Encyclopedia of Experiments: Biology
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Placer to hunfisk og to hanfisk i en delt avlstank en nat før injektionen. Den følgende morgen skal du fjerne skillevæggen og lade fisken yngle, indtil du observerer æg i bunden af tanken. Saml æggene og vask dem med E3-medium indeholdende methylenblåt, et fungicid. Overhold æggene under et mikroskop og fjern ubefrugtede æg. Ubefrugtede æg har en klar æggeblommemembran, mens befrugtede æg har en mørk æggeblommemembran.
Opbevar 10 embryoner i en separat petriskål som uindsprøjtede kontroller.
Efter injektionen dyrkes embryonerne i E3-medium med methylenblåt ved 28 grader Celsius. Hold øje med embryonernes sundhed. Fjern eventuelle døde eller unormalt udviklende embryoner og skift mediet dagligt. I den følgende protokol vil vi bruge mikroinjektion til at levere et ribonukleoprotein eller RNP-kompleks til zebrafiskembryoner.
- Forbered først zebrafiskeemnerne til avl natten før injektioner som beskrevet i tekstprotokollen. Derefter kombinere Cas9 protein og sgRNA i en to-til-en ratio. Inkubere opløsningen ved stuetemperatur i fem minutter, mens Cas9 og sgRNA danner en ribonucleoprotein kompleks. Derefter tilsættes 0,5 mikroliter af 2,5% phenol røde opløsninger i tilstrækkeligt RNase frit vand til at opnå et endeligt volumen på fem mikroliter.
For at forberede injektionsnålen skal du bruge en mikropipette-aftrækker til at trække i en 1 mm glaskapillær. Skær derefter spidsen af den resulterende glasnål med et barberblad for at opnå en vinklet åbning. Placer nålen i en mikromanipulator fastgjort til en mikroinjektor. Ved hjælp af et let mikroskop skal du justere injektionstrykket, indtil nålen konsekvent injicerer en nanoliter opløsning i Petri-skålen.
- Før du udfører embryo mikroinjection, praksis forberede nåle og injicere kontrol embryoner ved hjælp af en farvestof-only løsning og registrere overlevelse efter 24 timers udvikling. Du bør være i stand til at opnå mere end 90% overlevelse i forhold til en uninjected kontrol.
- Vælg derefter 10 til 15 embryoner som kontrolpopulation, og placer dem i en separat mærket petriskål. Forsigtigt linje de resterende embryoner op på en stuetemperatur injektion plade. Under en dissektion mikroskop, injicere en nanoliter af opløsningen i æggeblomme sæk af hvert foster. Derefter returnere de injicerede embryoner til en mærket Petri parabol og dække dem med 1X E3 medier med methylenblåt. Placer de injicerede embryoner i en inkubator ved 28 grader Celsius i 24 timer.
