprogramación de 20 a 24 horas después de la transducción, la tripsina es las células transducidas y centrifugarlas a 200 Gs durante cinco minutos. A continuación, aspire con cuidado el medio fuera del gránulo de la célula y vuelva a suspender las células en el medio de crecimiento. Una vez suspendida la semilla, se transduce el mes a una concentración adecuada para el tamaño de la placa de cultivo celular que se está utilizando.

Aquí estamos usando 2.5 veces 10 a la quinta celda por plato de 10 centímetros para experimentos de eficiencia de reprogramación y aislamiento de colonias IPS y dos veces 10 a la cuarta celda por pocillo en placas de cuatro pocillos para experimentos de inmunoquímica. Para controlar la eficiencia de la transducción, incube las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. En esta etapa, las células se pueden congelar en nitrógeno líquido para futuros análisis si es necesario.

Al día siguiente, aspire el medio y reemplácelo con un medio de crecimiento fresco que haya sido suplementado con doxiciclina hasta una concentración final de dos microgramos por mililitro. Incluimos un control negativo que contiene medio sin doxiciclina. Finalmente incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Hemos iniciado el proceso de reprogramación. En general. Las colonias de células madre pluripotentes serán lo suficientemente grandes como para aislarlas después de 16 a 22 días.

Antes de demostrar ese procedimiento, primero debemos verificar la eficiencia de la transducción utilizando la química para determinar la eficiencia de la transducción. Las pruebas de inmunoquímica se llevan a cabo en las células reinsertadas en placas de cuatro pocillos 48 horas después de la inducción de la doxiciclina. Todos los volúmenes enumerados en este protocolo deben ajustarse de acuerdo con el tamaño de la placa de cultivo celular, comenzando por lavar las células suavemente.

Una vez con PBS que no contiene iones de magnesio o calcio, fije las células con 500 microlitros de aldehído paraformado al 4% en PBS durante 15 minutos. A temperatura ambiente, vuelva a lavar las células suavemente dos veces con PBS. A continuación, perme las células añadiendo 500 microlitros de hielo frío 0,2%Tween 20 en PBS incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Después de lavar las celdas dos veces más. Añadir 200 microlitros de tampón bloqueante durante una hora a temperatura ambiente para bloquear la unión de anticuerpos no específicos. Ahora agregue 200 microlitros del anticuerpo primario deseado.

Aquí estamos usando los marcadores de pluripotencia T 4K LF four, SOX dos y cmic. Incubar las células durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente. Después de lavar las células suavemente dos veces con PBS, incubarlas con 200 microlitros de anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente, protegiendo las placas de la luz.

En este caso, utilizamos los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con fluoro cuatro para la visualización, utilizando un microscopio fluorescente invertido después de la incubación. Lave las células dos veces más y luego agregue DPI y vuelva a incubar durante 10 minutos para visualizar los núcleos. Finalmente, después de un último lavado, agregue la montura antifa aqua antes de obtener imágenes de las células con el microscopio fluorescente invertido para determinar la eficiencia de la transducción.

Comienza el aislamiento y la expansión de las células madre pluripotentes. Después de iniciar el proceso de reprogramación, monitoree los cultivos todos los días y reemplace el medio apropiado cada 48 horas. Utilizamos un medio suplementado con doxiciclina para cultivar las células durante los primeros 12 días y luego eliminamos la doxiciclina del medio.

Las células madre pluripotentes inducidas o colonias IPS seleccionadas manualmente para la expansión son la doxiciclina. Las células independientes deben ser monitoreadas diariamente para detectar cambios morfológicos indicativos del proceso de reprogramación. Cada experimento será diferente, pero las colonias son generalmente lo suficientemente grandes como para aislarlas entre 16 y 22 días después de la inducción de la DS, el día antes de comenzar el proceso de aislamiento y las colonias reprogramadas con tripsina.

Prepare una placa de 24 pocillos sembrando con una capa alimentadora de mets irradiada con rayos gamma a una densidad de cinco veces 10 a la cuarta celda por pocillo. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, elija manualmente cada colonia de IPS y la triplice para disociar los agregados celulares, repl las células IPS en medio de células madre embrionarias de ratón en los pocillos individuales de la placa de 24 pocillos anterior, incube las celdas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Cambiar los medios cada 24 horas. Monitoree las colonias de IPS diariamente para determinar el crecimiento y la fluorescencia de GFP. Incubamos nuestros cultivos durante seis días antes de empaquetarlos en placas de cuatro pocillos para el análisis de pluripotencia.

Determine qué pocillos de la placa de 24 ruedas expresan uniformemente GFP Los pocillos que tienen una buena expresión de GFP pueden ser tripps, inizados y pasados del uno al ocho en placas de cuatro pocillos que han sido precedidas con capas alimentadoras de mes irradiadas con rayos gamma. Estas placas se pueden utilizar para el análisis ICC de pluripotencia para comenzar el análisis de pluripotencia. Lave suavemente las células dos veces con PBS que no contenga iones de magnesio o calcio.

Añadir 0,5 mililitros por pocillo de 0,2% helado entre 20 en PBS e incubar las células durante 10 minutos. Después de tres lavados más en bloque PBS, unión inespecífica con 200 microlitros de tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Ahora agregue 200 microlitros del anticuerpo primario deseado.

Aquí utilizamos SSEA un nanog y OCT cuatro incubamos las células durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de lavar las células suavemente dos veces, incubarlas con 200 microlitros de anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente, manteniéndolas alejadas de la luz. Aquí estamos utilizando los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con fuerza fluorada para la visualización, utilizando un microscopio fluorescente invertido después de otros dos lavados, añadimos DPI e incubamos las células durante 10 minutos.

Ahora, después de un lavado final, agregue la montura antifa aqua antes de obtener imágenes de las células con el microscopio fluorescente invertido. Las colonias de IPS también se pueden analizar para determinar la actividad de la fosfatasa alcalina mediante el uso de kits disponibles en el mercado. El conjunto de lentivirus TF de ratón inducible stem gent docs se puede utilizar para reprogramar MES a células IPS después de la transducción de la expresión MES de factores de transcripción.

T four, SOX two, KLF four y seic se pueden detectar en las células tratadas con doxiciclina, pero se puede detectar poca o ninguna expresión en las células no tratadas. Los cambios morfológicos progresarán con el tiempo para generar colonias más grandes y parecidas a células madre embrionarias con bordes de colonia definidos y crecimiento tridimensional. Cuando se elimina docs, hay una reversión notable de la morfología celular para algunas colonias similares a células ES.

Sin embargo, muchas de las colonias mantuvieron su morfología IPS. Estas colonias IPS cuando se recogen y pasan se muestran. Expresión típica de marcadores de pluripotencia de fosfatasa alcalina, nano T cuatro y SSEA uno.

El tipo de células de metanfetamina utilizadas en este experimento expresó GFP del locus nag endógeno. Por lo tanto, cuando se reprograma al estado de pluripotencia, la expresión GFP se puede utilizar como un indicador preliminar para una reprogramación exitosa. Acabamos de mostrarle cómo inducir la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón para inducir células madre pluripotentes utilizando un sistema antiviral inducible por doxiciclina de cuatro factores de transcripción.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que al diseñar experimentos de reprogramación, se deben considerar varias variables para optimizar la eficiencia de la reprogramación. En primer lugar, es posible modificar la proporción entre el virus activo y la célula objetivo durante la etapa de infección primaria para aumentar o disminuir la eficiencia de la transducción, afectando así al número de virus integrados en la población de células objetivo. En segundo lugar, ajustar la cantidad de tiempo que las células están expuestas a los docs puede afectar el número de colonias de IPS generadas.

En tercer lugar, la capacidad proliferativa de las células diana puede afectar a la reprogramación, ya que las células que están creciendo y dividiéndose activamente son más susceptibles a la reprogramación. Por último, al modificar el protocolo para diferentes números de células o placas de cultivo de tejidos de diferentes tamaños, se recomienda que los números de células objetivo se ajusten proporcionalmente al área de superficie de la placa de cultivo. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.