Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro

La migración de linfocitos T se produce durante la localización de los órganos linfoides, la salida de la vasculatura y la entrada en los tejidos periféricos. Este proceso implica la interacción adhesiva de la superficie de la célula T con otras células. Para examinar este fenómeno, los linfocitos T humanos in vitro se aíslan, se cultivan y se colocan en placas de cultivo de tejidos recubiertas con la proteína adhesiva.

ICAM uno y quimiocina SDF uno. A continuación, se pueden adquirir y analizar imágenes de la migración de linfocitos T. Hola, soy Craig LeFort y el laboratorio de Minsu Kim en el Centro de Biología e Inmunología de Vacunas de la Universidad de Rochester.

Hoy os mostraremos un procedimiento para el aislamiento y cultivo de linfocitos adolescentes humanos, un análisis de su migración in vitro. Utilizamos este ensayo en nuestro laboratorio para estudiar el papel de las integrinas y la migración de las células T. La integrina principal en las células T es el antígeno asociado a la función de los linfocitos uno o LFA uno.

Los ligandos específicos para LFA uno son los icas, como ICAM uno. Además, se requiere una señal de parentesco para que la migración de las células T proporcione una señal de direccionalidad y active las integrinas. En nuestro ensayo, utilizamos ICAM humano uno y CX CL 12 o SDF uno como sustratos para la migración de células T.

Así que comencemos. Después de obtener sangre humana de un donante sano, deje que la sangre se enfríe a temperatura ambiente. Esto tarda unos 30 minutos.

Una vez que la sangre se enfríe, pipetee suavemente tres mililitros de medio de gradiente de densidad polimorfa a temperatura ambiente en un tubo de poliestireno de fondo redondo de ocho mililitros. Luego agregue suavemente tres mililitros de sangre entera encima. Es importante evitar cualquier mezcla.

Coloque los tubos en una centrífuga y gírela 500 G durante 45 minutos. A temperatura ambiente después de la centrifugación, las células mononucleares de sangre periférica o P BMC se han separado de los demás componentes de la sangre. La capa PBMC aparece como la primera banda nublada desde la parte superior.

En condiciones estériles, retire con cuidado y deseche la fase superior de color amarillo claro. A continuación, utilice una micropipeta P 1000 para transferir la capa de PBMC a un nuevo tubo cónico. Lave el PBMC dos veces con celdas centrífugas PBS a 500 G durante cinco minutos.

Cada vez el sobrenadante estará algo turbio después de cada lavado. Vuelva a suspender las células en 20 mililitros de medios RPMI 1640 que contengan 10% de FBS, 1% de estreptomicina de penicilina y un microgramo por mililitro. La incubación de fitohemaglutinina o PHA en presencia de PHA induce la activación y expansión de los linfocitos T.

Con una pipeta, transfiera el pbmc a un matraz de cultivo T 75. A continuación, se incubó a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una a 24 horas. Este paso permite separar los monocitos que se adherirán a la superficie del matraz de los linfocitos que permanecen en suspensión.

Después de la incubación, retire con cuidado todos los medios que contienen principalmente linfocitos y transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos. Reese ha sido el pellet de la célula en RPMI 1640 y ha transferido las células a un nuevo flaz T 75 que contiene 25 mililitros de RPMI 1640 con FBS, penicilina, estreptomicina y PHA incubados a 37 grados centígrados.

Después de 24 horas de crecimiento, puede ser necesario agregar de 15 a 20 mililitros de medio fresco y transferir a un matraz T 1 75 más grande. Continúe incubando durante tres o dos días. Si la incubación inicial de PBMC fue durante la noche después de tres días, use una pipeta para eliminar el medio, que contendrá linfocitos en suspensión y transfiéralo a una centrífuga de tubo cónico de 50 mililitros a 500 G durante cinco minutos.

Reese ha sido el pellet de la célula y ha transferido las células a un nuevo T 75 que contiene 25 mililitros de RPMI 1640. Con FBS, penicilina, estreptomicina e IL humana 2 o IL 15 colocan las células en la incubadora. Si se inicia un matraz T 75, será necesario ampliar el cultivo y transferirlo a un matraz T 1 75.

Después de uno o dos días, los linfocitos crecen durante un total de cuatro a siete días. Un día antes del ensayo de migración, cubra un plato de 0,17 milímetros con fondo de vidrio con 20 microgramos por mililitro de proteína A o G en PBS e incube durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente. Lave el plato abundantemente con PBS, luego agregue ICAM one FC y SD F1 humano en solución de PBS al plato.

Incubar durante cuatro horas a temperatura ambiente para inmovilizar las moléculas. Determine la densidad de las células cultivadas utilizando un hemocitómetro. A continuación, lavar los linfocitos dos veces con PBS y volver a suspenderlos en un mililitro de L 15 medio que contenga glucosa D después de la incubación, lavar la placa recubierta con ICAM una FC y SDF una extensamente con PBS, transferir los linfocitos T en un mililitro de medio a la placa, aproximadamente de dos a cinco veces se deben usar 10 a la quinta célula por placa para lograr una densidad celular adecuada para el análisis de migración.

Para obtener imágenes de la migración celular, coloque la placa en la platina del microscopio en un entorno de temperatura controlada, como una cámara calentada a 37 grados Celsius. Abra el software NIS elements en el menú de configuración de la imagen. Elija la agrupación de dos en dos como modo para la captura de imágenes en vivo y de imágenes.

Vaya al menú de aplicaciones y elija, defina, ejecute, experimente. Elija el tiempo entre imágenes y el tiempo total. Para la secuencia de captura de imágenes, presione el botón de ejecución para comenzar la adquisición de imágenes después de la adquisición.

Los parámetros de migración, como la velocidad, la longitud de la trayectoria y el desplazamiento, se pueden cuantificar utilizando un paquete de software como Image J Auto Quant o veloc. Para generar un diagrama de telaraña, recopile las coordenadas XY para cada celda y punto de tiempo y proyéctelas en un gráfico con un punto de partida común para cada celda en el origen. Los linfocitos T que se muestran aquí se cultivaron, se colocaron en placa ICAM y SDF uno y se obtuvieron imágenes cada 10 segundos durante 30 minutos.

Esta película muestra la migración aleatoria de linfocitos T a una velocidad de aproximadamente 15 micras por minuto utilizando las coordenadas XYT para cada célula. Se eligieron 15 células al azar y se trazaron con un punto de partida común en el origen. La comparación de diagramas de telaraña proporciona una representación visual rápida de las diferencias en la migración entre diferentes condiciones experimentales.

A la izquierda se muestran gráficos para la migración de linfocitos T en condiciones de control, mientras que a la derecha se muestran gráficos para la migración de linfocitos T en presencia de un anticuerpo bloqueador anti LFA un ligando. Estos datos demuestran que los linfocitos T utilizan la integrina LFA one para migrar sobre un sustrato ICAM one. Acabamos de mostrarle cómo hacer un ensayo de migración utilizando linfocitos T humanos cultivados durante el procedimiento.

Es importante recordar que debe agregar un número adecuado de células a la placa recubierta de ICAM para simplificar el seguimiento celular y el análisis de la migración. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.