Encyclopedia of Experiments: Biology
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Поместите двух самок и двух самцов рыб в разделенный резервуар для размножения за одну ночь до инъекции. На следующее утро удалите разделитель и дайте рыбе размножаться, пока вы не наблюдаете яйца в нижней части бака. Соберите яйца и вымойте их с E3 средой, содержащей метиленовый синий, фунгицид. Наблюдайте за яйцами под микроскопом и удалите неудобренные яйца.
Храните 10 эмбрионов в отдельной чашке Петри в качестве необъективного контроля. Использование переноса пипетки, выровнять эмбрионы в корыто микроинъекционной пластины при комнатной температуре и поместить его под микроскопом.
После инъекции выращиваем эмбрионы в среде E3 с метиленовым синим при 28 градусах Цельсия. Продолжайте проверять здоровье эмбрионов. Удалите любые мертвые или аномально развивающиеся эмбрионы и меняем средний ежедневно. В следующем протоколе мы будем использовать микроинъекцию для доставки рибонуклеопротеина, или комплекса RNP, в эмбрионы зебры.
- Во-первых, подготовить зебры субъектов для разведения ночью до выполнения инъекций, как описано в текстовом протоколе. Затем объединить cas9 белка и sgRNA в соотношении два к одному. Incubate раствор при комнатной температуре в течение пяти минут в то время как Cas9 и sgRNA образуют рибонуклеопротеин комплекса. Затем добавьте 0,5 микролитров 2,5% фенол красные растворы в достаточном RNase свободной воды для достижения окончательного объема из пяти микролитров.
Чтобы подготовить инъекцию иглы, используйте micropipette шкив тянуть один миллиметр стеклянный капилляр. Затем вырезать кончик результирующей стеклянной иглы с лезвием бритвы, чтобы получить угловое отверстие. Поместите иглу в микроманипулятор, прикрепленный к микроинжектору. Использование светового микроскопа, настроить давление впрыска, пока игла последовательно вводит один нанолитров раствора в чашке Петри.
- Перед выполнением микроинъекции эмбриона, практика подготовки игл и инъекционных контрольных эмбрионов с использованием раствора только для красителя и записи выживания после 24 часов развития.
- Далее выберите от 10 до 15 эмбрионов в качестве контрольной популяции и поместите их в отдельную маркированную чашку Петри. Используя переносную пипетку, аккуратно выровнив оставшиеся эмбрионы на комнатно-температурную инъекционной пластине. Под микроскопом вскрытия ввимите один нанолитер раствора в желточный мешок каждого эмбриона. Затем верните вводимые эмбрионы в помеченную чашку Петри и накройте их 1X E3 media метиленовым синим цветом.
