Name: Un sistema de expresión dual basado en la complementación de GFP para evaluar el contacto célula-célula mediado por citonemas en discos imaginales de ala de Drosophila vivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprende a visualizar citonemas en discos imaginales de ala de Drosophila mediante complementación de GFP. Este protocolo permite estudiar la comunicación célula-célula en tejidos vivos y comprender la regulación del crecimiento tisular.

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El controlador de protuberancia-GAL4 se utiliza para expresar CD4-spGFP1-10 específicamente en la región de la bolsa del ala del DP (Figura 1A). El controlador PerM-LexA21 se utiliza para expresar CD4-spGFP11 específicamente en el PerM (Figura 1A). Estos dos sistemas de expresión son independientes entre sí, lo que permite la expresión simultánea y específica de diferentes transgenes en DP y PerM (Figura 1B, C).
El esquema genético básico implica el cruce de moscas para generar larvas del genotipo nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Como control negativo, dejamos fuera el transgén LexAop-CD4-spGFP11 . Otros transgenes (por ejemplo, ARN bicatenario codificante de proteínas) se pueden expresar según se desee en la capa DP (bajo el control de secuencias UAS ) o en el PerM (bajo el control del operador LexA).
Este es un protocolo de imágenes en vivo que no se puede interrumpir. La preparación del material se estima en ~ 10 min. Las disecciones no deben realizarse durante más de 20 minutos a la vez antes de la obtención de imágenes. Las imágenes tardan ~30 min y no deben durar más de ~1 h. Para múltiples afecciones o un alto número de muestras, el procedimiento debe llevarse a cabo en múltiples rondas para garantizar los mejores resultados.
1. Preparación del material
<ol>
	<li>Antes de la disección, limpie las pinzas, una placa de depresión de vidrio de 9 pocillos (u otro recipiente adecuado para recolectar y limpiar larvas) y una placa de Petri reutilizable recubierta de Sylgard (silicona) utilizada para la disección con etanol al 70%.</li>
	<li>Prepare portaobjetos de microscopio realizando un lavado con etanol al 70% y luego pegando un espaciador de imágenes al portaobjetos seco. Corte pocillos individuales de la tira de 8 pocillos con unas tijeras y córtelos por la mitad (Figura 2A). Retire el respaldo protector de un lado de cada mitad y pegue los espaciadores a la corredera, espaciados ligeramente para crear un espacio protegido en el medio donde se colocarán los discos (Figura 2B). NOTA: En nuestra experiencia, esto simplifica el montaje de la muestra, ya que el volumen preciso de medio transferido al portaobjetos es menos crítico. Cualquier pequeño exceso de volumen simplemente fluirá a través del espacio al cubrirse. Como obtenemos imágenes durante un tiempo relativamente corto (generalmente ~ 1 h), no experimentamos ningún problema con el secado medio.</li>
	<li>Descongele el medio de imágenes en vivo (medio Drosophila de Schneider sin suplementar almacenado en alícuotas congeladas de 10 ml) y manténgalo fácilmente accesible en un cubo de hielo.</li>
	<li>En un tubo de microcentrífuga de 2 ml, mezcle 1,5 ml de medio con 20 μl de 200 μg/ml de Hoechst 33342 (concentración final de 2,7 μg/ml). Mantenga el tubo en hielo. NOTA: Esta forma específica de tinte Hoechst se usa porque es altamente permeable a la membrana. PRECAUCIÓN: Se deben usar guantes al manipular Hoechst 33342. Las herramientas deben lavarse después de su uso.</li>
</ol>
2. Disección del disco del ala y preparación del deslizamiento
<ol>
	<li>Después del cruce genético y la cría a 25 ° C, recoja las larvas errantes del tercer estadio del tubo y lávelas en un medio frío de imágenes en vivo en una placa de depresión de vidrio de 9 pocillos. NOTA: Los citonemas son muy frágiles. En los siguientes pasos, se debe tener cuidado de manipular los tejidos alrededor de los discos, tratando de evitar el contacto directo entre los discos y las herramientas de disección. Preparamos tres o cuatro larvas a la vez, ya que es inevitable dañar algunos discos, y esto solo puede notarse durante los pasos de imagen.</li>
	<li>Bajo el microscopio de disección, transfiera las larvas a una gota de medio de imagen en vivo en una placa de Petri recubierta de silicona y comience a diseccionar con dos pinzas de disección. Para hacerlo, primero mantenga firme la cabeza y la parte anterior del cuerpo pellizcando las larvas con un par de fórceps a aproximadamente un tercio de la longitud del cuerpo (desde la parte anterior). Con el segundo par de fórceps, pellizque el cuerpo justo después del primer fórceps. Luego, retire la parte posterior de las larvas para aislar la "mitad" anterior.</li>
	<li>Invierta la mitad anterior asegurándola con un par de pinzas a cada lado del extremo cortado y empujando la cabeza con el otro par (como si girara un calcetín al revés), para exponer las estructuras internas, incluidos los discos imaginales, la tráquea, las glándulas salivales, el cuerpo graso y el intestino.</li>
	<li>Retire con cuidado las glándulas salivales, el cuerpo graso y el intestino, teniendo cuidado de no perturbar los troncos laterales de la tráquea, que deben recubrir y proteger los discos de las alas.</li>
	<li>Use fórceps para transferir cuidadosamente las mitades anteriores limpias con los discos de las alas adheridas a una gota de medio limpio de imágenes en vivo con Hoechst, colocada entre los espaciadores en un portaobjetos preparado (Figura 2C). Aísle los discos de las alas del resto de los tejidos diseccionándolos suavemente de las ramas finas de la tráquea que se conectan al disco, usando una hoja de las pinzas de disección o un alambre fino de tungsteno conectado a un portaagujas de disección. Deseche el resto de la carcasa.</li>
	<li>Oriente los discos con una cuchilla de las pinzas de disección o la aguja de disección de alambre de tungsteno. Debido a su forma aplanada en forma de lágrima, los discos de las alas caerán con el DP o el PerM hacia arriba. Para este protocolo, oriente todos los discos con el lado PerM hacia arriba.</li>
	<li>Ajuste el volumen del medio para llenar el pocillo por completo, ligeramente por encima del nivel del espaciador de imágenes, agregando o quitando el medio según sea necesario. Retire el respaldo protector de la parte superior de cada mitad del espaciador de imágenes y luego baje con cuidado un cubreobjetos sobre la muestra. Presione suavemente el cubreobjetos donde entra en contacto con los espaciadores de imágenes (por ejemplo, con el extremo redondeado de las pinzas de disección) para asegurarse de que el cubreobjetos se adhiera al espaciador. NOTA: El nivel medio debe estar ligeramente por encima de la altura del espaciador para evitar atrapar burbujas de aire, pero no tan alto como para generar un flujo significativo cuando se baja el cubreobjetos.</li>
</ol>
3. Imágenes
<ol>
	<li>Tome imágenes de muestras a temperatura ambiente utilizando un microscopio confocal (láser de iones de argón con una longitud de onda de 488 nm para GFP, láser UV con una longitud de onda de 350 nm para Hoechst) equipado con una lente de inmersión en aceite de 40x/1,30 NA y software de microscopía. Adquiera pilas de imágenes con un tamaño de paso de 1 μm que se extiendan desde justo por encima del nivel más alto de la PerM (donde disminuye la fluorescencia de Hoechst) hasta el lado basal de la DP, que generalmente equivale a más de 100 imágenes por pila. Adquiera pilas de imágenes repetidas para generar películas de lapso de tiempo. NOTA: Imaginamos una diapositiva durante no más de ~ 1-2 h.</li>
	<li>Para la configuración del software del microscopio, adquiera imágenes utilizando codificación de 8 bits, promedio de línea de 2, ganancia del detector generalmente entre 650 y 750 y pistas de canales separadas para reducir el sangrado de la señal. Utilice configuraciones idénticas de láser y detector para todas las condiciones, predeterminadas mediante la realización de pruebas en cada condición de antemano. NOTA: Con un aumento de 40x, nuestras imágenes tienen una resolución de 5,0386 píxeles por μm (tamaño de píxel: 0,1985 x 0,1985 μm2). En nuestra configuración, la configuración óptima del microscopio confocal incluía la mayor intensidad de láser posible (sin dañar el tejido) para capturar la mayor cantidad de señal posible, mientras que al mismo tiempo producía poca o ninguna saturación; y el ruido más bajo posible evaluado en controles negativos, logrado al reducir el desplazamiento del detector y la velocidad de adquisición (si es necesario). Por lo general, utilizamos menos del 5% de potencia láser y velocidad máxima del cabezal de escaneo ('9' en la configuración del software Zen). Una sola pila de imágenes suele tardar ~ 1 min 45 s en adquirirse, y las imágenes se toman cada 2-3 min para los análisis de lapso de tiempo.</li>
</ol>
4. Análisis de imágenes
<ol>
	<li>Pilas de proyectos utilizando la función de proyección de máxima intensidad del paquete de software ImageJ (haga clic en la imagen | Pilas | Z, seleccione Intensidad máxima en el menú).</li>
	<li>En las imágenes MIP, determine el área de la bolsa del ala en función del patrón de plegado del disco del ala (utilizando el canal de Hoechst) utilizando la selección de polígonos. Utilice la misma selección en el canal GFP con la función Borrar exterior (haga clic en Editar | Borrar exterior) para establecer cada valor de píxel exterior en 0.</li>
	<li>En las imágenes MIP, use el canal Hoechst para limpiar las imágenes GFP, eliminando específicamente cualquier mancha artefactual que aparezca en ambos canales estableciendo el valor de píxel en cuestión en 0 (haga clic en Selección de polígono, luego en Editar | borrar).</li>
	<li>En las imágenes MIP limpias, utilice la función Histograma (haga clic en Analizar | Histograma | List) para obtener y copiar la lista de todos los valores de píxeles en una tabla de una hoja de cálculo.</li>
	<li>Establezca un valor umbral basado en el análisis de la señal de fondo en controles negativos (y luego verificado en otras muestras; consulte la discusión).</li>
	<li>Calcule el porcentaje de superficie positiva para GFP utilizando la siguiente fórmula: % de superficie positiva para GFP = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68411/68411eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>Normalice los datos al final dividiendo cada valor por la media de la condición de referencia (que se establece en 1). NOTA: Píxel válido = píxel con un valor ≥ 1, ignorando efectivamente cualquier píxel eliminado cuyo valor se estableció en 0. Los valores de píxel de 0 no se producen de forma natural.</li>
	<li>Para determinar en qué parte de los discos se localiza la señal GFP reconstituida, use cortes XZ de pilas de imágenes para observar el eje apicobasal del epitelio del disco. Realice los cortes en Fiji sin interpolación y aumente la altura de la imagen en el eje Z utilizando la función Escala con interpolación bilineal para mejorar la visibilidad.</li>
</ol>

<ol><li>Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+basis+of+pattern+formation+during+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development.</a> Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).</li>
<li>Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+and+the+dispersion+of+morphogens%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytonemes and the dispersion of morphogens.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (6), 445-463 (2014).</li>
<li>Daly, C. A., Hall, E. T., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+of+cytoneme-based+morphogen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms of cytoneme-based morphogen transport.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (2), 119(2022).</li>
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<li>Hall, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme+delivery+of+Sonic+Hedgehog+from+ligand-producing+cells+requires+Myosin+10+and+a+Dispatched-BOC%2FCDON+co-receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cytoneme delivery of Sonic Hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a Dispatched-BOC/CDON co-receptor complex.</a> Elife. 10, e61432(2021).</li>
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<li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li>
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<li>Du, L., Sohr, A., Li, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+FGF+directs+cytoneme-mediated+bidirectional+contacts+to+regulate+its+tissue-specific+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored FGF directs cytoneme-mediated bidirectional contacts to regulate its tissue-specific dispersion.</a> Nat Commun. 13 (1), 3482(2022).</li>
<li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624(2014).</li>
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<li>Chen, W., Huang, H., Hatori, R., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+basal+cytonemes+take+up+Hedgehog+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Essential basal cytonemes take up Hedgehog in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144 (17), 3134-3144 (2017).</li>
<li>Huang, H., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+cytonemes+mediate+Wg+signaling+from+the+wing+imaginal+disc+and+Delta-Notch+signaling+to+the+air+sac+primordium%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myoblast cytonemes mediate Wg signaling from the wing imaginal disc and Delta-Notch signaling to the air sac primordium.</a> Elife. 4, e06114(2015).</li>
<li>Hatori, R., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+produced+by+the+Drosophila+wing+imaginal+disc+induces+distinct+responses+in+three+target+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog produced by the Drosophila wing imaginal disc induces distinct responses in three target tissues.</a> Development. 147 (22), dev195974(2020).</li>
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<li>Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+interactions+between+squamous+and+columnar+epithelia+of+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling interactions between squamous and columnar epithelia of the Drosophila wing disc.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3363-3370 (2005).</li>
<li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+superfolder+and+split+fluorescent+protein+detection+systems+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Development and applications of superfolder and split fluorescent protein detection systems in biology.</a> Int J Mol Sci. 20 (14), 3479(2019).</li>
<li>Panneton, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+catalytic+and+non-catalytic+functions+of+the+Drosophila+Ste20+kinase+Slik+by+activation+segment+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of catalytic and non-catalytic functions of the Drosophila Ste20 kinase Slik by activation segment phosphorylation.</a> J Biol Chem. 290 (34), 20960-20971 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microscopio de disección Discovery V12</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscopio de disección</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #55, Consejos de biología</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11255-20</td><td>pinzas de disección</td></tr><tr><td>EP-Slik (slik20358)</td><td>BDSC</td><td>Panneton et al. 2015&nbsp;</td><td>cepa de mosca para expresar Slik</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td>Schindelin J. et al. (2012)&nbsp;</td><td>Software de análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H3570&nbsp;</td><td>Tinción nuclear de imágenes en vivo&nbsp;</td></tr><tr><td>LexAop-CD4-spGFP11&nbsp; </td><td>BDSC</td><td>93018</td><td>Cepa de mosca</td></tr><tr><td>Microscopio confocal LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscopio confocal</td></tr><tr><td>nub-GAL4</td><td>Centro de Stock de Drosophila de Bloomington (BDSC)</td><td>86108</td><td>Cepa de mosca</td></tr><tr><td>PerM-LexA</td><td></td><td>Rambaud, Joseph et al., 2025</td><td>Cepa de mosca</td></tr><tr><td>Placa de punto de vidrio PYREX de 9 depresiónvender</td><td>Ciencias de la vida de Corning</td><td>7220-85</td><td>para recoger y lavar larvas</td></tr><tr><td>Medio Drosophila de Schneider</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21720024</td><td>medio de imagen en vivo</td></tr><tr><td>Espaciadores de imagen SecureSeal, 8 pocillos, 0,12 mm de espesor</td><td>Gracia Bio-Laboratorios</td><td>654008</td><td>espaciador</td></tr><tr><td>Kit de elastómero de silicona SYLGARD 184</td><td>Sylgard</td><td>3097358-1004</td><td>para hacer placas de disección</td></tr><tr><td>UAS-CD4-spGFP1-10&nbsp; </td><td>BDSC</td><td>93017</td><td>Cepa de mosca</td></tr><tr><td>Negro Zen</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Software de adquisición</td></tr></tbody></table>

un sistema de expresión dual basado en la complementación de gfp para evaluar el contacto célula-célula mediado por citonemas en discos imaginales de ala de drosophila vivos

A GFP Complementation-based Dual-expression System for Assessing Cell-Cell Contact Mediated by Cytonemes in Live Drosophila Wing Imaginal Discs

Para probar la utilidad del procedimiento GRASP para medir los contactos entre las células DP y PerM, examinamos discos de alas de cuatro genotipos diferentes: discos de control negativo de tipo salvaje (genotipo: w1118) que solo mostrarán niveles de fondo de autofluorescencia en el canal GFP; discos que expresan el CD4-spGFP1-10 en la capa DP, pero carecen del transgén CD4-spGFP11, que mostrará el nivel de fluorescencia producido por GFP1-10 solo (que esperábamos que fuera insignificante, ya que GFP1...

Un sistema de expresión dual basado en la complementación de GFP para evaluar el contacto célula-célula mediado por citonemas en discos imaginales de ala de Drosophila vivos

Embryonic tissue growth and patterning are largely controlled by signals exchanged locally between cell populations within the tissues themselves. ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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El estudio de puesto de control mitótico, ilustrando comportamiento dinámico de proteínas cinetocoro y el movimiento de cromosomas en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones Sincitial

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Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

Live-proyección de imagen de la Drosophila Pupal Ojo

Células de mostrar diferentes morfologías y establecen una variedad de interacciones con sus vecinos. Este protocolo describe cómo revelar la morfología de las células y para investigar la interacción célula-célula mediante el bien establecido sistema de expresión de Gal4/UAS.

Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar imágenes en vivo de la división asimétrica de las células madre de la línea germinal (GSC) en el nicho ovárico de Drosophila. Utilizamos una línea transgénica que expresa de forma ubicua una fusión de proteína verde fluorescente (GFP) de la proteína espectrosómica Par-1.

Imágenes en vivo extendidas de nichos de células madre germinales hembras de Drosophila melanogaster

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

Este artículo describe un protocolo eficiente de disección imaginaria de discos y tinción de anticuerpos que es económico con los reactivos y facilita el manejo de discos imaginarios en pequeñas cantidades.

Disección a pequeña escala y tinción por anticuerpos de discos imaginales de antenas oculares y de alas de Drosophila melanogaster

Aprende a visualizar citonemas en discos imaginales de ala de Drosophila mediante complementación de GFP. Este protocolo permite estudiar la comunicación célula-célula en tejidos vivos y comprender la regulación del crecimiento tisular.

Un sistema de expresión dual basado en la complementación de GFP para evaluar el contacto célula-célula mediado por citonemas en discos imaginales de ala de Drosophila vivos (Video) | JoVE Journal

Un sistema de expresión dual basado en la complementación de GFP para evaluar el contacto célula-célula mediado por citonemas en discos imaginales de ala de Drosophila vivos

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