La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

El objetivo general de este procedimiento es examinar la eficacia de la inmunoterapia de transferencia adoptiva de células T específicas para tumores in vivo. Esto se logra primero mediante el trasplante de células tumorales a través de la inyección lateral de la vena de la cola a los ratones para establecer metástasis pulmonares. El segundo paso del procedimiento es tratar a los ratones portadores de tumores con linfocitos T citotóxicos específicos del tumor CTL.

El paso final es utilizar la tinta china como medio para visualizar y cuantificar los nódulos tumorales. En definitiva, se pueden obtener resultados que muestran la CIE de diferentes tratamientos a través de la medición del tamaño tumoral y la cuantificación del número de nódulos tumorales. Hola, mi nombre es Mary Zimmerman y soy miembro del laboratorio del Dr. Kevin Lu en el Colegio Médico de Georgia.

Hola, mi nombre es Shelene Hu.Soy estudiante de segundo año y también estoy trabajando en el laboratorio del Dr. Lou. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos tradicionales como las curvas de supervivencia es que este procedimiento es tanto cualitativo como cuantitativo. La implicación de las técnicas puede extenderse hacia la terapia contra el cáncer porque imita la inmunoterapia adoptiva de células T en pacientes humanos con cáncer.

Así que comencemos: el día antes de las inyecciones de células tumorales, siembra un matraz T 75 con hasta una vez 10 al séptimo. CMS cuatro células met en 10 mililitros de medio RPMI que contiene 10% de suero. Para obtener células tumorales de crecimiento rápido, las células se incuban durante la noche a 37 grados centígrados el día de la inyección.

Retire el medio y enjuague las células una vez con PBS, luego coseche las células tumorales con EDTA de tripsina al 0,05% a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Detenga la reacción con 10 mililitros de medio RPMI que contenga 10% de suero. Transfiera las células a un tubo cónico.

Gire las celdas a 1300 RPM en una centrífuga val legend RT durante tres minutos. A temperatura ambiente, retire el snat, vuelva a suspender las células en 10 mililitros de uno fresco XHB Ss para lavar. A continuación, vuelve a girar y vuelve a suspender de la misma manera.

Cuente las células tumorales en un hemo. Citómetro. Diluya las células en HBSS para que se vuelvan a suspender las células necesarias para cada inyección. En un volumen total de 100 microlitros, caliente a los ratones B SEA de seis a ocho semanas de edad en un vaso de precipitados, sumergidos en agua tibia.

Para dilatar la vena de la cola, coloque al ratón en un sujetador de venas de la cola en el banco. Use una jeringa de micros para inyectar 100 microlitros de células tumorales en la vena lateral de la cola. Use una técnica séptica para evitar la infección después de la inyección.

Aplique una ligera presión en el lugar de la inyección hasta que se detenga el sangrado. Regrese el ratón a la jaula y permita que el tumor crezca hasta la etapa deseada. El día de la transferencia, pipetear hacia arriba y hacia abajo para resuspender los linfocitos T citotóxicos purificados o CTL preparados.

Como se describe en el texto, transfiera todas las células de una placa a un tubo cónico de 15 mililitros, sin dejar que el volumen exceda más de dos tercios del tubo. Inserte una pipeta Pasteur estéril en el tubo cónico y separe los linfocitos en capas. Medio o LSM debajo de las celdas hasta que el volumen total se acerque a los 14 mililitros.

Tenga cuidado de no alterar las capas. Centrifugar a 2000 RPM durante 20 minutos a temperatura ambiente. No use el freno para reducir la velocidad del rotor después de girar, transfiera los CTL a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.

Agregue HBSS a un volumen de aproximadamente 10 mililitros. Lavar. Cuente las celdas, gire hacia abajo a 1300 RPM durante cinco minutos: A temperatura ambiente, vuelva a suspender un HBSS a la densidad celular requerida para las inyecciones.

Manteniendo el volumen total por inyección en 100 microlitros. Use la misma técnica de inyección de cola que se vio anteriormente en este video. Para inyectar las CTL en ratones portadores de tumores, devuelva el ratón a la jaula y permita que las CTL interactúen con el tumor.

Los ratones generalmente se sacrifican para el análisis de 14 a 21 días después del tratamiento con CTL. Para visualizar las metástasis pulmonares, coloque un ratón sacrificado boca arriba sobre una tabla de espuma de poliestireno. Sujete las patas con alfileres para asegurar un acceso sin obstrucciones a la tráquea.

Rocíe el lado ventral con etanol al 70% comenzando desde la parte media del abdomen. Use tijeras para cortar a lo largo de la línea media a través de la caja torácica y hacia las glándulas salivales. Exponga la tráquea.

Use fórceps para extraer los tejidos que rodean la tráquea. Pase una punta de pipeta de 200 microlitros por debajo de la tráquea, sujetándola con una mano. Levante suavemente la tráquea hacia arriba y lejos del cuerpo.

Gira la plataforma 180 grados. Use una jeringa de 50 mililitros para inyectar tinta china en los pulmones a través de la tráquea. Infla completamente los pulmones con tinta hasta que sientas una fuerte resistencia.

Usa unas tijeras para cortar la tráquea. Deslice un par de pinzas debajo de los pulmones y levántelos fuera del ratón. Enjuague los pulmones brevemente en un vaso de precipitados de un litro de agua en una campana de gases químicos.

Transfiera los pulmones a una instalación de vidrio de bilis que contenga cinco mililitros de solución de FTI. El tejido tumoral emergerá como nódulos blancos en los pulmones negros. Después de unos minutos, los tumores ahora se pueden contar y comenzar en la solución FTI indefinidamente. Aquí.

Pulmones para ratones transfectados con carcinoma mamario. La línea celular cuatro T uno muestra manchas blancas que indican tumores. Los ratones transfectados con un IRF ocho negativo dominante inmune a K 79 E muestran el mayor potencial metastásico de las células tumorales.

Estas imágenes muestran un análisis histológico de la eficacia de la inmunoterapia de transferencia adoptiva de CTL. Los ratones portadores de tumores inyectados con solución salina mostraron múltiples tumores seis días después indicados por flechas. Por otro lado, los ratones inyectados con células T específicas de tumores mostraron una reducción de tumores en el mismo experimento.

El tratamiento con tinta china proporciona una forma más sencilla de medir la eficacia de la transferencia adoptiva de CTL. En este caso, los nódulos tumorales blancos de los pulmones portadores de tumores los distinguen claramente de los pulmones que se han sometido con éxito a la transferencia adoptiva de CTL, y el recuento de los nódulos permite un grado de cuantificación que no es posible con la histología. Al intentar este procedimiento, es importante recordar calentar a los ratones para que las inyecciones de las venas de la cola sean más fáciles y precisas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la eficacia del tratamiento a través de este sencillo procedimiento para cuantificar el tamaño y el número de tumores. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.