Un sistema de expresión dual basado en la complementación de GFP para evaluar el contacto célula-célula mediado por citonemas en discos imaginales de ala de Drosophila vivos

Por lo tanto, nuestra investigación se centra en comprender cómo las células ubicadas distantes en los tejidos se comunican entre sí. Estamos utilizando el disco imaginal del ala de Drosophila como sistema modelo para tratar de comprender cómo se forman las citidinas, cómo funcionan y qué papel desempeñan en el control local del crecimiento de los tejidos. Los estudios sugieren que los factores de crecimiento a menudo viajan a través de proyecciones celulares especializadas como los filópodos de señalización basados en actina, llamados citonemas, para ser entregados a las células diana.

Los citonemas son estructuras muy delgadas y frágiles que se alteran fácilmente por el protocolo de fijación. Para observarlos, debe utilizar enfoques de imágenes en vivo dedicados con proteínas marcadas con fluorescencia expresadas. Esto limita en gran medida la herramienta y los enfoques que podemos usar para investigarlos.

Identificamos una proteína quinasa llamada Slik que está involucrada en la biogénesis del citonoma. La expresión de Slik en una capa epidural en el disco imaginal del ala desencadena la formación de citonema que cruza la luz del disco y estimula la proliferación de células en la capa epitelial vecina. En el futuro, nos gustaría identificar la proteína que actúa aguas abajo de Slik para promover la formación de citonomas, identificar el ligando que se administra a través de este citonema para promover la perforación y comprender mejor la importancia fisiológica de este mecanismo en el control del crecimiento de los tejidos.

Para comenzar, corte pocillos individuales de la tira de ocho pocillos con unas tijeras y luego corte cada pocillo por la mitad. Retire el respaldo protector de un lado de cada mitad y pegue los espaciadores en el portaobjetos del microscopio, separándolos ligeramente para crear un espacio central protegido para la colocación del disco. Recoja las larvas errantes del tercer estadio del tubo de cría después del cruce genético y la incubación a 25 grados Celsius.

Bajo un microscopio de disección, transfiera las larvas a una gota de medio de imagen en vivo en una placa de Petri recubierta de silicona. Con dos pinzas de disección, comience la disección pellizcando las larvas a aproximadamente 1/3 de la longitud del cuerpo desde la parte anterior con un par de pinzas para mantenerlas firmes. Con el segundo par, pellizca el cuerpo justo detrás del primer punto y tira para separar la mitad posterior, aislando la sección anterior.

Invierta la mitad anterior agarrando ambos lados del extremo cortado con pinzas y empujando la cabeza con un segundo par, dándole la vuelta. Esto expone estructuras internas como discos imaginales, tráquea, glándulas salivales, cuerpo graso e intestino. Retire las glándulas salivales, el cuerpo graso y el intestino con fórceps, teniendo cuidado de no perturbar los troncos traqueales laterales que recubren los discos de las alas.

Con fórceps, transfiera las mitades anteriores limpias con los discos de las alas adheridas a una gota de medio de imagen en vivo limpio con ganchos colocados entre los espaciadores de portaobjetos. Para aislar los discos de las alas, disecciarlos suavemente de las finas ramas traqueales con una hoja de las pinzas de disección o un alambre fino de tungsteno montado en un portaagujas de disección. Deseche la carcasa restante.

Oriente los discos de las alas con una cuchilla de pinzas de disección o una aguja de tungsteno de modo que el lado de la membrana peripodial quede hacia arriba. Ajuste el volumen medio para que se llene ligeramente por encima del nivel del espaciador. Retire el respaldo protector superior del espaciador de imágenes y baje suavemente un cubreobjetos sobre la muestra.

Presione el cubreobjetos en los puntos de contacto del espaciador utilizando el extremo redondeado de las pinzas para asegurar una adhesión adecuada. Para proyectar las pilas de imágenes en ImageJ, seleccione Imagen, luego Pilas, seguido de Proyecto Z, y elija Intensidad máxima en el menú. En las imágenes de proyección de máxima intensidad, identifique el área de la bolsa del ala en función del patrón de plegado del disco del ala utilizando el canal de ganchos y la herramienta de selección de polígonos.

Aplique la misma selección al canal GFP y seleccione Editar seguido de Borrar exterior para eliminar el ruido fuera de la región seleccionada. Utilice el canal de ganchos en las imágenes de proyección de máxima intensidad para identificar los puntos artifactuales en las imágenes de GFP. A continuación, seleccione el área con la herramienta de selección de polígonos.

Haga clic en Editar y elija Borrar. En las imágenes de proyección de intensidad máxima limpias, seleccione Analizar, seguido de Histograma y elija Lista para obtener todos los valores de píxeles. Copie esta lista en una tabla de hoja de cálculo.

Para establecer un valor umbral, analice la señal de fondo en las muestras de control negativo y confirme este valor utilizando otras imágenes de muestra. Calcule el porcentaje de superficie positiva para GFP dividiendo el número de píxeles por encima del umbral por el número total de píxeles válidos y multiplicando el resultado por 100. Finalmente, normalice cada valor calculado después de dividirlo por la media de la condición de referencia, que se establece en uno.

En discos de tipo salvaje que carecen de ambos componentes de GFP divididos, solo se observó una autofluorescencia mínima de GFP granular cerca del centro de la bolsa del ala, y esta señal de referencia se utilizó para definir un umbral de fluorescencia. Los discos que expresaban solo GFP1-10 dividido en CD4 en la capa propia del disco mostraron niveles de fluorescencia indistinguibles de los de tipo salvaje, lo que confirma la naturaleza no fluorescente de GFP1-10 solo. La coexpresión de CD4 dividió GFP1-10 en el disco propiamente dicho y CD4spGFP11 en la membrana peripodial condujo a un aumento notable en los puntos de GFP discretos y brillantes localizados en la luz del disco, con un área positiva de fluorescencia significativamente mayor por encima del umbral que los controles.

La expresión de Slik en el disco propiamente dicho causó un fuerte aumento en la densidad de los núcleos de la membrana peripodial y un aumento dramático en la intensidad de la señal GFP en la región de la bolsa del ala, lo que sugiere que los citonemas inducidos por Slik establecen un mayor contacto con las células de la membrana peripodial.