La evaluación de dos dimensiones ensayos de cristalización de proteínas de membrana pequeña de Estudios de Biología Estructural de Cristalografía de electrones

El objetivo general de este procedimiento es identificar las condiciones de cristalización 2D más óptimas para la determinación estructurada de proteínas de membrana mediante cristalografía electrónica. Esto se logra utilizando primero un detergente compatible durante la purificación para solubilizar la proteína de la bicapa lipídica nativa. El segundo paso del procedimiento es agregar lípidos exógenos y eliminar el detergente a través de la diálisis de la mezcla de detergente lipídico proteico, lo que da como resultado cristales 2D en condiciones cuidadosamente controladas.

El tercer paso del procedimiento es flashear, congelar las muestras hasta un estado vítreo. El paso final del procedimiento es la recopilación de datos por criomielitis. En última instancia, se pueden obtener resultados que proporcionan la estructura final de la proteína a través del procesamiento computacional de imágenes de los datos.

Hola, soy del laboratorio. Entierro la Escuela de Biología en el Instituto de Tecnología de Georgia. Hola, soy Tina temida.

Vengo del Laboratorio Berry de la Facultad de Química y Bioquímica y del Laboratorio Schmidt Kray de la Facultad de Biología del Instituto de Tecnología de Georgia. Y soy Matt Johnson, del laboratorio de Ingleborg Schmidt Cry en la escuela de biología del Instituto de Tecnología de Georgia. Hoy les mostraremos un procedimiento para evaluar los ensayos de coro 2D por EM.

Utilizamos este protocolo en nuestro laboratorio para identificar y optimizar las condiciones de cristalización 2D. Para comenzar este procedimiento, se preparan muestras teñidas negativamente en microscopía electrónica de transmisión de cobre de malla 400 recubierta de carbono o rejillas TEM. Pipetear dos microlitros de la muestra de liposoma de protea bajo una rejilla TEM cubierta de carbono e incubar durante 60 segundos.

Si la muestra no se distribuye uniformemente, pásela suavemente con el lateral de la punta de la pipeta. Siguiente cuadra desde el borde con un pedazo rasgado de papel de filtro watman Número cuatro. Esto asegura una eliminación óptima del líquido sin una eliminación excesiva de liposomas proteicos y ayuda a preservar la delicada película de carbono.

Inmediatamente después de la transferencia. Aplique dos microlitros de la tinte de acetato de urinario al 1% después de 30 segundos, seque desde el borde de la rejilla. Una vez más, si la muestra contiene altas concentraciones de glicerol viscoso o sacarosa, normalmente en el rango del 10 al 20%, pueden ser útiles varios ciclos de lavado de la rejilla con un tampón libre de glicerol o sacarosa antes de la tinción negativa para permitir una tinción adecuada con la solución de tatate urinario.

Una vez que se han preparado las cuadrículas, se utiliza la microscopía electrónica para visualizar la muestra a bajo aumento para evaluar la distribución y morfología de la ocurrencia de la membrana y la calidad general de la cuadrícula. A continuación, se utiliza un gran aumento para obtener imágenes y realizar transformaciones RIA de las imágenes para identificar cristales 2D. Para comenzar la rejilla baja en el portamuestras de microscopio electrónico, para obtener una primera impresión de la distribución promedio de la membrana, use un aumento intermedio de 2000 a 10, 000 x.

Anote el grado de distribución de las membranas, su morfología y tamaño en un cuaderno de laboratorio. Grabe vistas representativas con una cámara CCD. A continuación, si es necesario, observe las muestras con bajo aumento en el rango de aproximadamente 400 a 800 x para obtener una visión general de las cuadrículas.

Esto puede proporcionar información valiosa para evaluar la preparación de la rejilla al revelar problemas con la concentración de la muestra, la protea desigual, la distribución de liposomas y la rotura parcial de la película de carbono. Identifique un área de interés de la cuadrícula con un aumento bajo o intermedio. A continuación, utilice un gran aumento para evaluar el posible orden en diferentes membranas.

Esto es fundamental en las primeras etapas de los ensayos de cristalización 2D. Con el fin de identificar liposomas de protea prometedores con áreas bien ordenadas y verificar la reproducibilidad durante experimentos posteriores para determinar la configuración óptima de alto aumento para el cribado de cristales 2D, comience con un aumento entre 50.000 y 60.000 x. Dependiendo de las dimensiones del cristal 2D y del tamaño de la celda unitaria, el ajuste de aumento alto puede reducirse hasta 30.000 o elevarse hasta 80.000.

Aquí, en una ubicación adyacente al área de interés de la imagen, desenfocamos aproximadamente menos 400 nanómetros o más si hay incertidumbre sobre si el área de interés es realmente una membrana. Inspeccione la muestra en busca de pedazos de película de carbono, MICA u otros artefactos que podrían confundirse con liposomas de protea. Observe también los bordes para discernir el plegamiento y la morfología típicos de la membrana.

A continuación, inspeccione el área de interés con una cámara CCD. Al recopilar una imagen CCD en la configuración óptima de aumento alto, es posible que la red de una proteína de membrana más pequeña o en su mayoría hidrofóbica no sea observable mediante la evaluación visual de la imagen CCD en sí. En este caso, la imagen completa se utiliza para una transformación foer en línea o ft.

Sin embargo, si la matriz ordenada es pequeña, este FT contendrá una cantidad significativa de ruido para mejorar la relación señal/ruido, reducir el tamaño de la imagen en caja, mover la caja reducida sobre la imagen y realizar un ft en vivo, ajustar la función gamma del FT en vivo para una identificación óptima de las matrices ordenadas. Un valor gamma demasiado alto puede oscurecer las manchas debido a las contribuciones de ruido, mientras que un valor excesivamente bajo evitará que se identifiquen los puntos más débiles. Anticipe que la resolución de los cristales 2D teñidos negativamente será de aproximadamente 15 angstroms a un DFO de menos 400 nanómetros.

Espere identificar de uno a tres órdenes de manchas. Fíjate en la nitidez de las manchas y de cualquier mosaico. Los cristales 2D de una pequeña proteína de membrana de 18 kilodalton tienen un tamaño de hasta varias micras.

Los puntos en el FTS, el movimiento nítido y fácilmente identificable de la caja FT en vivo muestra que la celosía es continua sin mosaico. La red de una proteína más grande con un dominio soluble más extenso se puede identificar en la pantalla pequeña de la colección de imágenes T-E-M-C-C-D y la FT son necesarias para obtener una mejor evaluación de la calidad de la red, incluidas características como el ruido de mosaico en la FT de una protea no ordenada. Los liposomas pueden confundirse con puntos débiles para determinar si las manchas se deben a pequeños cristales de proteínas 2D o al ruido.

Mueva la caja para el pie en vivo. Si las manchas desaparecen inmediatamente, son ruido, pero si se dejan inalteradas incluso en un área pequeña, es probable que haya cristales ya que los cristales lipídicos muestran una morfología y pies distintos. Estos cristales lipídicos también se pueden reconocer mediante la inspección visual de una imagen y tamaños de celdas unitarios consistentes.

La precipitación puede ocurrir en los ensayos iniciales. La inspección a gran aumento se utiliza para distinguir entre la precipitación de proteínas y los agregados de lípidos. En el caso de los agregados lipídicos, la reconstitución podría haber ocurrido realmente y los próximos experimentos solo requerirán el ajuste de los parámetros necesarios para aumentar el tamaño de la membrana y producir orden en lugar de inducir la reconstitución a 30.000 a 50.000 x.

Los bordes de estas estructuras oscuras revelan que están compuestas por membranas sin proteínas. Las muestras de precipitación en condiciones óptimas contendrán un gran porcentaje de cristales 2D. No es necesario aspirar a una apariencia homogénea de las membranas, ya que los cristales 2D más grandes y mejor ordenados se seleccionan visualmente para la recopilación de datos.

Estos tipos de muestras se reconocerán fácilmente cuando la cristalización, dichas muestras se utilicen para la recopilación de datos criogénicos EM para dar como resultado el número máximo de imágenes de alta resolución. Solo le mostraremos cómo detectar cristales 2D de pequeñas proteínas de memoria mediante TEM al realizar este procedimiento. Es importante recordar que hay que ser minucioso para no pasar por alto una condición de cristalización prometedora, ya que ya se ha invertido una cantidad significativa de tiempo y esfuerzo hasta este punto.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.