Name: La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-26T15:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprende a evaluar la eficacia de la inmunoterapia con linfocitos T citotóxicos en un modelo de metástasis pulmonar en ratones. Este método permite visualizar y cuantificar los nódulos tumorales para analizar resultados terapéuticos.

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Apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (CA133085 a KL) y la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-09-209-01-TBG KL).

1. Metástasis modelo experimental de ratón <ol><li> El día antes de la inyección de células tumorales, las semillas de un frasco T75 con un máximo de 1 x 10 7 CMS4-Met células en 10 ml de medio RPMI con 10% de suero para obtener rápido crecimiento de las células tumorales. Incubar toda la noche a 37 ° C. </li><li> En el día de la inyección, se elimina el medio y lavar las células una vez con PBS, luego de la cosecha de las células tumorales con el 0,05% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5 minutos. Detener la reacción con 10 ml de medio RPMI con 10% de suero. La transferencia de células a un tubo cónico. </li><li> Centrifugar las células a 1300 rpm en una centrífuga Sorvall Legend TA durante 3 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante. Resuspender las células en 10 ml de 1X HBSS fresca para lavar, y luego girar de nuevo y volver a suspender la misma manera. </li><li> Contar con las células tumorales en un hemocitómetro. Diluir las células en HBSS, para que las células necesarias para cada inyección se resuspenden en un volumen total de 100 mL. </li><li> Caliente las 6-8 semanas de edad ratones Balb / c en un vaso sumergido en agua caliente para dilatar la vena de la cola. Coloque el ratón sobre un limitador de vena de la cola en el banco. El uso de una microjeringa para inyectar 100 L de células tumorales en la vena lateral de la cola. Utilice una técnica aséptica para evitar la infección. Después de la inyección, aplicar una ligera presión al sitio de la inyección hasta que la hemorragia se ha detenido. </li><li> Devolver el ratón de la jaula, y permitir el crecimiento del tumor a la etapa deseada. </li></ol> 2. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) Inmunoterapia transferencia adoptiva <ol><li> En el día de la transferencia, la pipeta hacia arriba y abajo para volver a suspender citotóxica de los linfocitos T purificados, o CTL, preparado como se describe en el texto. La transferencia de todas las células de una placa a un tubo cónico de 15 ml, no dejar que el volumen exceda de más de 2 / 3 del tubo. </li><li> Inserte una pipeta Pasteur estéril en el tubo cónico y laicos medio de separación de linfocitos, o LSM, en las células hasta que el volumen total se acerca a 14 ml. </li><li> Tenga cuidado de no molestar a las capas. Centrifugar a 2000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. No use el freno para frenar el rotor tras hacer un trompo. </li><li> Transferir el CTL para un nuevo tubo de 15 mL cónico. Añadir HBSS a un volumen de aproximadamente 10 ml de lavar. </li><li> Contar las células. Centrifugar a 1300 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Volver a suspender en HBSS a la densidad celular necesaria para la inyección, manteniendo el volumen total por la inyección de 100 mL. </li><li> Utilice la técnica de inyección de cola igual que vimos anteriormente en este vídeo para inyectar el CTL en ratones portadores de tumores. </li><li> Devolver el ratón de la jaula, y permitir que el CTL para interactuar con el tumor. Los ratones suelen ser sacrificados para el análisis de 14-21 días después del tratamiento CTL. </li></ol> 3. Visualización de las metástasis pulmonares <ol><li> Para visualizar las metástasis pulmonares, lugar de un ratón sacrificado en su parte posterior en una tabla de espuma de poliestireno. Pin de las piernas para garantizar el acceso sin obstáculos a la tráquea. Rocíe la parte ventral con el 70% de etanol. </li><li> A partir de la mitad del abdomen, use tijeras para cortar a lo largo de la línea media, a través de la caja torácica, y hasta a las glándulas salivales. Exponer la tráquea. El uso de fórceps para extraer los tejidos que rodean la tráquea. </li><li> Enhebrar una punta de pipeta 200 l por debajo de la tráquea. Sujetando la punta con una mano, levante suavemente la tráquea y del cuerpo. </li><li> Gire la plataforma 180 º. Use una jeringa de 50 ml para inyectar tinta china en los pulmones a través de la tráquea. Inflar los pulmones por completo con tinta hasta que sienta una fuerte resistencia. </li><li> Use las tijeras para cortar la tráquea. Deslizar un par de pinzas en los pulmones y sacarlos del ratón. Enjuague los pulmones brevemente en un vaso de 1 litro de agua. </li><li> En una cabina de humos química, la transferencia de los pulmones a un vial de centelleo de vidrio que contiene 5 ml de solución de Fekete. El tejido del tumor va a surgir como nódulos blancos en los pulmones negro después de unos minutos. Los tumores pueden ahora ser contados y almacenados en una solución de Fekete de forma indefinida. </li></ol> 4. Las metástasis en los pulmones representante visualizados <ol><li> Aquí, los pulmones de los ratones que fueron inyectados con carcinoma mamario 4T1 línea celular muestran manchas blancas que indican los tumores. Los ratones que fueron inyectados con células 4T1 transfectadas con un IRF8 dominante negativo K79E mutantes muestran el mayor potencial metastásico de las células tumorales. </li><li> Estas imágenes muestran un análisis histológico de la eficacia de la inmunoterapia CTL transferencia adoptiva. Portadores de tumores de ratones inyectados con solución salina mostró múltiples tumores 6 días más tarde, indicado por las flechas amarillas (A). Los ratones inyectados con células T específicas del tumor, por su parte, mostró una reducción de los tumores (B). </li><li> En el mismo experimento, el tratamiento de la tinta china ofrece una manera más sencilla de medir la eficacia de la transferencia adoptiva CTL. Aquí, los nódulos tumorales en blanco con tumores pulmones distinguirlos claramente de los pulmones que han superado con éxito la transferencia adoptiva CTL, y contando los nódulos permite un gradode cuantificación no es posible con la histología. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Plan experimental para la metástasis de tumores experimentales y la transferencia de adaptación CTL modelo murino de inmunoterapia. Los puntos rojos indican las células tumorales y puntos verdes indican CTL. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. La alteración de la función IRF8 aumentado el potencial metastásico de las células tumorales. Carcinoma mamario de ratón 4T1 línea celular se transfectadas establemente con el vector (4T1.Vector) o vector de expresión de un IRF8 dominante negativo mutante K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). Las células tumorales se inyectaron en las venas iv lateral de la cola del ratón. Portadores del tumor pulmones se inflaron con tinta china para visualizar los nódulos tumorales. Nódulos tumorales son fácilmente visibles como manchas blancas sobre el fondo negro del tejido pulmonar. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. El análisis histológico de eficacia de la inmunoterapia CTL transferencia adoptiva. Sarcoma de ratón línea celular CMS4-Met fue inyectado en las venas del ratón iv lateral de la cola. Tres días más tarde, la solución salina (A) o un tumor específico de células T (B) se inyectaron en los ratones portadores de tumores. Los pulmones se analizaron seis días después del tratamiento CTL mediante la tinción H &amp; E convencional histológico. Nódulos tumorales se indican con flechas. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Visualización de los nódulos tumorales por la inflación tinta china. Sarcoma de ratón línea celular CMS4-Met fue inyectado en las venas del ratón iv lateral de la cola. Tres días más tarde, la solución salina (control) o un tumor específico de células T (+ CTL) fueron inyectadas en los ratones portadores de tumores. Los pulmones se analizaron catorce días después del tratamiento CTL. Las manchas blancas, que son los nódulos tumorales, permite una sencilla cuantificación de la eficacia del tratamiento CTL.

<ol><li>Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+extensive+pulmonary+metastases+in+mice+by+adoptive+transfer+of+antigen-specific+CD8%28%2B%29+CTL+reactive+against+tumor+cells+expressing+a+naturally+occurring+rejection+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope.</a> J Immunol. 167 (8), 4286-4292 (2001).</li>
<li>Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fas%2FFas+ligand+pathway+is+important+for+optimal+tumor+regression+in+a+mouse+model+of+CTL+adoptive+immunotherapy+of+experimental+CMS4+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases.</a> J Immunol. 171 (5), 2402-2412 (2003).</li>
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<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+experimental+pulmonary+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of experimental pulmonary metastases.</a> Journal of the National Cancer Institute. 36 (4), 641-645 (1966).</li>
</ol>

Los ratones fueron adquiridos por el Instituto Nacional del Cáncer (Friderick, MD) y ubicado en la Facultad de Medicina de la instalación para animales Georgia. Los experimentos y la atención / bienestar estaban de acuerdo con las regulaciones federales y un protocolo aprobado por el Colegio Médico de Georgia IACUC comité.

Soluciones: India Solución de tinta (17): <ol><li> Vierta 150 ml de agua destilada en un matraz de 250 ml. </li><li> Añadir 4 gotas de hidróxido de amonio en el agua destilada. </li><li> Añadir 30 ml de tinta India de acciones (es decir, Sanford Negro Magic dibujo de la tinta a prueba de agua Artículo 44 011 4465) a la mezcla de amoniaco y agua. </li><li> Complete con agua destilada hasta un volumen de 200 ml. Solución está lista para la inyección. </li></ol> Solución de Fekete (17): Fekete solución se utiliza para blanquear la tinta china-inflados con tumores pulmones para distinguir nódulos blancos tumorales del fondo negro de los tejidos normales. <ol><li> Añadir 350 ml de EtOH 95% de botella de vidrio de 1L. </li><li> Añadir 150 ml de agua destilada </li><li> Añadir 50 ml de formaldehído </li><li> Añadir 25 ml de ácido ácido glacial </li></ol>

la metástasis experimentales y ctl modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Modelo experimental de ratón metástasis es un modelo de metástasis simple y fisiológicamente relevantes. Las células tumorales se inyectan por vía intravenosa (iv) en las venas de la cola de ratón y colonizar en los pulmones, por lo tanto, semejante a los últimos pasos de la metástasis de células tumorales espontáneas: la supervivencia en la circulación, la extravasación y la colonización en los órganos distales. Desde el punto de vista terapéutico, el modelo experimental de metástasis es el modelo más simple y es ideal ya que el objetivo de las terapias es a menudo el punto final de la metástasis: tumor metastásico establecido en el órgano distal. En este modelo, las células tumorales se inyectan en las venas iv cola de ratón y se deja colonizar y crecer en los pulmones. Tumor-específica CTL se inyecta vía intravenosa en el ratón portador de metástasis. El número y tamaño de las metástasis pulmonares pueden ser controlados por el número de células tumorales a inyectar y el tiempo de crecimiento del tumor. Por lo tanto, las distintas etapas de la metástasis, las metástasis mínima a la metástasis extensa, se puede modelar. Las metástasis pulmonares son analizados por la inflación con la tinta, permitiendo así más fácil la observación visual y la cuantificación.

Una metástasis de pulmón y el modelo experimental de ratón para CTL inmunoterapia análisis de la interacción de las células tumorales las células-T<em&gt; In vivo</em&gt;.

La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

El modelo de ratón de metástasis experimental es un modelo de metástasis sencillo y, al mismo tiempo, fisiológicamente relevante. Las células tumorales se inyectan por vía intravenosa (i.v.) en ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar la eficacia de la inmunoterapia con transferencia adoptiva de linfocitos T específicos del tumor in vivo. Primero, esto se logra trasplantando células tumorales mediante inyección en la vena caudal lateral a los ratones, con el fin de establecer metástasis pulmonares. El segundo paso del procedimiento consiste en tratar a los ratones con tumor mediante linfocitos T citotóxicos específicos del tumor (CTLs).El paso final consiste en utilizar tinta china como medio para visualizar y cuantificar los nódulos tumorales. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren el CIE de diferentes tratamientos mediante la medición del tamaño del tumor y la cuantificación del número de nódulos tumorales. Hola, me llamo Mary Zimmerman y soy miembro del laboratorio del Dr. Kevin Lu en la Facultad de Medicina de Georgia.Hola, mi nombre es Shelene Hu. Soy estudiante de segundo año y también trabajo en el laboratorio del Dr. Lou. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos tradicionales, como las curvas de supervivencia, es que este procedimiento es cualitativo y cuantitativo. Las implicaciones de la técnica podrían extenderse hacia la terapia contra el cáncer, ya que simula la inmunoterapia adoptiva con linfocitos T en pacientes humanos con cáncer.Así que comencemos. El día anterior a las inyecciones de células tumorales, siembre un matraz T-75 con hasta uno por diez a la séptima de células CMS cuatro met en 10 mililitros de medio RPMI que contenga 10% de suero. Para obtener células tumorales de crecimiento rápido, incube durante la noche a 37 grados Celsius el día de la inyección.Retire el medio y lave las células una vez con PBS, luego recoga las células tumorales con tripsina-EDTA al 0,05 % a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Detenga la reacción con 10 mililitros de medio RPMI que contenga 10 % de suero. Transfiera las células a un tubo cónico.Centrifugar las células a 1300 RPM en una centrífuga val legend RT durante tres minutos. A temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante, resuspender las células en 10 mililitros de HBSS 1X fresco para lavar. Luego centrifugar nuevamente y resuspender de la misma manera.Contar las células tumorales en un hemocitómetro. Diluir las células en HBSS de modo que las células necesarias para cada inyección queden resuspendidas. En un volumen total de 100 microlitros, calentar los ratones B SEA de seis a ocho semanas de edad en un vaso de precipitados sumergido en agua tibia.Para dilatar la vena de la cola, coloque el ratón en un sujetador para vena de la cola sobre el banco. Utilice una jeringa micrométrica para inyectar 100 microlitros de células tumorales en la vena lateral de la cola. Utilice una técnica séptica para evitar infecciones tras la inyección.Aplicar una ligera presión en el sitio de inyección hasta que deje de sangrar. Devolver el ratón a la jaula y permitir que el tumor crezca hasta la etapa deseada. El día de la transferencia, pipetear hacia arriba y hacia abajo para resuspender los linfocitos T citotóxicos purificados o CTL preparados.Como se describe en el texto, transfiera todas las células de una placa a un tubo cónico de 15 mililitros, sin permitir que el volumen supere los dos tercios del tubo. Introduzca una pipeta Pasteur estéril en el tubo cónico y estratifique el medio de separación de linfocitos o LSM bajo las células hasta que el volumen total se acerque a 14 mililitros.Tenga cuidado de no perturbar las capas. Centrifugue a 2000 RPM durante 20 minutos a temperatura ambiente. No utilice el freno para detener el rotor después de la centrifugación; transfiera los CTL a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.Añada HBSS hasta un volumen de aproximadamente 10 mililitros. Para lavar. Cuente las células y centrifugue a 1300 RPM durante cinco minutos. A temperatura ambiente, re suspenda en HBSS hasta la densidad celular requerida para las inyecciones.Manteniendo el volumen total por inyección en 100 microlitros. Utilice la misma técnica de inyección en la cola que se mostró anteriormente en este video. Para inyectar los CTL en ratones con tumor, devuelva el ratón a la jaula y permita que los CTL interactúen con el tumor.Los ratones suelen sacrificarse para su análisis entre 14 y 21 días después del tratamiento con CTL. Para visualizar las metástasis pulmonares, coloque un ratón sacrificado sobre su espalda en una tabla de espuma de poliestireno. Sujete las patas con alfileres para garantizar un acceso sin obstáculos a la tráquea.Rocíe la cara ventral con etanol al 70 % comenzando desde el abdomen medio. Use tijeras para cortar a lo largo de la línea media a través de la caja torácica y hacia arriba en dirección a las glándulas salivales. Exponga la tráquea.Utilice pinzas para retirar los tejidos que rodean la tráquea. Pase la punta de un pipeta de 200 microlitros por debajo de la tráquea, sosteniendo la punta con una mano. Levante suavemente la tráquea hacia arriba y alejándola del cuerpo.Gire la plataforma 180 grados. Utilice una jeringa de 50 mililitros para inyectar tinta de India en los pulmones a través de la tráquea. Infle completamente los pulmones con tinta hasta que sienta una resistencia fuerte.Use tijeras para cortar la tráquea. Deslice un par de pinzas debajo de los pulmones y extráigalos del ratón. Enjuague brevemente los pulmones en un vaso de precipitados de un litro con agua dentro de una campana extractora química.Transfiera los pulmones a una instalación de vidrio que contenga cinco mililitros de solución FTI. El tejido tumoral aparecerá como nódulos blancos sobre los pulmones oscuros. Después de unos minutos, los tumores ya pueden contarse y conservarse indefinidamente en la solución FTI. Aquí.Pulmones de ratones transfectados con carcinoma mamario. La línea celular cuatro T uno muestra manchas blancas que indican tumores. Los ratones transfectados con un inmunosupresor dominante de IRF ocho frente a K 79 E muestran el potencial metastásico aumentado de las células tumorales.Estas imágenes muestran un análisis histológico de la eficacia de la inmunoterapia mediante transferencia adoptiva de linfocitos T citotóxicos. Los ratones con tumores inyectados con solución salina mostraron múltiples tumores seis días después, indicados por flechas. Por otro lado, los ratones inyectados con linfocitos T específicos contra el tumor mostraron una reducción de los tumores en el mismo experimento.El tratamiento con tinta de la India ofrece una manera más sencilla de medir la eficacia de la transferencia adoptiva de linfocitos T citotóxicos (CTL). Aquí, los nódulos tumorales blancos en los pulmones con tumores los distinguen claramente de los pulmones que han recibido con éxito la transferencia adoptiva de CTL, y el conteo de los nódulos permite un grado de cuantificación que no es posible con la histología. Al realizar este procedimiento, es importante recordar calentar a los ratones para facilitar inyecciones más precisas en la vena de la cola.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la eficacia del tratamiento mediante este sencillo procedimiento para cuantificar el tamaño y el número de tumores. Gracias por verlo y buena suerte con sus experimentos.

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Aquí, describimos un modelo de xenoinjerto murino que se asemeja funcionalmente a un reservorio de Ommaya en pacientes. Desarrollamos el Ommaya murino para estudiar nuevas terapias para la enfermedad leptomeningeal universalmente fatal.

Un modelo de xenoinjerto murino de Ommaya para estudiar la terapia dirigida directamente de la enfermedad leptomeningeal

Aquí, presentamos un protocolo de trasplante tumoral para la caracterización de linfocitos infiltrados tumorales inherentes y derivados de la periferia en un modelo de tumor de ratón. El rastreo específico de la afluencia de células inmunes derivadas del receptor con citometría de flujo revela la dinámica de los cambios fenotípicos y funcionales de estas células durante las respuestas inmunes antitumorales.

Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8+ infiltrantes de tumores en ratones

Este artículo describe un flujo de trabajo de técnicas empleadas para probar nuevos mediadores candidatos de metástasis de melanoma y sus mecanismos de acción.

Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma

El protocolo presenta un modelo de inmunoterapia contra el cáncer utilizando la vacunación tumoral basada en células con melanoma B16-F10 que expresa Flt3L. Este protocolo demuestra los procedimientos, incluida la preparación de células tumorales cultivadas, la implantación del tumor, la irradiación celular, la medición del crecimiento tumoral, el aislamiento de las células inmunitarias intratumorales y el análisis de citometría de flujo.

Modelo experimental de inmunoterapia de melanoma utilizando vacunación tumoral con una citocina hematopoyética

Este protocolo describe la implantación ortotópica de células cancerosas derivadas del paciente en la pared del ciego de ratones inmunodeficientes. El modelo recapitula la enfermedad metastásica del cáncer colorrectal avanzado y permite la evaluación de nuevos fármacos terapéuticos en un escenario clínicamente relevante de metástasis pulmonares y hepáticas.

La implantación ortotópica de células cancerosas derivadas de pacientes en ratones recapitula el cáncer colorrectal avanzado

El diseño experimental presentado aquí proporciona un modelo reproductivo útil para los estudios de células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de ganglios linfáticos (LN), que excluye la perturbación de las células T CD8+ espectadoras.

Modelo de metástasis de ganglios linfáticos de drenaje para evaluar la dinámica de las células T CD8+ específicas del antígeno durante la tumorigénesis

Describimos un método para utilizar linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones a través de citometría de flujo para la transferencia de células adoptivas. Este protocolo tiene como objetivo verificar la citotoxicidad específica de los TIL contra tumores en un modelo de ratón de cáncer de páncreas singénico, proporcionando información sobre el desarrollo de terapias celulares adoptivas para el cáncer de páncreas.

Aislamiento basado en citometría de flujo y evaluación terapéutica de linfocitos infiltrantes tumorales en un modelo murino de cáncer de páncreas

Aprende a evaluar la eficacia de la inmunoterapia con linfocitos T citotóxicos en un modelo de metástasis pulmonar en ratones. Este método permite visualizar y cuantificar los nódulos tumorales para analizar resultados terapéuticos.

La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

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