La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

El objetivo general de este procedimiento es examinar la eficacia de la inmunoterapia con transferencia adoptiva de linfocitos T específicos del tumor en un modelo in vivo. Primero, esto se logra trasplantando células tumorales mediante inyección en la vena caudal lateral a los ratones, con el fin de establecer metástasis pulmonares. El segundo paso del procedimiento consiste en tratar a los ratones con tumor mediante linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos del tumor.

El paso final consiste en utilizar tinta china como medio para visualizar y cuantificar los nódulos tumorales. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren el CIE de diferentes tratamientos mediante la medición del tamaño del tumor y la cuantificación del número de nódulos tumorales. Hola, me llamo Mary Zimmerman y soy miembro del laboratorio del Dr. Kevin Lu en la Facultad de Medicina de Georgia.

Hola, mi nombre es Shelene Hu. Soy estudiante de segundo año y también trabajo en el laboratorio del Dr. Lou. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos tradicionales, como las curvas de supervivencia, es que este procedimiento es cualitativo y cuantitativo. Las implicaciones de la técnica podrían extenderse hacia la terapia contra el cáncer, ya que simula la inmunoterapia adoptiva con linfocitos T en pacientes humanos con cáncer.

Así que comencemos. El día anterior a las inyecciones de células tumorales, siembre un frasco T-75 con hasta uno por diez a la séptima de células CMS4-MET en 10 mililitros de medio RPMI que contenga 10% de suero. Para obtener células tumorales de crecimiento rápido, incube durante la noche a 37 grados Celsius el día de la inyección.

Retire el medio y lave las células una vez con PBS, luego recoga las células tumorales con tripsina-EDTA al 0,05 % a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Detenga la reacción con 10 mililitros de medio RPMI que contenga suero al 10 %. Transfiera las células a un tubo cónico.

Centrifugar las células a 1300 RPM en una centrífuga val legend RT durante tres minutos. A temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante, resuspender las células en 10 mililitros de HBSS 1X fresco para lavar. Luego centrifugar nuevamente y resuspender de la misma manera.

Contar las células tumorales en un hemocitómetro. Diluir las células en HBSS de modo que las células necesarias para cada inyección queden resuspendidas. En un volumen total de 100 microlitros, calentar los ratones B SEA de seis a ocho semanas de edad en un vaso de precipitados sumergido en agua tibia.

Para dilatar la vena de la cola, coloque el ratón en un sujetador para vena de la cola sobre la bancada. Utilice una jeringa micrométrica para inyectar 100 microlitros de células tumorales en la vena lateral de la cola. Utilice una técnica séptica para evitar infecciones tras la inyección.

Aplicar una ligera presión en el sitio de inyección hasta que deje de sangrar. Devolver el ratón a la jaula y permitir que el tumor crezca hasta la etapa deseada. El día de la transferencia, pipetear hacia arriba y hacia abajo para resuspender los linfocitos T citotóxicos purificados o CTL preparados.

Como se describe en el texto, transfiera todas las células de una placa a un tubo cónico de 15 mililitros, sin permitir que el volumen supere los dos tercios del tubo. Introduzca una pipeta Pasteur estéril en el tubo cónico y estratifique el medio de separación de linfocitos o LSM bajo las células hasta que el volumen total se acerque a 14 mililitros.

Tenga cuidado de no perturbar las capas. Centrifugue a 2000 RPM durante 20 minutos a temperatura ambiente. No utilice el freno para detener el rotor después de la centrifugación; transfiera los CTL a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.

Añada HBSS hasta un volumen de aproximadamente 10 mililitros. Para lavar. Cuente las células y centrifugue a 1300 RPM durante cinco minutos. A temperatura ambiente, re suspenda en HBSS hasta la densidad celular requerida para las inyecciones.

Manteniendo el volumen total por inyección en 100 microlitros. Utilice la misma técnica de inyección en la cola que se mostró anteriormente en este video. Para inyectar los LTC en ratones con tumor, devuelva el ratón a la jaula y permita que los LTC interactúen con el tumor.

Los ratones suelen sacrificarse para su análisis entre 14 y 21 días después del tratamiento con CTL. Para visualizar las metástasis pulmonares, coloque un ratón sacrificado sobre su espalda en una tabla de espuma de poliestireno. Sujete las patas con alfileres para garantizar un acceso ininterrumpido a la tráquea.

Rocíe la cara ventral con etanol al 70 % comenzando desde el abdomen medio. Utilice tijeras para cortar a lo largo de la línea media a través de la caja torácica y hacia arriba en dirección a las glándulas salivales. Exponga la tráquea.

Utilice pinzas para retirar los tejidos que rodean la tráquea. Pase la punta de un pipeta de 200 microlitros por debajo de la tráquea, sosteniendo la punta con una mano. Levante suavemente la tráquea hacia arriba y alejándola del cuerpo.

Gire la plataforma 180 grados. Utilice una jeringa de 50 mililitros para inyectar tinta de India en los pulmones a través de la tráquea. Infle completamente los pulmones con tinta hasta sentir una resistencia fuerte.

Utilice tijeras para cortar la tráquea. Deslice un par de pinzas debajo de los pulmones y levántelos fuera del ratón. Enjuague los pulmones brevemente en un vaso de precipitados de un litro con agua en una campana extractora química.

Transfiera los pulmones a una instalación de vidrio que contenga cinco mililitros de solución FTI. El tejido tumoral aparecerá como nódulos blancos sobre los pulmones oscuros. Después de unos minutos, los tumores ya pueden contarse y almacenarse en solución FTI indefinidamente aquí.

Pulmones de ratones transfectados con carcinoma mamario. La línea celular cuatro T uno muestra manchas blancas que indican tumores. Los ratones transfectados con un inmunosupresor dominante de IRF ocho frente a K 79 E muestran el potencial metastásico aumentado de las células tumorales.

Estas imágenes muestran un análisis histológico de la eficacia de la inmunoterapia mediante transferencia adoptiva de linfocitos T citotóxicos. Los ratones con tumores inyectados con solución salina mostraron múltiples tumores seis días después, indicados por flechas. Por otro lado, los ratones inyectados con linfocitos T específicos contra el tumor mostraron una reducción de los tumores en el mismo experimento.

El tratamiento con tinta china ofrece una manera más sencilla de medir la eficacia de la transferencia adoptiva de linfocitos T citotóxicos (CTL). Aquí, los nódulos tumorales blancos en los pulmones con tumores los distinguen claramente de los pulmones que han recibido con éxito la transferencia adoptiva de CTL, y el conteo de los nódulos permite un grado de cuantificación que no es posible con la histología. Al realizar este procedimiento, es importante recordar calentar a los ratones para facilitar inyecciones más precisas en la vena de la cola.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la eficacia del tratamiento mediante este procedimiento sencillo para cuantificar el tamaño y el número de tumores. Gracias por verlo y buena suerte con sus experimentos.