Identificación de los fenotipos de inhibición del crecimiento inducida por la expresión de tipo bacteriana efectores III en la levadura

Para comenzar este protocolo, seleccione un vector para la expresión de su efector bacteriano favorito. En la levadura y la cepa de levadura, el vector se transforma en células de levadura. Se induce la siguiente expresión del efector.

Las células inducidas se lisan para su posterior análisis de Western blot para verificar la expresión del efector. Después de confirmar la expresión de las células efectoras, se cultivan y se diluyen en serie diez veces más en medios represivos e inductores. Finalmente, después de dos o tres días, se analiza el crecimiento de la levadura.

Hola, soy Do Solomon del laboratorio del Dr. Guido Cesa en el Departamento de Ciencias de las Plantas de la Universidad de Tel Aviv. Hoy os mostraremos un procedimiento para la identificación de fenotipos de inhibición del crecimiento inducidos por la expresión de efectores bacterianos de tipo tres en levaduras. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la función de los efectores de tipo tres de bacterias patógenas gramnegativas y es una herramienta que nos ayuda en la identificación de los objetivos TIC efectores.

Así que comencemos. Varios factores importantes deben ser considerados y optimizados al diseñar un sistema de levadura apropiado para la expresión de los efectores de tipo tres de interés. El primero es el promotor que impulsa la expresión de los efectores.

Dado que los efectores bacterianos de tipo tres pueden ser tóxicos para las células de levadura, se debe utilizar un promotor inducible para controlar su expresión. Usaremos el promotor GAL one en este experimento. El segundo factor es el número de copias del gen efector.

Se alcanzan altos niveles de expresión cuando el gen efector es transportado por un plásmido de dos micras. La expresión intermedia se obtiene mediante el uso de un centrómero que contiene plásmido, y la baja expresión se logra cuando el gen efector se integra en el genoma de la levadura por recombinación homóloga. Un tercer factor a tener en cuenta es la etiqueta epítopo utilizada para verificar la expresión de la proteína en los casos en que no se dispone de anticuerpos contra el efector de interés.

Las marcas comúnmente utilizadas son M hemaglutinina HA o bandera para las que se dispone de anticuerpos comerciales confiables. Sugerimos usar solo una copia de la etiqueta para minimizar los efectos deletéreos no deseados sobre la estructura y la actividad de la proteína efectora. Por último, pero no menos importante, la cepa de levadura que se utilizará para la expresión debe ser trópica al marcador seleccionable del vector de expresión.

Para cultivar células de levadura para la transformación, elija una colonia de levadura de un plato nuevo e inocule tres mililitros de YPD en un vórtice de tubo de polipropileno de 15 mililitros. Coloque brevemente el tubo de cultivo en un rodillo e incube durante la noche a 30 grados centígrados con rotación constante. A la mañana siguiente, retire el cultivo del rodillo y centrifugue a 800 Gs durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, retire completamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de tampón de suspensión Resus mezclado por vórtice a máxima velocidad durante unos 10 segundos. Para cada plásmido a transformar y una transformación de control adicional, transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a un tubo de microfuga. Agregue cinco microlitros de esperma de salmón de una sola hebra, ADN y de 250 a 500 nanogramos de ADN plasmático a cada tubo, excepto al tubo de control.

A continuación, con cuidado, agregue 650 microlitros de solución de transformación a cada tubo y vórtice. Incubar los tubos a 30 grados centígrados durante 30 minutos en un rodillo. Cuando se complete la incubación, agregue 70 microlitros de DMSO a cada tubo y mezcle invirtiendo los tubos de 10 a 15 veces para evitar romper las células.

No haga vórtice en los tubos. Coloque los tubos en un baño de agua pretibia a 42 grados centígrados e incube durante 15 minutos. Después de 15 minutos, retire los tubos del baño de agua e inmediatamente colóquelos en hielo durante dos minutos.

Una vez que los tubos se hayan enfriado, recoja las células por centrifugación, luego use una pipeta para eliminar con cuidado el sobrenadante viscoso. Vuelva a suspender cada pellet en 150 microlitros de agua estéril de doble destilación y extienda la suspensión celular en una placa con el medio selectivo adecuado. Deje las placas abiertas durante dos minutos y deje que se sequen en una campana de flujo laminar.

Después de eso, coloque las placas en una incubadora a 30 grados centígrados durante dos o tres días para cultivar células de levadura. Para preparar un extracto proteico, inocule tres mililitros del medio represor apropiado con la colonia de levadura de un plato fresco y un vórtice. Coloque brevemente el tubo de cultivo en un rodillo a 30 grados centígrados al día siguiente.

Retirar el cultivo del rodillo y centrifugar a 800 Gs durante cinco minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular. En tres mililitros de DDW estéril mezclados por centrífuga de vórtice, nuevamente, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en tres mililitros de DDW estéril. Ahora transfiera 200 microlitros de la suspensión celular a un nuevo tubo de 15 mililitros que contiene tres mililitros del medio inductor apropiado mezclado por vórtice.

Coloque el tubo en un rodillo e incube durante la noche a 30 grados centígrados a la mañana siguiente. Transfiera un mililitro del cultivo o más para cultivos de baja densidad a un tubo de microcentrífuga. Recolectar las células por centrifugación a 800 Gs durante cinco minutos a temperatura ambiente, a partir de aquí trabajar en una campana extractora para evitar respirar vapores tóxicos de etanol Beamer capto.

Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el pellet de celda en 100 microlitros de solución de lisis helada. Mezclar vigorosamente por vórtice e incubar en hielo durante 30 minutos. Durante la incubación de 30 minutos, determine el volumen de seis ácidos clorhídricos normales necesarios para ajustar 100 microlitros de tampón de lisis a un pH de nueve a 10.

Para hacer esto, agregue varios volúmenes de ácido clorhídrico a 100 microlitros de tampón de lisis en 10 tubos diferentes, y verifique el pH de la solución usando una tira indicadora de pH al final de la incubación con el volumen apropiado de ácido clorhídrico al lisado y mezcle por vórtice. A continuación, añada 50 microlitros de tres tampones de muestra al lisado y mezcle mediante vórtice, perfore un agujero en la tapa del tubo de microfuga con una aguja y hierva la solución de lisado en un bloque calefactor durante cinco minutos. Después de hervir, deje que la solución se enfríe durante dos minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agita la solución de lisado y gírala durante 10 segundos. El lisado ya está listo para el análisis inmunológico de sangre con el fin de preparar las células para el ensayo de manchado. Cultive cultivos de tres mililitros de cada cepa como se muestra anteriormente al día siguiente.

Prepare dos platos que contengan medio sintético completo sin leucina. El medio de una placa debe complementarse con 2% de glucosa y el de la otra placa con 2% de lactosa y 1% de rafinosa. Seque las placas en una campana de flujo laminar estéril a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Recoja las células y vuelva a suspender cada pellet celular en tres mililitros de DDW estéril. Repita el paso de centrifugación y vuelva a suspender las células en tres mililitros de DDW estéril. Determine la densidad óptica o DO de cada cultivo, y luego prepare suspensiones de células de un mililitro con un DE 600 de uno en tubos de microficha estériles.

A continuación, prepare tres diluciones en serie diez veces a partir de cada una de las suspensiones celulares utilizando tres microtubos estériles llenos de 900 microlitros de DDW estéril. Coloque las placas secas en una rejilla y para cada punto de cultivo, 10 microlitros de las cuatro diluciones seguidas. Después de manchar, deje las placas abiertas en el capó durante varios minutos.

Cuando las manchas estén secas, cubra las placas y colóquelas en una incubadora a 30 grados centígrados durante dos o tres días. Ahora mostraremos los resultados de un ensayo de detección de levaduras para la detección de inhibición del crecimiento. Fenotipos inducidos por la expresión de efectores de tipo tres aquí, los efectores de tipo tres, A-V-R-P-T-O lúpulo, AA uno y AAV RE uno de la bacteria.

La trayectoria de Pseudomona Riner de nuestro tomate se expresó a partir de un centrómero que contenía plásmido en una cepa de levadura en cepas de levadura medio represivas portadoras de plásmido para la expresión de A-V-R-P-T-O y HOP AA, una de las cuales exhibió un crecimiento similar al de la cepa control que contenía un vector vacío. Mientras que las levaduras portadoras de AAV RE one mostraron un crecimiento ligeramente reducido, probablemente debido a la fuga del promotor de GAL one y a la alta citotoxicidad de AV RE one, en condiciones inductoras la expresión de AV E one o HOP AA one causó un fenotipo drástico de inhibición del crecimiento reflejado por la falta de colonias en cualquier dilución. Por el contrario, la expresión de A-V-R-P-T-O no ejerció ningún efecto inhibidor del crecimiento.

Acabamos de mostrarte cómo identificar los fenotipos de inhibición del crecimiento causados por la expresión de efectores bacterianos de tipo tres en levaduras. Al realizar este procedimiento, es importante recordar elegir cuidadosamente el vector de expresión, así como esta cepa, ya que ambos pueden afectar drásticamente los resultados. Además, recuerde utilizar estas colonias recién transformadas en todos los pasos del procedimiento.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.