Preparación de muestras tumorales fijadas en formol e incluidas en parafina: un protocolo para preservar muestras de tejido y citología de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)

- Para empezar, obtenga muestras de tumores de pulmón como muestras de tejido o como muestras de citología de lavados bronquiales, un lavado salino que contiene células del interior de las vías respiratorias. Para preparar muestras de tejido, transfiera el tejido pulmonar recién diseccionado a un casete de inclusión. Fijar y conservar el tejido con la concentración adecuada de formol.

Para preparar las muestras de citología, primero se deben tratar los lavados bronquiales con DL-ditiothreitol para su homogeneización. Centrifugar y eliminar el sobrenadante. A continuación, tratar con una solución mucolítica para licuar la mucosidad y separar las células. Centrífuga para peletizar las células y fijarlas con formalina. Trate las células con un reactivo de preparación de bloques celulares adecuado para concentrar la muestra mientras trabaja con pequeños volúmenes de gránulos.

Transfiera el pellet a un casete de inclusión. Procese ambos tipos de muestras deshidratándolas a través de una serie de baños de alcohol graduados. Elimine el alcohol con un agente limpiador adecuado, seguido de una infiltración de cera. Incruste el casete en cera de parafina líquida y deje que se solidifique. Esto forma una capa alrededor del tejido, manteniendo la muestra en su lugar.

Use un micrótomo para obtener secciones en rodajas finas. Coloque las secciones en portaobjetos de vidrio cargados positivamente para facilitar la adhesión. Secar y teñir para observar los portaobjetos bajo un microscopio. En el siguiente protocolo, demostramos técnicas de preparación de muestras a partir de tejido tumoral de pulmón y muestras de citología.

Para comenzar, fije el tejido tumoral en formol tamponado neutro al 10% en un casete e incruste el casete en parafina como se describe en el protocolo de texto. Incrusta el tejido infiltrado dentro de un molde que esté lleno de parafina fundida. Deja que los pañuelos permanezcan en el molde hasta que la parafina se haya solidificado. Después de esto, use un micrótomo para seccionar el tejido incrustado en parafina con un grosor de tres micrómetros.

Transfiera la cinta de parafina a un portaobjetos de microscopio de vidrio cargado positivamente. A continuación, seca el portaobjetos durante una hora a 37 grados centígrados. En primer lugar, recoja los lavados bronquiales en una solución conservante. Transfiera los lavados a un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue dos gramos de DL-ditiothreitol y agite el tubo durante 30 minutos. A continuación, centrifugar a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Retirar el sobrenadante y añadir 10 mililitros de una solución mucolítica. Agitar la muestra a velocidad media durante 20 minutos y centrifugar a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de esto, retire el sobrenadante y deposite el pellet de celda en un tubo de recolección que contenga un 10% de formalina tamponada neutra.

Agregue cuatro gotas de un agente de preparación de bloques de celdas. Transfiera el pellet de celda a un casete. Fije el pellet de células para la inclusión y sección de parafina utilizando el proceso descrito anteriormente para la preparación de muestras de tejido tumoral.