De alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana Utilizando el Método lipídico Bicelle

Este video demostrará un método para establecer ensayos de cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana purificadas utilizando células B lipídicas. En primer lugar, las células B se preparan mezclando un lípido y un detergente, se incorpora una proteína de membrana purificada a la mezcla de células B y se realizan pruebas de cristalización mediante una inspección visual de un robot de nanolitros. El uso de un microscopio óptico estándar revela la presencia de cristales.

Una vez formados, los cristales de proteína se pueden extraer y congelar para la recopilación de datos y la determinación estructurada. La principal ventaja de esta técnica es que, debido al comportamiento de fase único de las células B, se pueden utilizar equipos estándar y robótica disponibles en el laboratorio para la cristalización. La configuración de células B es una técnica muy simple y le permite sacar su proteína de membrana objetivo del detergente de mi celda y colocarla en un medio lípico.

Esto le da un conjunto completamente nuevo de condiciones para filtrar. Es un método tan simple que se ha utilizado con éxito en muchas proteínas de membrana que simplemente no hay razón para no probarlo. El primer paso en la cristalización basada en células B es la preparación de una mezcla de anfis lipídicos formadora de células B.

Este proceso requiere un esfuerzo considerable y es el que más tiempo consume. Tenga en cuenta que puede tardar varias horas en completarse. Las células B pueden formarse en una variedad de combinaciones de anfis lipídicos y en una amplia gama de concentraciones.

Para los puntos de partida sugeridos, consulte la tabla uno en el protocolo escrito adjunto, comience preparando un mililitro de mezcla de capso de DMPC al 35% en una proporción de 2,8 a un molar. Para ello, pesa 0,26 gramos de DMPC y 0,09 gramos de Chapo en un tubo. Lleve el volumen hasta 1.0 mililitros usando agua desionizada en vórtice de la mezcla.

A continuación, caliente la mezcla a unos 40 grados centígrados en un baño de agua hasta que se vuelva gelatinosa a partir de entonces. Coloque el tubo sobre hielo. La muestra debe volver a ser fluida.

A continuación, vuelva a vórtice durante unos minutos, continúe pasando por los pasos de calentamiento, enfriamiento y vórtice hasta que el lípido se disuelva por completo. Tenga en cuenta que a medida que se realizan más ciclos, la mezcla puede volverse turbia al enfriarse al finalizar. La mezcla será un gel transparente a temperatura ambiente o por encima de ella, y un líquido viscoso en hielo por células se puede colocar a menos 20 grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo.

A continuación, las proteínas purificadas se incorporan al medio de la célula B. Este es un proceso simple y debe realizarse el mismo día que la cristalización, que se muestra en la siguiente sección del video. Descongele la mezcla de células DMPC capso B a temperatura ambiente hasta que la fase cambie a un gel transparente.

Coloque la mezcla en hielo para licuarla y luego vórtela brevemente para restablecer una fase homogénea de células B. A partir de este momento, mantenga la mezcla de células B y la proteína purificada en hielo. Esto mantendrá la célula B en una fase líquida, lo que la hará susceptible de pipeteo.

A continuación, agregue la mezcla de células B a la proteína solubilizada del detergente purificado en una proporción de uno a cuatro, volumen a volumen. A continuación, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que la solución se vuelva clara y homogénea. Si aparecen burbujas, brevemente, gírelas hacia abajo en una centrífuga de mesa.

Incubar la mezcla en hielo durante al menos 30 minutos para promover la incorporación completa de la proteína a las células. La mezcla de proteína por célula ya está lista para los ensayos de cristalización. Los ensayos de cristalización se demostrarán utilizando un robot de cristalización de mosquitos.

Enfríe, una placa inferior en V de 96 pocillos colocándola sobre hielo. Pipetea la mezcla de proteína por célula en la placa para asegurarte de que la viscosidad de la solución sea mínima. Mantenga la mezcla de proteína por células en hielo hasta el paso final.

El robot utilizado aquí tiene cinco plataformas. Coloque la microplaca que contiene el depósito en la plataforma tres y la tapa de cristalización en la que se dispensarán las gotas en la plataforma cinco. A continuación, coloque la proteína por placa celular en la plataforma cuatro más cercana a la posición de dispensación.

Esto asegura que la proteína por mezcla celular sea la última en ser recogida por el robot y se libere inmediatamente. Usando el software para iniciar la ejecución, el robot recogerá la solución del depósito seguida de la mezcla de proteínas por células y las dispensará en la tapa como gotas para evitar el calentamiento y el aumento de la viscosidad durante la dispensación. No programe el mosquito para que mezcle el reservorio con la mezcla de proteínas por células tan pronto como se complete la carrera.

Retire la placa de proteína de célula del instrumento y colóquela en hielo. Retire la tapa del instrumento y colóquela en la placa que contiene la solución del depósito de manera que las gotas se inviertan. Incubar la placa a 20 grados centígrados.

Tenga en cuenta que también se pueden probar otras temperaturas para la formación y optimización de cristales. Las temperaturas más altas inducen la fase laminar, que tiene la ventaja de preorganizar la proteína en capas. Se pueden examinar temperaturas entre cuatro grados centígrados y 20 grados centígrados.

Las temperaturas inferiores a cuatro grados centígrados pueden hacer que los lípidos precipiten durante períodos prolongados de tiempo en el primer y tercer día, y semanalmente a partir de entonces, evalúe la apariencia y el crecimiento de los cristales utilizando un microscopio óptico estándar. Aquí se muestra una imagen de campo claro y una imagen UV de cristales en forma de aguja observados en condición de solo asalto. No se detectó fluorescencia en los cristales, lo que indica un falso positivo en esta imagen.

Un cristal en forma de varilla se formó cuando se usó diol de metilpropano como precipitante. El cristal emite fluorescencia semanalmente, lo que indica que podría ser un cristal de proteína, pero se descubrió que no era protenaz mediante difracción de rayos X. Aquí se muestra un cristal observado unas cuatro semanas después de las pruebas.

La fuerte fluorescencia bajo luz ultravioleta confirma que es un cristal de proteína. Como viste en este video. Una vez que las células B están disponibles, se pueden mezclar directamente con la proteína purificada y, a partir de este punto, la cristalización procede casi exactamente como los protocolos estándar basados en detergentes.

Otra ventaja distintiva es la capacidad de dopar las células B con lípidos específicos con fines de optimización. Realmente hay mucha versatilidad con la técnica y es tan fácil de usar que debería probarse para todos los proyectos de cristalización de proteínas de membrana.