Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Placer deux poissons femelles et deux poissons mâles dans un réservoir de reproduction divisé une nuit avant l’injection. Le lendemain matin, retirez le séparateur et laissez les poissons se reproduire jusqu’à ce que vous observiez les œufs au fond du réservoir. Recueillir les œufs et les laver avec un milieu E3 contenant du bleu méthylène, un fongicide. Observez les œufs au microscope et enlevez les œufs non fertilisés. Les œufs non fertilisés ont une membrane jaune clair, tandis que les œufs fécondés ont une membrane jaune foncée.
Gardez 10 embryons dans une boîte de Pétri séparée comme témoins non injectés. À l’aide d’une pipette de transfert, alignez les embryons dans l’auge d’une plaque de microinjection à température ambiante et placez-le sous le microscope. Poussez doucement l’aiguille de microinjection à travers la chorion dans le jaune et injectez lentement un composé d’intérêt contenant un marqueur tel que le phénol rouge. Le flux cytoplasmique permet au composé de se diffuser dans les cellules embryonnaires.
Après injection, faire pousser les embryons dans le milieu E3 avec du bleu méthylène à 28 degrés Celsius. Continuer à vérifier la santé des embryons. Enlever les embryons morts ou anormalement en développement et changer le milieu tous les jours. Dans le protocole suivant, nous utiliserons la microinjection pour livrer une ribonucléoprotéine, ou complexe RNP, en embryons de poisson zèbre.
- Tout d’abord, préparer les sujets du poisson zèbre pour la reproduction la nuit avant d’effectuer des injections comme décrit dans le protocole de texte. Puis combiner la protéine Cas9 et l’ARN sgRNA dans un rapport de deux pour un. Incuber la solution à température ambiante pendant cinq minutes tandis que le Cas9 et le sgRNA forment un complexe de ribonucléoprotéines. Puis ajouter 0,5 microlitres de 2,5% de solutions rouges phénol dans suffisamment d’eau libre RNase pour atteindre un volume final de cinq microlitres.
Pour préparer l’aiguille d’injection, utilisez un tireur de micropipette pour tirer un capillaire en verre d’un millimètre. Puis coupez la pointe de l’aiguille en verre résultante à l’aide d’une lame de rasoir pour obtenir une ouverture inclinée. Placez l’aiguille dans un micromanipulateur attaché à un microinjecteur. À l’aide d’un microscope léger, ajustez la pression d’injection jusqu’à ce que l’aiguille injecte constamment un nanolitre de solution dans la boîte de Petri.
- Avant d’effectuer une microinjection embryonnaire, pratiquez la préparation d’aiguilles et l’injection d’embryons de contrôle à l’aide d’une solution de colorant seulement et enregistrez la survie après 24 heures de développement. Vous devriez être en mesure d’obtenir une survie supérieure à 90% par rapport à un contrôle non injecté.
- Ensuite, sélectionnez 10 à 15 embryons comme une population de contrôle et placez-les dans une boîte de Pétri étiquetée distincte. À l’aide d’une pipette de transfert, tapisser soigneusement les embryons restants sur une plaque d’injection à température ambiante. Sous un microscope à dissection, injecter un nanolitre de la solution dans le sac jaune de chaque embryon. Puis remettre les embryons injectés dans une boîte de Pétri étiquetée et les couvrir de 1X E3 avec du bleu méthylène. Placer les embryons injectés dans un incubateur à 28 degrés Celsius pendant 24 heures. Puis inspecter les embryons injectés pour enlever les personnes mortes ou en développement anormalement.
