Identificación de los fenotipos de inhibición del crecimiento inducida por la expresión de tipo bacteriana efectores III en la levadura

Para comenzar este protocolo, seleccione un vector para la expresión de su efector bacteriano de interés. En levadura y cepa de levadura, el vector se transforma luego en células de levadura. A continuación, se induce la expresión del efector.

Las células inducidas se lisan para un análisis posterior por inmunotransferencia western a fin de verificar la expresión del efector. Tras confirmar la expresión del efector, las células se cultivan y se realizan diluciones seriadas de diez veces que se depositan en medios represores e inductores. Finalmente, tras dos o tres días, se analiza el crecimiento de la levadura.

Hola, soy Do Solomon del laboratorio del Dr. Guido Cesa en el Departamento de Ciencias de las Plantas de la Universidad de Tel Aviv. Hoy les mostraremos un procedimiento para la identificación de fenotipos de inhibición del crecimiento inducidos por la expresión de efectores bacterianos del tipo tres en levaduras. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la función de los efectores del tipo tres procedentes de bacterias patógenas gramnegativas y es una herramienta que nos ayuda en la identificación de los blancos de los efectores TIC.

Así que comencemos. Deben considerarse y optimizarse varios factores importantes al diseñar un sistema de levadura adecuado para la expresión de los efectores de tipo tres de interés. El primero es el promotor que impulsa la expresión de los efectores.

Dado que los efectores bacterianos del tipo tres pueden ser tóxicos para las células de levadura, se debe utilizar un promotor inducible para controlar su expresión. En este experimento usaremos el promotor GAL1. El segundo factor es el número de copias del gen del efector.

Se logran niveles altos de expresión cuando el gen efector está presente en un plásmido de dos micrones. Se obtiene una expresión intermedia utilizando un plásmido que contiene un centrómero, y se alcanza una expresión baja cuando el gen efector se integra en el genoma de levadura mediante recombinación homóloga. Un tercer factor a considerar es la etiqueta epítope utilizada para verificar la expresión proteica en casos donde no están disponibles anticuerpos contra el efector de interés.

Las etiquetas comúnmente utilizadas son la hemaglutinina M HA o la etiqueta flag, para las cuales existen anticuerpos comerciales confiables. Sugerimos utilizar solo una copia de la etiqueta para minimizar efectos deletéreos no deseados sobre la estructura y la actividad de la proteína efectora. Por último pero no menos importante, la cepa de levadura que se utilizará para la expresión debe ser trópica para el marcador seleccionable del vector de expresión.

Para cultivar células de levadura para la transformación, tome una colonia de levadura de una placa fresca e inocule tres mililitros de YPD en un tubo de polipropileno de 15 mililitros. Vortexee brevemente el tubo de cultivo y colóquelo en un agitador rotatorio para incubarlo durante la noche a 30 grados Celsius con rotación constante. A la mañana siguiente, retire el cultivo del agitador y centrifugue a 800 Gs durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, retire completamente el sobrenadante y re suspenda las células en un mililitro de tampón de suspensión Resus mezclado por vortex a velocidad máxima durante aproximadamente 10 segundos. Para cada plásmido que se transformará y una transformación control adicional, transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a un tubo microfuge. Añada cinco microlitros de ADN de esperma de salmón de cadena sencilla y de 250 a 500 nanogramos de ADN plasmídico a cada tubo, excepto al tubo control.

A continuación, agregue cuidadosamente 650 microlitros de solución de transformación a cada tubo y vortexee. Incube los tubos a 30 grados Celsius durante 30 minutos en un agitador rotatorio. Una vez finalizada la incubación, añada 70 microlitros de DMSO a cada tubo y mezcle invirtiendo los tubos de 10 a 15 veces para evitar romper las células.

No agite los tubos mediante vortex. Coloque los tubos en un baño de agua precalentado a 42 grados Celsius y incúbelos durante 15 minutos. Después de 15 minutos, retire los tubos del baño de agua y colóquelos inmediatamente en hielo durante dos minutos.

Una vez que los tubos se hayan enfriado, recoger las células mediante centrifugación y luego usar una pipeta para eliminar cuidadosamente el sobrenadante viscoso. Suspender cada precipitado en 150 microlitros de agua estéril doblemente destilada y sembrar la suspensión celular en una placa con el medio selectivo adecuado. Dejar las placas abiertas durante dos minutos y permitir que se sequen en una cabina de flujo laminar.

Después de eso, coloque las placas en un incubador a 30 grados Celsius durante dos o tres días para cultivar las células de levadura. Para preparar un extracto proteico, inocule tres mililitros del medio represor adecuado con una colonia de levadura proveniente de una placa fresca y vortexee. Al día siguiente, coloque brevemente el tubo de cultivo en un rotafusor a 30 grados Celsius.

Retire la cultivo del agitador rotatorio y centrifugue a 800 G durante cinco minutos a temperatura ambiente, deseche el sobrenadante y resuspenda el botón celular. En tres mililitros de agua destilada estéril (DDW), mezcle por vortex y centrifugue nuevamente; deseche el sobrenadante y resuspenda las células en tres mililitros de agua destilada estéril (DDW). Ahora transfiera 200 microlitros de la suspensión celular a un nuevo tubo de 15 mililitros que contenga tres mililitros del medio inductor adecuado, mezclado por vortex.

Coloque el tubo en un agitador rotatorio e incube durante la noche a 30 grados Celsius. A la mañana siguiente, transfiera un mililitro de la cultura, o más en el caso de cultivos de baja densidad, a un tubo de microcentrífuga. Recopile las células mediante centrifugación a 800 Gs durante cinco minutos a temperatura ambiente. A partir de este momento, trabaje en una campana extractora para evitar inhalar los vapores tóxicos de etanol Beamer capto.

Retire cuidadosamente el sobrenadante utilizando una pipeta y re suspenda el sedimento celular en 100 microlitros de solución de lisis fría con hielo. Mezcle vigorosamente por vortex y incube en hielo durante 30 minutos. Durante la incubación de 30 minutos, determine el volumen de ácido clorhídrico normal seis necesario para titular 100 microlitros de tampón de lisis hasta un pH de nueve a 10.

Para hacer esto, agregue diferentes volúmenes de ácido clorhídrico a 100 microlitros de tampón de lisis en 10 tubos distintos y verifique el pH de la solución utilizando una tira indicadora de pH al final de la incubación, agregue el volumen adecuado de ácido clorhídrico al lisado y mezcle mediante vortex. Luego, agregue 50 microlitros de tampón de muestra 3x al lisado y mezcle mediante vortex, haga un orificio en la tapa del tubo microfuga con una aguja y hierva la solución de lisado en un bloque calefactor durante cinco minutos. Tras la ebullición, deje enfriar la solución durante dos minutos a temperatura ambiente.

Luego, vortexar la solución del lisado y centrifugarla durante 10 segundos. El lisado ya está listo para el análisis inmunológico de sangre para preparar las células para el ensayo de spotting. Cultivar cultivos de tres mililitros de cada cepa como se indicó anteriormente al día siguiente.

Prepare dos placas que contengan medio sintético completo sin leucina. El medio de una placa debe suplementarse con 2% de glucosa y el de la otra placa con 2% de galactosa y 1% de rafinosa. Seque las placas en un flujo laminar estéril a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Recoger las células y resuspender cada pellet celular en tres mililitros de agua destilada estéril (DDW). Repetir el paso de centrifugación y resuspender nuevamente las células en tres mililitros de agua destilada estéril (DDW). Determinar la densidad óptica u OD de cada cultivo, y luego preparar suspensiones celulares de un mililitro con una OD 600 de uno en tubos microficha estériles.

A continuación, prepare tres diluciones seriadas de diez veces a partir de cada una de las suspensiones celulares utilizando tres microtubos estériles llenos con 900 microlitros de agua destilada estéril (DDW). Coloque las placas secas sobre una cuadrícula y, para cada punto de cultivo, agregue 10 microlitros de cada una de las cuatro diluciones en fila. Después de aplicar las muestras, deje las placas abiertas en la cabina durante varios minutos.

Una vez que las manchas estén secas, cubra las placas y colóquelas en un incubador a 30 grados Celsius durante dos o tres días. Ahora mostraremos los resultados de un ensayo de microdistribución con levadura para la detección de inhibición del crecimiento. Fenotipos inducidos por la expresión de efectores del tipo tres aquí, los efectores del tipo tres, A-V-R-P-T-O hop, AA uno uno y AAV RE uno de la bacteria.

La ruta de Pseudomona Riner de nuestro tomate se expresó a partir de un plásmido que contiene un centrómero en una cepa de levadura en medio represor. Las cepas de levadura que portaban el plásmido para la expresión de A-V-R-P-T-O y HOP AA uno uno mostraron un crecimiento similar al de la cepa control que contenía un vector vacío. Mientras que la levadura que portaba AAV RE uno mostró un crecimiento ligeramente reducido, probablemente debido al escape del promotor GAL uno y a la alta citotoxicidad de AV RE uno, bajo condiciones inductoras la expresión de cualquiera de los factores AV E uno o HOP AA uno uno provocó un fenotipo de inhibición del crecimiento drástico, reflejado por la ausencia de colonias en cualquier dilución. En contraste, la expresión de A-V-R-P-T-O no ejerció ningún efecto inhibitorio sobre el crecimiento.

Acabamos de mostrarle cómo identificar fenotipos de inhibición del crecimiento causados por la expresión de efectores bacterianos del tipo tres en levadura. Al realizar este procedimiento, es importante recordar elegir cuidadosamente tanto el vector de expresión como esta cepa, ya que ambos pueden afectar drásticamente los resultados. Además, recuerde utilizar colonias recién transformadas en todos los pasos del procedimiento.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.