Visualización de la expresión de proteínas basada en CUBIC: un procedimiento para visualizar la expresión de proteínas en biopsias de piel de ratón de espesor completo

- La piel es un órgano complejo que consta de diversas poblaciones celulares dispuestas en múltiples capas. CUBIC, una técnica de imagen tridimensional basada en la limpieza de tejidos, ayuda a visualizar los patrones de expresión de proteínas dentro de estas células de la piel mediante biopsias de piel completa. Comience tomando un ratón sacrificado y quitándole el pelo de la región dorsal del cuello. Extrae un trozo de piel y córtalo en trozos pequeños.

Sumerja las piezas en una solución de limpieza CUBIC1 e incube. Las células de la piel no son transparentes, debido a la presencia de cromóforos y lípidos que causan la dispersión de la luz. Los productos químicos de la solución CUBIC eliminan estas moléculas, reduciendo así la dispersión de la luz y haciendo que el tejido sea transparente.

A continuación, trate el tejido con los anticuerpos primarios deseados que se unen específicamente a sus proteínas intracelulares diana expresadas en las células de la piel. Además, trate con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia que se unen a los complejos proteína-anticuerpo primario. Contratiñe el tejido con un tinte de unión al ADN que tiñe el núcleo.

Por último, sumerja la muestra en una solución CUBIC2. La solución reduce aún más la dispersión de la luz dentro del tejido, haciéndolo más transparente para la obtención de imágenes. Observe bajo un microscopio confocal para visualizar las regiones de interés marcadas con fluorescencia en la muestra tridimensional. El siguiente protocolo permite la visualización de la expresión de marcadores de proliferación de queratinocitos en biopsias de piel de montaje completo utilizando el protocolo CUBIC.

- Comience usando recortadoras para afeitar el pelo del cuello de un ratón sacrificado, teniendo cuidado de no herir la piel. Luego, descontamine la piel con etanol al 70% en PBS. A continuación, levante la piel del cuello dorsal con pinzas y use unas tijeras para quitar un área de aproximadamente 1,5 por 4 centímetros de piel de ratón dorsal. Luego, aplana la piel, con la dermis hacia abajo, en un pedazo de papel de filtro, tomando nota de la orientación antero-posterior de la muestra y recorta el papel alrededor de la piel disecada.

- Para obtener imágenes óptimas, las muestras de piel deben permanecer planas con una orientación constante del folículo piloso. Para mantener las muestras en una posición antero-posterior adecuada, fijamos las piezas de piel en papel de filtro en biopsias rectangulares.

- Transfiera las muestras a un tubo de 15 mililitros lleno de PFA al 4% recién preparado en PBS. Luego, cuando se hayan fijado firmemente al papel de filtro, transfiera las muestras a un nuevo tubo de PBS de 15 mililitros para dos lavados de 5 minutos.

Para limpiar las biopsias de piel después del segundo lavado, use una cuchilla de afeitar afilada para cortar los tejidos en trozos de aproximadamente 0,2 por 0,5 centímetros, teniendo cuidado de que los lados más largos de las muestras se corten a lo largo de la dirección anteroposterior de las muestras.

- Cortar el lado más largo de la biopsia paralelo a la orientación de los folículos pilosos también ayuda a evitar daños extensos en los folículos pilosos.

- A continuación, sumerja las biopsias en 5 mililitros de solución de aclarado CUBIC1 recién preparada en un nuevo tubo de 15 mililitros y coloque el tubo en una plataforma giratoria en un horno de hibridación a 37 grados centígrados. Una vez que las piezas de tejido estén transparentes, lavar las biopsias en 4 mililitros de PBS durante cuatro lavados de 6 horas a 37 grados Celsius seguidos de un lavado de 4 horas a 37 grados Celsius con un 20% de peso por volumen de sacarosa en PBS.

Al final de la incubación, congele cada muestra en un compuesto a temperatura de corte óptima en tubos individuales de 15 mililitros durante la noche a menos 80 grados centígrados para aumentar la permeabilidad de los tejidos a la penetración de anticuerpos.

A la mañana siguiente, tiñe las muestras de piel con los anticuerpos apropiados y los tintes vitales de interés. A continuación, incubar las muestras en 1 mililitro de solución de aclarado CUBIC2 recién preparada en tubos de 2 mililitros en un agitador durante 24 horas en el horno a 37 grados centígrados para igualar el índice de refracción de los tejidos.

Cuando los tejidos estén limpios, coloque las biopsias a lo largo del lado más largo de los cubreobjetos de vidrio individuales, de modo que la dirección del crecimiento del folículo piloso sea paralela a la superficie del cubreobjetos. Coloque una gota de solución CUBIC2 sobre el pañuelo. Coloque dos tiras de tachuela azul de 1 milímetro por 2 centímetros en un cubreobjetos. Luego, cubra la biopsia con un segundo portaobjetos.

A continuación, coloque la cámara de imágenes en una platina de microscopio confocal y mueva el tejido hacia la vía de luz. Utilizando la fuente de luz adecuada y los filtros de epifluorescencia estándar, escanee la muestra para identificar las regiones de interés teñidas con fluorescencia. A continuación, adquiera imágenes confocales fluorescentes de las regiones de interés.