Electroporación de una sola célula en cultivos organotípicos de cortes de cerebro: una técnica in vitro para administrar plásmidos dentro de neuronas específicas en cortes de hipocampo cerebral

Comience la electroporación tomando una pipeta de vidrio que contenga la solución plásmida deseada. Conéctelo a un soporte de micropipeta equipado con un electrodo de alambre plateado, asegurándose de que el electrodo esté insertado en la micropipeta. Tome una cámara de electroporación que contiene una sección ultradelgada del hipocampo sumergida en líquido cefalorraquídeo artificial.

Sumerja el electrodo de tierra en el fluido presente en la cámara para su posterior electroporación. Baje la punta de la pipeta a la cámara de electroporación y registre la resistencia de referencia. Utilice un microscopio para colocar la punta de la pipeta cerca de la célula diana. Una vez que la pipeta está en contacto con la membrana neuronal, su resistencia aumenta bruscamente.

Aplique presión de aire positiva para crear una pequeña invaginación en la membrana neuronal. Aplique rápidamente una succión suave para empujar la membrana hacia arriba, creando un sello suelto entre la punta de la pipeta y la membrana. Repita este proceso unas cuantas veces más para acondicionar la membrana y evitar la lisis celular.

Después del acondicionamiento, aplique una succión fuerte para formar un sello hermético con una membrana llamada sello de gigaohmio. Use pulsos eléctricos para formar poros transitorios en el área sellada de la membrana. Estas aberturas facilitan la entrada de plásmidos dentro de la neurona objetivo. Después de la electroporación, los poros se vuelven a sellar, atrapando plásmidos dentro de la neurona.

Para preparar cultivos en rodajas para la electroporación, transfiera los insertos de cultivo de interés a placas de Petri individuales de 3 centímetros cargadas con 900 microlitros de medio de cultivo y coloque los cultivos en una incubadora de dióxido de carbono de mesa. A continuación, preincube los insertos de cultivo frescos con 1 mililitro de medio de cultivo en rodajas por inserto en una placa de Petri de 3,5 centímetros durante al menos 30 minutos, y esterilice las líneas del equipo de electroporación con lejía al 10% durante 5 minutos.

Al final de la perfusión, enjuague las vías con el agua ionizada esterilizada en autoclave durante al menos 30 minutos antes de perfundir con aCSF esterilizado por filtro que contenga 0,001 milimolar de tetrodotoxina. Ajuste el pulso del electroporador a una amplitud de menos 5 voltios, un pulso cuadrado, un tren de 500 milisegundos, una frecuencia de 50 hercios y un ancho de pulso de 500 microsegundos. Llene una pipeta de vidrio con 5 microlitros de solución interna que contenga plásmidos y golpee suavemente la punta varias veces para eliminar las burbujas atrapadas.

Utilice un microscopio de disección para confirmar que la punta no está dañada y fije firmemente la punta de la pipeta al electrodo. Cuando la punta entre en contacto con el aCSF, registre la lectura de resistencia de la pipeta del electroporador. Para aislar un cultivo en rodajas, corte la membrana del inserto de cultivo con una cuchilla afilada y use pinzas en ángulo agudo para transferir cuidadosamente el cultivo en rodajas a la cámara de electroporación. A continuación, fije la posición de la referencia cultural con un anclaje de sector.

Para la electroporación de las células de interés, aplique presión positiva a la pipeta por boca y utilice los controles de perilla tridimensionales para maniobrar la punta de la pipeta cerca de la superficie del cultivo de corte. Al ver el cultivo con el microscopio, acérquese a la célula diana con la punta, manteniendo la presión positiva aplicada hasta que se forme un hoyuelo en la superficie celular. Tras la visualización del hoyuelo, aplique rápidamente una presión negativa suave por la boca para que se forme un sello suelto entre la punta de la pipeta y la membrana plasmática.

La membrana entrará ligeramente en la pipeta. Se debe observar un aumento de aproximadamente 2,5 veces en la resistencia inicial de la pipeta, como lo indica un aumento en el tono de los altavoces. Vuelva a aplicar rápidamente la presión positiva para que el hoyuelo se reforme. Luego, complete inmediatamente al menos dos ciclos de presión más como se acaba de demostrar sin pausa. Después del último pulso de presión, mantenga la presión negativa durante 1 segundo. El tono de los altavoces alcanza un vértice estable en el tono. Use el pedal para pulsar rápidamente el electroporador.

Después de la electroporación, retraiga suavemente la pipeta aproximadamente a 100 micras de la celda sin aplicar presión y vuelva a aplicar presión positiva, verificando que la resistencia sea similar a la lectura de referencia antes de acercarse a la siguiente celda. Cuando todas las células de interés hayan sido electroporadas, transfiera el cultivo de rodajas a uno de los insertos de cultivo fresco preparados y coloque el inserto a 35 grados Celsius durante un máximo de 3 días.